Финансирование:. Эта работа была поддержана грантом Департамента здравоохранения провинции Гирин (№ 2012z119). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка (GC) является четвертым наиболее распространенным злокачественным и второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире [1]. Азии и странах Южной Америки имеют более высокий показатель заболеваемости GC, чем в Соединенных Штатах и Западной Европе [2]. Большинство целевой терапии сосредоточиться на фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), связанных с показаниями в передовых GC. Соединения против новых целей, таких как МРМ [3], (рецептора фактора роста гепатоцитов) с-Met [4], и HDACs, также находятся под следствием.
<Р> гистондеацетилазу 4 (HDAC4), который является классом IIa HDAC, как известно, существует в различных транскрипционных корепрессора комплексов. HDAC4 является одним из важнейших компонентов ответного пути повреждения ДНК, которая действует через 53BP1 [5]. HDAC4 репрессирует экспрессию циклин-зависимой киназы р21 ингибитора (также известный как p21Waf1 /Cip1) в раковых клетках человека, через механизм p53-независимого Sp1-зависимой [6]. HDAC4 способствует росту клеток рака толстой кишки через репрессии р21 [7]. Инактивация HDAC4 путем малых интерферирующих РНК или ингибиторов HDAC подавляет гибель нейронов [8].
<Р> Роль HDAC4 в специфических клетках (HeLa (рак шейки матки), U373 (глиомы), Ястребаце (яичников), T98G ( глиомы), НСТ116 (колоректальный), НСЗ (астроцитов) и SKBR3 (груди)) и ткани (кора головного мозга, яичек, простаты и эпидермальный слой кожи) становится все более ясно, [9]. Тем не менее, точный механизм HDAC4 при раке желудка не была определена. Таким образом, целью данного исследования было сначала оценить уровни экспрессии HDAC4 в желудка человека раковые ткани и клеточные линии. Во-вторых, эффект HDAC4 на желудочную линиях раковых клеток исследовали с помощью сверхэкспрессии и нокдаун. Наконец, мы исследовали, были ли HDAC4 отношения с p21 в клетках рака желудка. Вместе, наша цель состояла в том, чтобы найти, есть ли HDAC4 биологическую роль в развитии GC и выяснить основной механизм.
Образцы тканей
<р> Двадцать девять парных первичные желудка ткани карциномы и отдаленные нормальные ткани желудка были взяты у пациентов (возраст: 58,46 ± 9,17 лет) во время рутинной терапевтической хирургии в отделе желудочно-кишечной хирургии, первая больница Цзилинь университета. Все образцы были получены с информированного согласия в соответствии с Хельсинской декларацией и одобрен Комитетом по этике человека Первой больницы Цзилинь университета и университета Цзилинь, КНР по. Письменное информированное согласие было получено от всех участников.
стабильно трансфицированных клеток линии и временная трансфекция
<р> фрагмент HDAC4 полной длины амплифицировали с помощью ПЦР с обратной транскрипцией из клеток GES с использованием специфических праймеров, как описано ранее [10], и встраивали в сайты BamHI-I и Hind III из пкДНК3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, UK). PcDNA3.1 (+) - HDAC4 плазмида была подтверждена анализом последовательности, чтобы подтвердить отсутствие мутаций. СГК-7901 клетки были высеяны в 6-луночные планшеты и трансфецировали пкДНК3.1 (+) - HDAC4 и pcDNA3.1 (+) - векторы, соответственно, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями, при условии, изготовителем в течение 24 ч без отбора антибиотика. Затем клетки культивировали в среде, содержащей 400 мкг /мл G418 (Sigma, St. Louis, МО), пока все клетки в были убиты, не трансфицированные культуры управления.
<Р> SGC-7901 клетки были высеяны на 6-луночные планшеты и затем трансфицировали ненацеливании миРНК или миРНК, направленных против человеческого HDAC4 или p21 (Santa Cruz) с использованием Липофектамина 2000 в соответствии с инструкциями изготовителя. Натяжные Эксперименты проводились на клетках 48 или 72 ч после трансфекции.
Короче говоря, HDAC4 сверхэкспрессией и -knockdown SGC-7901 клетки были высеяны в трех экземплярах (1000 клеток на 60 мм блюдо культуры) и инкубировали при 37 ° с в течение двух недель с образованием клонов. Клетки промывали PBS, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 минут и окрашивали кристаллическим фиолетовым (0,5% кристаллическим фиолетовым, 1% параформальдегида и 20% метанола в PBS) в течение 30 мин. Колонии на каждой чашке подсчитывают и выражалась выживаемость клеток в процентах от числа выживших колоний на контрольных пластин.
