PLOS ONE: desacetilase de histona HDAC4 Promove células de câncer gástrico SGC-7901 Progressão via Repressão p21

Abstract

O câncer gástrico (GC) é uma das principais causas de morte por câncer no mundo. O papel da histona desacetilase 4 (HDAC4) em tipos de células e tecidos específicos foi identificado. No entanto, os seus papéis biológicos no desenvolvimento do cancro gástrico permanece largamente inexplorado. Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) e Western blot foram utilizados para analisar a expressão de HDAC4 nas amostras clínicas. siRNA e sobre-expressão de p21 HDAC4 e siRNA foram usadas para estudar os efeitos funcionais de proliferação, uma formação de colónias, uma adenosina 5'-trifosfato (ATP) e ensaio de espécies reactivas de oxigénio (ROS) geração, do ciclo celular, as taxas de apoptose celular, e autofagia ensaios. HDAC4 foi regulado para cima em tecidos de cancro gástrico e várias linhas celulares de cancro gástrico. A proliferação, capacidade de formação de colónia e nível de ATP foram reforçadas em células SGC-7901 HDAC4 superexpressão, mas inibido em HDAC4 knockdown células SGC-7901. HDAC4 knockdown levou à prisão de células G0 /G1 fase e causou apoptose e aumento ROS. Além disso, HDAC4 foi encontrado para inibir a expressão da p21 em células SGC-7901 de câncer gástrico. p21 knockdown atenuou dramaticamente a inibição da proliferação celular, ciclo celular, promoção da apoptose celular e autofagia up-regulação no HDAC4-siRNA células SGC-7901. Nós demonstramos que HDAC4 promove a progressão de células de câncer gástrico mediada através da repressão da p21. Os nossos resultados fornecem uma base experimental para a compreensão do mecanismo de pró-tumoral de HDAC4 como tratamento para o cancro gástrico

citação:. Kang Z-H, Wang, C-Y, Zhang W-G, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) desacetilase de histona HDAC4 Promove câncer gástrico SGC-7901 Células Progressão via Repressão p21. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10.1371 /journal.pone.0098894

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China

Recebido: 12 de fevereiro de 2014; Aceito: 08 de maio de 2014; Publicação: 04 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Departamento de Saúde da Província de Jilin (No. 2012z119). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é a quarta neoplasia maligna mais comum ea segunda causa de morte por câncer em todo o mundo [1]. países asiáticos e sul-americanos têm uma taxa de incidência mais elevada de GC do que os Estados e Europa Ocidental United [2]. terapias mais específicos no factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) em indicações relacionadas GC avançada. Os compostos contra novos alvos, tais como mTOR [3], (receptor do factor de crescimento de hepatócitos) c-Met [4], e HDAC, estão também sob investigação.

4 da desacetilase de histona (HDAC4), que é uma classe IIa de HDAC, é conhecida por existir em complexos de co-repressor de transcrição distintos. HDAC4 é um componente crítico da via de resposta a danos no ADN que actua através 53BP1 [5]. HDAC4 reprime a expressão da p21 inibidor de quinase dependente de ciclina (também conhecido como p21WAF1 /Cip1) em células cancerosas humanas por meio de um mecanismo dependente de SP1, independente de p53 [6]. HDAC4 promove o crescimento de células cancerígenas do cólon através de repressão de p21 [7]. Inactivação de HDAC4 pelo pequeno RNA de interferência ou inibidores de HDAC suprime a morte celular neuronal [8].