Уровни концентрации АТФ в клетке анализировали с помощью биолюминесценции [11]. В кратком изложении, клетки лизируют и центрифугировали со скоростью примерно 15000 г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Супернатанты затем смешивают с рабочим раствором АТФ анализа смеси (Sigma), и количество света, излучаемого немедленно измеряли с помощью люминометра (Thermo Scientific Luminoskan Ascent, Walthan, Массачусетс). Данные люминесценции нормирована количеств образца белка (измеряли с использованием анализа ВСА).
Результаты
Выражение HDAC4 были повышающей регуляции в желудочном раковых тканях и клеточных линиях А pcDNA3.1 (+) вектор экспрессии используется для гиперэкспрессией HDAC4 в SGC-7901 клеток с целью изучения его эффективности в качестве регулятора роста. После стабильной трансфекции, экспрессия уровней HDAC4 мРНК обильнее в пкДНК3.1 (+) - HDAC4 клеток, чем у необработанного трансфецированных клеток или отрицательного контроля (NC) SGC-7901-клеток (рис 2А, ** * P & Как показано на рисунке 5А, вверх-регулирование HDAC4 резко привело к снижение экспрессии p21 белка. В противоположность этому, HDAC4 понижающую регуляцию привело к повышенной экспрессии p21 (фиг.5А). Затем мы исследовали, может ли р21 нокдаун влияет на рост клеток и апоптоз в SGC-7901 клеток, в которых HDAC4 была удалена. КЗВ-7901 клетки были совместно трансфицированы с миРНК HDAC4 и миРНК р21. Уровень мРНК р21 значительно снизилась в HDAC4-миРНК SGC-7901 после того, как клетки р21 нокдауна (фиг.5В, ** P &
<р> Во-первых, мы проанализировано выражение HDAC4 в двадцать девять лет в паре с раком желудка и прилегающих тканей неопухолевые путем анализа QRT-PCR и вестерн-блоттинга. Мы обнаружили, что HDAC4 была значительно повышающей регуляции в желудочном карцинома ткани (рис 1А, В и С, ** P &
л; 0,01, *** P &
л; 0,001). Кроме того, некоторые желудочные линии раковых клеток были также проанализированы. Мы наблюдали более высокую экспрессию HDAC4 в трех желудочных линий раковых клеток (AGS, BGC-823 и SGC-7901), по сравнению с нормальным желудочным линии эпителиальных клеток (GES) (рис 1D и Е, * P &
л; 0,05, ** P &
л; 0,01). Таким образом, наши результаты показали, что экспрессия HDAC4 были повышающей регуляции в обоих желудочных раковых тканей и клеточных линий.
Выражение HDAC4 успешно понижающего или повышающего регулируется в SGC-7901 клетки
л;. 0,001), что согласуется с результатом Вестерн-блоттинга (рис 2B)
<р> Для оценки гена-глушителей эффективность человеческого HDAC4-миРНК, степень экспрессии белка HDAC4 было измеренная после HDAC4-миРНК трансфекции и инкубационного периода 48-х в человеческой клетку рака желудка линии SGC-7901. В режиме реального времени ПЦР-анализ показал, что HDAC4 миРНК в результате заражения на 36,3% нокдауна уровней HDAC4 мРНК (рис 2С, *** P &
л; 0,001). Вестерн-блот-анализ показал, что белок HDAC4 была значительно снижена (Рисунок 2d), в соответствии с ее сокращением мРНК. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что HDAC4 миРНК может значительно подавлять эндогенную экспрессию HDAC4.
HDAC4 способствует пролиферации клеток и образование колоний
<р> Далее, мы исследовали влияние HDAC4 на рост клеток. пролиферации клеток исследовали с помощью Cell Counting комплект-8 (ССК-8) на временных точках 24, 48 и 72 ч. Кривые роста показали, что, когда HDAC4 была избыточная экспрессия в SGC-7901 клеток, рост клеток был увеличен в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой на 3-й день (рис 3A, * P
&л; 0,05, ∧∧P
&л; 0,01). Кроме того, анализ образования колоний отображается резкое увеличение в 2 раза по числу колоний, когда СГК-7901 клетки были трансфицированы пкДНК3.1 (+) - HDAC4 относительно группы NC (фиг.3В и С, ** P &
л; 0,01)
<р> Мы также исследовали влияние HDAC4 понижающей регуляции в SGC-7901 клеток.. Анализ и образование колоний анализ ССК-8 показал, что HDAC4 понижающая регуляция подавляется способность пролиферации (рис 3D, ∧P
&л; 0,05) и числа образование колоний SGC-7901 клетки (рис 3E и F, ** P &
л; 0,01). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что HDAC4 может быть промотор роста СГК-7901 клеток.
HDAC4 увеличение уровней АТФ и снижение генерации активных форм кислорода
<р> Увеличение уровней АТФ в HDAC4 избыточно экспрессирующих клеток наблюдаемый по сравнению с NC SGC-7901 клеток (рис 3G, * P
&л; 0,05). Кроме того, уровень АТФ снизился в HDAC4 нокдаун клеток (рис 3Н, * P
&л; 0,05).
<Р> Потому что внутриклеточная генерация ROS может быть связано с митохондриальной дисфункцией, мы также исследовали, является ли HDAC4 может стимулировать образование активных форм кислорода в SGC-7901 клеток. Результаты показывают, что значительное снижение генерации активных форм кислорода наблюдалось в пкДНК3.1 (+) - HDAC4 SGC-7901-клетки по сравнению с NC SGC-7901 клеток (рис 3G, ∧P
&л; 0,05). В то же время, глушение HDAC4 робастно активированного поколения ROS в SGC-7901 клеток (рис 3Н, ** P &
л; 0,01). Блокирование ROS производство с использованием антиоксидантного NAC существенно тормозится поколение ROS (рис 3Н, ∧P
&л; 0,05). Эта блокировка генерации активных форм кислорода путем предварительной обработки клеток с NAC также заметно предотвращено АТФ потери в HDAC4 миРНК-SGC-7901 клеток (рис 3Н, ∧P
&л; 0,05).
вниз выражение -regulated HDAC4 арестован клеток в G0 /G1 фазе
<р> понижающего регулирование HDAC4 выставлены явное увеличение доли клеток в G1 фазе /G0 (78,74% по сравнению с 49,92% в NC-миРНК группа). Был также соответствующее уменьшение числа клеток в фазе S (12,94% по сравнению с 34,61% в группе НК-миРНК) (фиг.4А). Результаты распределения количественного клеточного цикла показали, что HDAC4 нокдаун значительно индуцированные SGC-7901 клеток G0 /G1 арест и ингибирование фага S (рис 4B, * P
&л; 0,05, ** P
&л; 0,01). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что уровень HDAC4 может регулировать прогрессию клеточного цикла.
понижающего регулируется HDAC4 выражение индуцированного апоптоза и аутофагии
<р> Для того, чтобы изучить вопрос о том ингибирования роста клеток HDAC4 индуцированных вниз регулируемых был связан с апоптозом клеток, эффект понижающей регуляции HDAC4 на апоптоза клеток оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием аннексина V-FITC /PI двойного окрашивания. Было отмечено, что апоптоз заметно увеличилась в HDAC4-миРНК SGC-7901 клеток по сравнению с группой NC-миРНК (рис 4в). Кроме того, мы подтвердили индукцию апоптоза через активацию каспазы-3 и 9 с помощью Вестерн-блоттинга. Анализ показал, что понижающей регуляции HDAC4 увеличилось расщепление каспазы-3 и 9 по сравнению с группой NC-миРНК. Выражение антиапоптической белка Bcl-2 и проапоптотического белка Bax были также определены количественно. Отношение Bax /Bcl-2 была значительно увеличена в HDAC4-миРНК SGC-7901 клеток по сравнению с группой NC-миРНК (рис 5D).
<Р> Для того, чтобы исследовать вопрос о том вниз регулируется HDAC4 индуцированные аутофагии в SGC-7901 клетки, мы сначала исследовали внутриклеточное локализацию LC3 в HDAC4-миРНК SGC-7901 клеток путем иммунофлуоресцентного анализа с использованием флуоресцентных антител к LC3. Конкретное распределение пунктуация эндогенных LC3 наблюдали, как точечными точками зеленой флуоресценции в HDAC4-миРНК СГК-7901 клеток по сравнению с группой NC-миРНК (рис 4д), указывая, что аутофагия индуцировали как средство выживания. Внутриклеточное распределение LC3 были значительно тормозится аутофагии-специфического ингибитора 3-MA в HDAC4-миРНК SGC-7901 клеток (рис 4д). Затем связанные белки автофагии Atg7, Beclin 1 и соотношение LC3-II к LC3-I анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Мы наблюдали, что уровни экспрессии Atg7, Beclin 1 и LC3-II были значительно увеличилось в HDAC4-миРНК СГК-7901 клеток по сравнению с группой NC-миРНК (рис 4F). Atg7, Beclin 1 и отношение LC3-II к LC3-я заметно уменьшилась в HDAC4-миРНК СГК-7901 клеток, которые были обработаны с помощью 3-МА по сравнению с группой NC-миРНК (Рисунок 4f).