O papel da HDAC4 em células específicas (células HeLa (câncer cervical), U373 (glioma), OVCAR (ovário), T98G ( glioma), HCT116 (colorretal), NHA (astrócitos) e SKBR3 (peito)) e tecidos (córtex cerebral, testículos, próstata e da camada epidérmica da pele) está se tornando mais clara [9]. No entanto, não foi determinado o mecanismo exato de HDAC4 no câncer gástrico. Por conseguinte, o objectivo deste estudo foi o primeiro a avaliar os níveis de expressão HDAC4 em tecidos de cancro gástrico e linhas celulares humanas. Em segundo lugar, o efeito de HDAC4 em linhas celulares de cancro gástrico foi examinada utilizando a sobre-expressão e knockdown. Finalmente, nós investigamos se HDAC4 teve um relacionamento com p21 em células cancerosas gástricas. Juntos, o nosso objectivo era encontrar se HDAC4 tem um papel biológico no desenvolvimento de GC e para elucidar o mecanismo subjacente.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

Vinte e nove emparelhado tecidos de carcinoma gástrico primários e tecidos gástricos normais distantes foram coletadas de pacientes (idade: 58,46 ± 9,17 anos), durante a cirurgia terapêutica de rotina no Departamento de cirurgia Gastrointestinal, o primeiro hospital da Universidade de Jilin. Todas as amostras foram obtidas com o consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinki e aprovado pelo Comitê de Ética Humana da Primeira Hospital da Universidade de Jilin e da Universidade de Jilin, PR China. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

As linhas celulares e cultura

As linhas celulares de cancro gástrico humano SGC-7901, AGS e BGC-823 e a linha de células do epitélio gástrico normal de GES foram obtido a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em meio RPMI 1640 com soro fetal bovino a 10%, numa atmosfera humidificada de 5% de CO _{2 a 37 ° C.}

a linha celular transfectada estável e transiente transfecção

O fragmento HDAC4 de comprimento completo foi amplificado por PCR de transcrição reversa a partir de células GES utilizando os iniciadores específicos como previamente descrito [10] e inserido nos locais BamH I e Hind III de pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, Reino Unido). O pcDNA3.1 (+) - HDAC4 plasmídeo foi verificada por análise de sequência para confirmar a ausência de mutações. células SGC-7901 foram semeadas em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com pcDNA3.1 (+) - HDAC4 e pcDNA3.1 (+) - vectores, respectivamente, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante durante 24 h sem selecção de antibiótico. Em seguida, as células foram cultivadas em meio contendo 400 ug /ml de G418 (Sigma, St. Louis, MO) até que todas as células na cultura de controlo não transfectadas foram mortos.

células SGC-7901 foram semeadas em placas de 6 poços e, em seguida, transfectadas com ARNsi não segmentação ou ARNsi dirigido contra HDAC4 humano ou p21 (Santa Cruz), utilizando Lipofectamine 2000 de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Estiramento experiências foram realizadas em células de 48 ou 72 h pós-transfecção.

isolamento de RNA e PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR)

O ARN total foi isolado a partir de tecidos ou células de reagente TRIzol ( Invitrogen), e transcrição inversa foram realizadas utilizando o estojo de PCR de ARN Takara (Takara, Dalian, China) seguindo as instruções do fabricante. Quantitative PCR foi realizada utilizando um SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japão) em um sistema de PCR em tempo real (Eppendorf, Alemanha). O rácio de expressão relativa em cada tecido tumoral e não tumoral emparelhado foi calculado pela ^{método -ΔΔCT 2.}

contagem celular kit-8 (CCK-8) ensaio

As proliferações das células SGC-7901 foram avaliados utilizando um ensaio CCK-8 (Beyotime, Jiangsu, China) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Resumidamente, as células foram cultivadas numa placa de 96 poços a uma concentração de 2000 células por poço. Aos 0, 1, 2 e 3 dias após a transfecção, o ensaio de proliferação celular foi realizada por adição de 10 ul de solução de CCK8 a cada poço, seguido de incubação a 37 ° C durante 2 h. A absorvância foi medida por um leitor ELISA a um comprimento de onda de 450 nm.

Colónia ensaio de formação de

Resumidamente, as células SGC-7901 HDAC4 que sobre-expressam e -knockdown foram semeadas em triplicado (1.000 células por 60 milímetros prato de cultura) e incubou-se a 37 ° C durante duas semanas de modo a formar clones. As células foram lavadas com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 15 min, e coradas com violeta de cristal (0,5% de violeta cristal, 1% de paraformaldeído e 20% de metanol em PBS) durante 30 min. As colónias em cada placa foram contadas, e a sobrevivência celular foi expresso como uma percentagem do número de colónias sobreviventes nas placas de controlo.

ciclo celular análise

As células foram colhidas e ressuspensas suavemente em As suspensões de células únicas de células activadas de fluorescência (FACS) de tampão (PBS contendo 2% de FBS). As células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas em etanol frio durante a noite a 70%. As células foram então lavadas duas vezes com PBS frio, ressuspensas em solução de RNase A e incubados durante 30 min a 4 ° C. A suspensão foi adicionada a 0,05 mg /ml de iodeto de propídio (Beyotime) seguido de incubação a 4 ° C durante 30 min e análise usando FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

apoptose celular ensaio

Propidiumiodide (PI, 1 ug /ml) e anexina V-FITC (1 ug /ml) foram usadas para a determinação da apoptose celular. Resumidamente, as células foram tratadas com tripsina e incubadas com PI e Anexina V-FITC durante 15 minutos a 37 ° C. As amostras foram detectadas utilizando um citómetro de fluxo FACS Calibur. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

intracelular de adenosina 5'-trifosfato (ATP), os níveis de ensaio

os níveis intracelulares de ATP foram ensaiados usando a bioluminescência [11]. Resumidamente, as células foram submetidas a lise e centrifugada a 15.000 g durante cerca de 10 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram, em seguida, misturado com uma solução de trabalho de ATP mistura ensaio (Sigma), e a quantidade de luz emitida foi imediatamente medida com um luminómetro (Luminoskan Ascent da Thermo Scientific, Walthan, MA). Os dados foram normalizados por luminescência os valores de amostra de proteína (medido utilizando um ensaio BCA).

espécies reactivas de oxigénio (ROS) medição

A geração de ROS intracelular foi analisada utilizando 6-carboxi-2 ' , 7'-diclorofluoresceína diacetato (H _{2DCFDA). Resumidamente, 5 x 10 ^{4 células foram plaqueadas em placas de 60 mm e deixadas a aderir durante a noite. As células foram coradas com 5 ^ M H 2DCFDA durante 30 min a 37 ° C e, em seguida, recolhidas, e a fluorescência foi analisada com um espectrómetro de fluorescência (Flex StationII 384, Molecular Devices) a 485 nm (excitação) e 538 nm ( emissão). níveis de oxidantes celulares foram expressos como fluorescência DCF relativo por quantidades de proteína de amostra (método BCA). Em algumas experiências, as células foram pré-tratadas com 10 mM de N
-acetylcysteine ​​(NAC) antes da análise de geração de ROS.}}

análise Western blot

As células foram lisadas em IP tampão de lise (Beyotime), desnaturado durante 10 min a 95 ° C, cortado com uma seringa de insulina, e resolvidas em geles de SDS /PAGE. Depois de imunotransferência, as membranas foram bloqueadas e incubadas com anticorpos primários em PBS /0,1% de Tween-20 com leite seco sem gordura 5%. Os anticorpos dirigidos contra HDAC4, p21, LC3, beclin 1, Atg 7, caspase 3, 9, Bcl-2, Bax e anti-β-actina foram todos adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). detecção quimioluminescente foi testada usando um kit de detecção ECL (Pierce, Rockford, IL, EUA). Os resultados foram analisados ​​usando o software Quantity One para obter a razão de densidade óptica da proteína alvo para p-actina.