<Н3> выражение HDAC4 понижающей регуляции ингибирует рост клеток посредством p21 повышающей регуляции
<р> Поскольку лечение раковых клеток человека с ингибиторами HDAC последовательно приводит к повышающей регуляции экспрессии р21, ингибитор киназы с циклин-зависимой, который является устоявшихся мишень для ингибиторов HDAC [6], [7], [12], мы стремились определить, является ли избыточная экспрессия или нокдаун HDAC4 может повлиять на регулирование p21 и спекулировать механизм стимулирования роста HDAC4-опосредованного клеток рака желудка.
л; 0,01, *** P &
л; 0,001). p21 нокдаун резко ослабленный ингибирование пролиферации клеток в HDAC4-миРНК SGC-7901 клеток (рис 5C, * P
&л; 0,05, ∧∧ P
&л; 0,01). Уровень АТФ был увеличен, но внутриклеточный поколение ROS уменьшилось в миРНК-p21-HDAC4 группе по сравнению с группой миРНК HDAC4 (рис 5D, * P
&л; 0,05, ** P &
л; 0,01). p21 вниз регулирования значительно ослабляется G0 /G1 арест и ингибирование фага S в HDAC4-миРНК SGC-7901-клетки (рис 5E и F, * P
&л; 0,05). Иммуноблоттинг показал, что количество Bcl-2 был значительно выше, но Вах был ниже, в миРНК-P21-HDAC4 клеток (рис 5г). Апоптоз клеток заметно снизилась в миРНК-p21-HDAC4 SGC-7901 клеток по сравнению с группой миРНК HDAC4 (рис 5H). Было также отмечено, что p21 нокдаун может спасти повышенную аутофагию перемежается флуоресцентные пятна (рис 5i) и ATG 7, Beclin 1 и экспрессию белков LC3II в SGC 7901-клеток, индуцированных миРНК HDAC4 (рис 5J). В совокупности эти данные указывают на то, что понижающая регуляция р21 может имитировать эффект HDAC4 избыточной экспрессии и может быть важным посредником в HDAC4-опосредованной SGC-7901 стимуляции роста клеток.
Обсуждение
<р> Многочисленные HDAC ингибиторы, которые ингибируют пролиферацию и индуцировать дифференцировку или апоптоз в опухолевых клетках, исследуются в клинических испытаниях либо в качестве противораковых агентов или в сочетании с другими лечения [13]. Высокая экспрессия HDAC1 /2 был обнаружен в желудочных тканях карциномы [14]. В нашем исследовании мы показали, что экспрессия HDAC4 были повышающей регуляции в желудочном раковые ткани и клеточные линии в пробирке
. HDAC4 понижающая регуляция в SGC-7901 клеток подавлял клеточную пролиферацию и число образования колоний, арестованное клеточный цикл и индуцированный апоптоз клеток зависит от активации каспаз 3 и 9, что согласуется с антипролиферативным и проапоптических эффектов ингибиторов HDAC в линиях человеческих раковых клеток [15] и с ранее сообщалось о наблюдении, что HDAC4 понижающую регуляцию уменьшает клоногенных выживание и индуцирует апоптоз в клетках HeLa [5]. Proproliferative эффект HDAC4 в желудочном раковых клеток согласуется с ранее сообщалось для I класса HDACs, HDAC1, -2 и -3 [16]. Таким образом, ориентированные на ингибирование HDAC4 активности может быть потенциальный терапевтический подход для лечения рака желудка.