Imunofluorescência

As células foram plaqueadas em lamelas, fixadas com paraformaldeído a 4% (Sigma- Aldrich) durante 10 min e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 /PBS. As células foram bloqueadas com BSA a 1% durante 1 h, seguido de incubação durante a noite a 4 ° C com o anticorpo anti-LC3, e, em seguida, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com FITC (Beyotime) durante 1 h. Os núcleos foram coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; Sigma). A imagiologia de fluorescência foi visualizado usando um microscópio confocal de varrimento a laser (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

A análise estatística

Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes. Os dados são apresentados como a média ± S.E.M. A significância estatística foi calculada por análise unidireccional da variância (ANOVA) ou pelo teste t de Student entre os dois grupos utilizando o GraphPad Prism 5 software estatístico. P
valores <. 0,05 foram considerados significativos

Resultados

expressão HDAC4 foram regulados positivamente em tecidos com câncer gástrico e linhas celulares

Em primeiro lugar, expressão HDAC4 analisados ​​em vinte e nove emparelhado cancro gástrico e tecidos não tumorais adjacentes por análise de qRT-PCR e western blot. Descobrimos que HDAC4 foi significativamente up-regulada no tecido gástrico carcinoma (Figuras 1A, B e C, ** P Art < 0,01, *** P Art < 0,001). Além disso, várias linhas celulares de cancro gástrico foram também analisadas. Observou-se maior expressão de HDAC4 em três linhas celulares de cancro gástrico (AGS, BGC-823 e SGC-7901), em comparação com uma linha normal gástrica células do epitélio (GES) (Figuras 1D e E, * P <
; 0,05, ** P Art < 0,01). Portanto, nossos resultados demonstraram que a expressão HDAC4 foram regulados positivamente em ambos os tecidos de câncer gástrico e linhas celulares.

A expressão HDAC4 foi down-ou-regulada no SGC-7901 células

Um sucesso pcDNA3.1 (+) vector de expressão foi usado para sobre-expressar em células HDAC4 SGC-7901, a fim de examinar a sua eficácia como um regulador de crescimento. Após a transfecção estável, a expressão de níveis de mRNA HDAC4 era mais abundante no pcDNA3.1 (+) - células HDAC4 do que nas células não transf ectadas ou um controlo negativo células SGC-7901 (NC) (Figura 2A, ** * P
. < 0,001), o que foi consistente com o resultado de análise de mancha de western (Figura 2B)

Para avaliar a eficácia-silenciamento do gene humano de HDAC4 siRNA, a extensão da expressão da proteína foi HDAC4 medido após HDAC4-siRNA transfecção e um período de incubação de 48 h na linha de células de câncer gástrico SGC-7901 humano. -PCR em tempo real A análise mostrou que a infecção HDAC4 siRNA resultou em 36,3% de knockdown níveis de mRNA HDAC4 (Figura 2C, *** P
< 0,001). A análise Western blot mostrou que a proteína HDAC4 foi significativamente reduzida (Figura 2D), consistente com a sua redução ARNm. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que HDAC4 siRNA poderia suprimir significativamente a expressão HDAC4 endógeno.

HDAC4 promoveu a proliferação celular ea formação de colônias

Em seguida, examinaram o efeito da HDAC4 no crescimento celular. A proliferação celular foi examinada utilizando células de contagem Kit-8 (CCK-8) nos pontos de tempo de 24, 48 e 72 h. As curvas de crescimento mostrou que quando HDAC4 foi sobre-expressão em células SGC-7901, o crescimento das células foi aumentado em 1,5 vezes em comparação com o grupo de controlo no dia 3 (Figura 3A, * P
< 0,05, ∧∧P
< 0,01). Além disso, o ensaio de formação de colónia apresentado um aumento dramático de duas vezes no número de colónia quando as células SGC-7901 foram transfectadas com pcDNA3.1 (+) - HDAC4 em relação ao grupo NC (Figuras 3B e C, ** P Art < 0,01)

Nós também examinou os efeitos de HDAC4 para baixo-regulação em células SGC-7901.. O ensaio de ensaio de formação de colónias e de CCK-8 mostrou que a sub-regulação HDAC4 suprimiram a capacidade de proliferação (Figura 3D, ∧P
< 0,05) e os números de formação de colónias de células SGC-7901 (Figuras 3E e F, ** P Art < 0,01). Em resumo, estes dados sugerem que HDAC4 pode ser um promotor de crescimento em células de SGC-7901.

HDAC4 aumentou os níveis de ATP e diminuição da produção de ROS

Um aumento nos níveis de ATP em células que sobre-expressam foi HDAC4 observada em comparação com as células NC SGC-7901 (Figura 3G, * P
< 0,05). Além disso, o nível de ATP foi diminuída em células HDAC4 knockdown (Figura 3H, * P Art < 0,05).

Porque geração de ROS intracelular pode estar relacionada à disfunção mitocondrial, nós ainda determinar se HDAC4 poderia estimular a geração de ROS em células SGC-7901. Os resultados demonstram que uma redução significativa da produção de ROS foi observada em pcDNA3.1 (+) - células HDAC4 SGC-7901 em comparação com células NC SGC-7901 (Figura 3G, ∧P
< 0,05). Enquanto isso, o silenciamento de HDAC4 robustamente activado geração de ROS em células SGC-7901 (Figura 3H, ** P Art < 0,01). Bloqueando a produção de ROS usando o NAC antioxidante significativamente inibido geração de ROS (Figura 3H, ∧P Art < 0,05). Este bloqueio de geração de ROS pelo pré-tratamento das células com NAC também marcadamente impediu a perda de ATP em HDAC4 siRNA células-SGC-7901 (Figura 3H, ∧P Art < 0,05).

O baixo expressão HDAC4 -regulated células na fase G0 /G1 preso

o down-regulação da HDAC4 exibiu um claro aumento na proporção de células na fase G0 /G1 (78,74% em comparação com 49,92% no NC-siRNA grupo). Houve também um decréscimo correspondente no número de células na fase S (12,94% em comparação com 34,61% no grupo NC-siARN) (Figura 4A). Os resultados da distribuição do ciclo celular quantificar mostraram que as células SGC-7901 induzidas significativamente HDAC4 knockdown G0 /G1 de prisão e de inibição fago S (Figura 4B, * P Art < 0,05, ** P
< 0,01). Assim, estes resultados sugerem que o nível HDAC4 poderia regular a progressão do ciclo celular.

O HDAC4 expressão induzida apoptose e autofagia
regulada para baixo

Para estudar se a inibição do crescimento celular induzida por HDAC4 regulada para baixo estava relacionado com a apoptose celular, o efeito de HDAC4 regulada para baixo sobre a apoptose das células foi avaliada por citometria de fluxo utilizando anexina V-FITC /PI dupla coloração. Observou-se que a apoptose aumentou marcadamente em HDAC4-siRNA células SGC-7901 em comparação com o grupo NC-siARN (Figura 4C). Confirmou-se ainda a indução de apoptose através da activação de caspase-3 e 9 através de Western blot. A análise revelou que HDAC4 regulada aumentou a clivagem de caspases-3 e 9, em comparação com o grupo NC-siRNA. A expressão da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 e a proteína pro-apoptótica Bax também foram quantificados. O rácio de Bax /Bcl-2 foi significativamente aumentada em siRNA HDAC4 células SGC-7901, quando comparado com o grupo NC-siARN (Figura 5D).

Para investigar se HDAC4 autofagia induzida regulada para baixo em SGC-7901 células, primeiro analisou a localização intracelular de LC3 em HDAC4-siRNA células SGC-7901 por meio de análise de imunofluorescência utilizando anticorpos fluorescentes para LC3. A distribuição específica de pontuar LC3 endógena foram observados como pontos puntiformes de fluorescência verde em HDAC4-siRNA células SGC-7901 em comparação com a do grupo NC-siARN (Figura 4E), o que indica que foi induzida autofagia como um meio de sobrevivência. A distribuição subcelular de LC3 foram significativamente inibido pela específicas de autofagia inibidor 3-MA em HDAC4-siRNA células SGC-7901 (Figura 4E). Em seguida, as proteínas relacionadas autophagy Atg7, beclin 1 e a razão de LC3-II a LC3-I foram analisados ​​por Western blot. Observou-se que os níveis de Atg7, beclin 1 e LC3-II de expressão foram todos significativamente aumentada em HDAC4-siRNA células SGC-7901 em comparação com o grupo NC-siARN (Figura 4F). O Atg7, beclin 1 e a razão de LC3-II-I lc3 diminuiu acentuadamente em HDAC4-siRNA células SGC-7901 que foram tratados com 3-MA em comparação com o grupo NC-siARN (Figura 4F).