<Р> Аутофагия, по существу, система деградации белков собственных лизосом клетки. Разнообразие стрессовых сигналов, таких, как питательного голодания или лечения с различными противораковыми агентами, стимулируют процесс аутофагии [17]. Аутофагия, как правило, характеризуется наличием автофагосомы и увеличением расщепления LC3 [18]. Роль аутофагией в процессе клеточной смерти является спорным, но это было подтверждено, что перекрестные помехи между апоптозом и аутофагией имеет важное значение в запрограммированной клеточной гибели [19]. В нашем исследовании, индукция аутофагии в HDAC4-миРНК SGC-7901 клеток свидетельствует шаблон перемежать из LC3 иммунным окрашиванием и накопление биохимических отличительных белков аутофагии (Atg7, Beclin 1 и LC3) Вестерн-блот-анализа. Аутофагия ингибирование ингибитором 3-MA уменьшал индукцию аутофагии в HDAC4-миРНК SGC-7901 клеток. Таким образом, мы предположили аутофагия произошла может защитить СГК-7901 раковые клетки апоптозу, вызванному HDAC4 нокдаун.
<Р> р21 белок, также известный как циклин-зависимой киназы (CKD) ингибитор 1, регулирует прогрессию фазе G1 клеточного цикла , р21 часто неправильно отрегулированной в злокачественных опухолях человека, и он может выступать в качестве супрессора опухоли или как онкоген [20]. Те, с р21-позитивных и р53-негативных видов рака имеют значительно более высокие кривые выживаемости в карциномы желудка [21], в то время как потеря экспрессии р21 наряду с увеличением обнаружения р53 ассоциируется с плохим прогнозом и снижением общей выживаемости при раке желудка [22]. В соответствии с тем результатом, что p21 белок понижающей регуляции в желудочном раковых тканей [23], мы наблюдали, что HDAC4 способствует желудочной пролиферации раковых клеток и роста, опосредованного репрессии р21 в клеток рака желудка, и сопровождается увеличением АТФ уровни и подавление генерации РФК. Поэтому мы исследовали, был ли p21 важным посредником для HDAC4-опосредованной SGC-7901 стимуляции роста клеток. В этом исследовании, HDAC4 нокдаун значительно индуцируют повышенную экспрессию p21 белка, в то время как избыточная экспрессия HDAC4 значительно снижает экспрессию p21 белка в SGC-7901 клеток. Эти данные подразумеваемые, что p21 может быть нижестоящей мишенью HDAC4. Функциональные анализы показали, понижающую регуляцию р21 может имитировать эффект HDAC4 избыточной экспрессии на СГК-7901 стимуляции роста клеток. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что HDAC4 понижающей регуляции может способствовать SGC-7901 апоптоз клеток путем экспрессии p21 повышающей регуляции. р21 может быть супрессора опухоли в развитие и прогрессирование рака желудка, экспрессия которых может помочь в борьбе с различными злокачественными поведений рака желудка. Тем не менее, потенциальная значимость HDAC4 регуляции экспрессии p21 также необходимо рассматривать в контексте того, что существует несколько ключевых факторов и путей, которые потенциально модулируют экспрессию р21 при раке желудка.
<Р> Взятые вместе, наши результаты имеют выявили важную роль HDAC4 в контроле линии клеток рака желудка человеческого развития SGC-7901 с помощью регуляции p21, предполагая, что изменение экспрессии и /или активности HDAC4 может стать важным событием во время рака желудка. В заключение, эти результаты идентификации HDAC4 в качестве важного регулятора распространения рака желудка через репрессии р21 в пробирке
.
Новое испытание показывает улучшение выживаемости пациентов с распространенным колоректальным мутантным раком BRAF
Обычный грибок, обнаруженный на коже, может вызвать воспалительное заболевание кишечника.
Микробиота кишечника может предсказать тяжесть COVID-19
Секвенирование РНК позволяет по-новому взглянуть на микробиом
Белок SARS-CoV N вызывает выработку IFN-β, провоцируя убиквитинирование RIG-I,
Новый суперактивирующий рецептор макрофагов может объяснить гипервоспаление при тяжелой форме COVID-19
Верхняя эндоскопия
Если у вас хроническая изжога, боль в животе или груди, тошнота, и рвота, или другие проблемы, которые возникают в верхних отделах пищеварительной системы, мы можем порекомендовать верхнюю эндоскопию.
Оральный секс может вызвать бактериальный вагиноз
Новое исследование, опубликованное в журнале PLOS Биология выявил, что различные микробные популяции могут способствовать колонизации влагалища патогенными микроорганизмами, что, в свою очередь, мож
Ученые извлекли полный геном человека из «жевательной резинки» возрастом тысячи лет.
Кажется, жевательная резинка - не новый тренд! Исследователи обнаружили, что у жевательной резинки 5, Ему 700 лет, и он дал ключи к разгадке древней ДНК. Результаты исследования опубликованы в журнале