a expressão HDAC4 regulada para baixo inibiu o crescimento celular através de p21 sobre-regulação

Porque o tratamento de células cancerosas humanas com inibidores de HDAC de forma consistente conduz à sobre-regulação da expressão de p21, um inibidor de quinase dependente de ciclina, que é um -alvo bem estabelecido de inibidores de HDAC [6], [7], [12], procurou-se determinar se a superexpressão ou knockdown de HDAC4 poderia afectar a regulação p21 e especular o mecanismo de promoção do crescimento mediada por HDAC4 em células cancerosas gástricas.

Tal como mostrado na Figura 5A, a sobre-regulação de HDAC4 dramaticamente conduziu à expressão da proteína p21 diminuiu. Em contraste, a regulação negativa HDAC4 levou ao aumento da expressão de p21 (Figura 5A). Nós, então, examinou se p21 knockdown pode afetar o crescimento celular e apoptose em células SGC-7901 em que HDAC4 foi suprimido. As células SGC-7901 foram co-transfectadas com ARNsi HDAC4 p21 e siRNA. O nível de mRNA p21 foi significativamente diminuído em HDAC4-siRNA células SGC-7901 após p21 knockdown (Figura 5B, ** P Art < 0,01, *** P Art < 0,001). p21 knockdown drasticamente atenuado inibição da proliferação celular em células de ARNsi HDAC4-SGC-7901 (Figura 5C, * P
< 0,05, ∧∧ P
< 0,01). O nível de ATP foi aumentada, mas a produção de ROS intracelular diminuiu no grupo de siRNA-p21-HDAC4 em comparação com o grupo de siRNA HDAC4 (Figura 5D, * P
< 0,05, ** P <
; 0,01). p21 infra-regulação significativamente atenuada G0 /G1 prisão e inibição fago S em HDAC4-siRNA SGC-7901 células (Figuras 5E e F, * P Art < 0,05). Imunotransferência mostrou que a quantidade de Bcl-2 foi significativamente mais elevada, mas o Bax foi mais baixa em células de siRNA-p21-HDAC4 (Figura 5G). A apoptose de células diminuiu acentuadamente em siRNA-p21-HDAC4 células SGC-7901 em comparação com o grupo de siRNA HDAC4 (Figura 5H). Observou-se também que knockdown p21 poderia resgatar o aumento da autofagia pontuado pontos fluorescentes (Figura 5I) e ATG 7, beclin 1 e LC3II proteínas expressão no SGC-7901 células induzidas por siRNA HDAC4 (Figura 5J). Colectivamente, estes dados indicam que a regulação negativa da p21 pode imitar o efeito da superexpressão HDAC4 e pode ser um importante mediador na promoção do crescimento celular SGC-7901 mediada por HDAC4.

Discussão

Numerosas HDAC inibidores, que foram mostrados para inibir a proliferação e induzir a diferenciação ou apoptose em células tumorais, estão a ser investigados em ensaios clínicos quer como agentes anti-cancro ou em conjunto com outro tratamento [13]. Alta expressão de HDAC1 /2 foi encontrada em tecidos do carcinoma gástrico [14]. Em nosso estudo, mostramos que a expressão HDAC4 foram regulados positivamente em tecidos de câncer gástrico e linhas celulares in vitro
. HDAC4 regulação negativa em células SGC-7901 suprimiu a proliferação celular e os números de formação de colónias, do ciclo celular preso e a apoptose celular induzida dependente da activação das caspases 3 e 9, o que é consistente com os efeitos anti-proliferativos e pró-apoptóticos de inibidores de HDAC em linhas celulares de cancro humano [15], e com a observação anteriormente relatado que HDAC4 regulação negativa reduz a sobrevivência clonogénica e induz a apoptose em células [5] HeLa. O efeito de proproliferative HDAC4 em células de cancro gástrico é consistente com a relatada anteriormente para as HDACs de classe I, HDAC1, -2, -3 e [16]. Assim, tendo como alvo a inibição da actividade HDAC4 pode ser uma potencial abordagem terapêutica para o tratamento do cancro gástrico.

Autophagy é essencialmente um sistema de degradação de proteínas dos próprios lisossomas da célula. Uma variedade de sinais de stress, tais como a fome nutriente ou tratamento com diferentes agentes anticancerígenos, estimular o processo autofagia [17]. Autophagy é geralmente caracterizada pela presença de autofagossomas e um aumento na clivagem de LC3 [18]. O papel da autofagia no processo de morte celular é controversa, mas foi confirmado que a diafonia entre a apoptose e autofagia é essencial na morte celular programada [19]. Em nosso estudo, a indução de autofagia em HDAC4-siRNA células SGC-7901 foi evidenciado pelo padrão de pontuar de LC3 imunocoloração e da acumulação de proteínas característicos bioquímicos de autofagia (Atg7, beclin 1 e LC3) por análise de western blot. inibição da autofagia pelo inibidor 3-MA atenuou a indução de autofagia em HDAC4-siRNA células SGC-7901. Assim, especulamos autofagia ocorreu pode proteger SGC-7901 células cancerosas por apoptose induzida knockdown HDAC4.

proteína p21, também conhecida como quinase dependente de ciclina (DRC) inibidor 1, regula a progressão da fase G1 do ciclo celular . p21 é muitas vezes mal regulados positivamente em cancros humanos, e que pode actuar como um supressor de tumor, ou como um oncogene [20]. Aqueles com cancros p21-positivas e p53-negativos têm curvas de sobrevivência significativamente mais elevados no carcinoma gástrico [21], ao passo que a perda de expressão p21, juntamente com o aumento da detecção de p53 está associada com mau prognóstico e diminuição da sobrevida global em câncer gástrico [22]. Consistente com o resultado de que a proteína p21 foi regulada negativamente nos tecidos de cancro gástrico [23], observou-se que HDAC4 promove a proliferação de células de cancro gástrico e o crescimento, mediado pela repressão do p21 em células de cancro gástrico, e é acompanhada por um aumento na os níveis de ATP e repressão da geração de ROS. Portanto, nós exploramos se p21 era um mediador importante para a promoção do crescimento celular SGC-7901 mediada por HDAC4. Neste estudo, HDAC4 knockdown induzida significativamente o aumento da expressão da proteína p21, enquanto que a sobre-expressão HDAC4 diminuíram significativamente a expressão da proteína p21 em células SGC-7901. Esses dados sugeriam que p21 pode ser um alvo a jusante da HDAC4. análises funcionais mostrou a regulação negativa da p21 pode imitar o efeito da superexpressão HDAC4 na promoção do crescimento celular SGC-7901. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que HDAC4 infra-regulação poderia promover SGC-7901 apoptose celular por up-regulação da expressão p21. p21 pode ser um supressor tumoral no desenvolvimento e progressão do cancro gástrico, a expressão da qual pode auxiliar no controle de uma variedade de comportamentos malignos do cancro gástrico. No entanto, o potencial relevância da regulação HDAC4 de expressão p21 também precisa ser visto no contexto de que existem vários factores-chave e caminhos que potencialmente modulam a expressão de p21 no cancro gástrico.

No seu conjunto, os nossos resultados têm revelado um papel importante no controle de HDAC4 linha celular de cancro gástrico humano SGC-7901 desenvolvimento através da regulação da proteína p21, o que sugere que a alteração da expressão e /ou actividade HDAC4 pode ser um evento importante durante o cancro gástrico. Em conclusão, estes resultados identificam HDAC4 como um importante regulador da proliferação do câncer gástrico através da repressão de p21 in vitro
.

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