PLoS Genetics: mutações germinativas em MAP3K6 estão associados com Familial Câncer Gástrico

Abstract

O câncer gástrico está entre as principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Enquanto formas hereditárias de câncer gástrico são relativamente raros, identificar os genes responsáveis ​​por tais casos podem informar o diagnóstico e tratamento para ambos os casos hereditários e esporádicos de câncer gástrico. Mutações no gene da caderina-E, CDH1
, responsáveis ​​por 40% da forma mais comum de câncer gástrico familial (FGC), câncer gástrico difuso hereditário (HDGC). Os genes responsáveis ​​pelas formas restantes do FGC são presentemente desconhecidos. Aqui nós examinamos uma grande família de Canadá marítimo com FGC sem CDH1
mutações, e identificou uma linha germinativa de codificação variante (p.P946L) em ativada por mitógeno proteína quinase quinase quinase 6 ( MAP3K6
) . Com base na conservação, previu patogenicidade e um papel conhecida do gene de predisposição para o cancro, MAP3K6
foi considerado um forte candidato e foi mais investigada. Triagem de um adicional de 115 indivíduos não aparentados com não- CDH1
FGC identificou o p.P946L MAP3K6
variante, bem como quatro variantes de codificação adicionais em MAP3K6
(p. F849Sfs * 142, p.P958T, p.D200Y e p.V207G). Uma segunda variante somática-hit (p.H506Y) estava presente no DNA obtido a partir de uma das amostras de tumor, e evidência de hipermetilação do ADN dentro do gene MAP3K6
foi observada no DNA a partir do tumor de um outro indivíduo afectado. Estes resultados, juntamente com evidências anteriores de modelos do rato que MAP3K6
atua como um supressor tumoral e estudos que mostram a presença de mutações somáticas no MAP3K6
em cancros gástricos não-hereditárias e de células de câncer gástrico linhas, apontam para MAP3K6
variantes como um fator predisponente para FGC.

Autor Resumo

As mutações genéticas subjacentes envolvidos em 60% dos casos de câncer gástrico herdadas permanecem desconhecidos. Aqui nós apresentamos um grande pedigree, estendido com câncer gástrico familial e uma associação na parte da família com uma mutação no MAP3K6
. A conservação, previu patogenicidade da variante, distribuição de tecidos e função conhecida de MAP3K6
fez esta um candidato forte que justifica uma investigação mais aprofundada. Exame de um adicional de 115 probandos independentes identificaram mutações adicionais em MAP3K6
, incluindo uma mutação truncando

Citation:. Gaston D, Hansford S, Oliveira C, Nightingale M, Pinheiro H, Macgillivray C, et ai. (2014) da linhagem germinativa Mutações no MAP3K6
estão associados com Familial câncer gástrico. PLoS Genet 10 (10): e1004669. doi: 10.1371 /journal.pgen.1004669

editor: Marshall S. Horwitz, da Universidade de Washington, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de março de 2014; Aceito: 14 de agosto de 2014; Publicação: 23 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gaston et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A seguir agências forneceu o financiamento para este projecto: Genome Canada, Genome Atlântico, Nova Scotia Fundação de Pesquisa de Saúde, Nova Scotia Investigação e Inovação Trust, Dalhousie Faculdade de Medicina, Departamento de Oftalmologia Dalhousie, Health Canada, The Centre for Drug Investigação e Desenvolvimento, Capital Distrito de Saúde autoridade, Fundação Centro IWK Saúde, Fundo de Pesquisa em Saúde Capital, e O COMPETE /FEDER Fundação Português para a Ciência e Tecnologia (FCT), Projectos Ref. FCT PTDC /SAU-GMG /110785/2009 e Pós-doc SFRH concessão /BPD /79499/2011 a HP "financiados no ambito do Programa Operacional Temático Factores de Competitividade (COMPETE) e comparticipado cabelo Fundo Comunitário Europeu FEDER." MES é suportada pelo CHU Ste-Justine Centre de Recherche. Os autores gostariam de agradecer a contribuição de: Seqüenciamento do Genoma Plataforma Quebec High Throughput; e Sónia Sousa e José Carlos Machado da Unidade de IPATIMUP Diagnósticos, Porto, Portugal. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo com 738,000 mortes por ano [1]. O tratamento primário consiste na ressecção cirúrgica do tumor e pode ser seguido por quimioterapia e /ou radioterapia. As taxas de sobrevida em 5 anos após a ressecção cirúrgica são elevados se a doença é detectada precocemente (71% para a fase 1A), no entanto, eles saem rapidamente quando o diagnóstico é feito em fases posteriores (46% IIA estágio, 20% estádio IIIA, 4% em estágio IV) (banco de dados SEER do National Cancer Institute, outubro de 2013). Infelizmente, porque os sintomas iniciais do câncer gástrico se assemelham outras doenças, detecção muitas vezes não ocorre até estágios avançados já ter sido atingido [2]

Classicamente, câncer gástrico foi dividido em dois tipos:. Intestinal e difuso [ ,,,0],3]. A forma intestinal ocorre espontaneamente e é mais frequentemente encontrada em indivíduos idosos, enquanto a forma difusa ocorre frequentemente em indivíduos mais jovens e pode ser associado com uma história familiar de câncer gástrico. As populações com maior prevalência de infecção crônica Helicobacter pylori
tendem a ter mais elevados encargos com câncer gástrico [4]. A maioria dos cancros gástricos (90%) são esporádicos, mas cerca de 10% apresentam agrupamento familiar [5]. Apenas 1% a 3% são causados ​​por uma desordem hereditária, em oposição a factores ambientais, tais como práticas alimentares comuns [5]. A forma familiar mais bem estabelecido de câncer gástrico é câncer gástrico difuso hereditário (HDGC [MIM ​​137215]), onde aproximadamente 40% dos casos são atribuídos a mutações germinativas no gene que codifica a caderina-E, CDH1
[6 ] - [9].

Constatamos uma grande família de Canadá marítimo com história de Familial Câncer gástrico (FGC), exibindo um padrão autossômico dominante aparente de herança, mas tendo há variantes na região codificadora do CDH1
gene. Enquanto a família apresenta muitas características típicas de HDGC, houve diversidade na apresentação clínica dentro da família, bem como uma avançada idade de início, portanto, optou por se referir apenas à condição de FGC sobre o HDGC mais rigorosamente definido. mapeamento genômico das regiões herdadas compartilhadas entre membros da família afetada, seguida por sequenciação de todo o exome, levou à identificação de uma variante de nucleotídeo único da linha germinativa (SNV) em ativada por mitógeno proteína quinase quinase quinase 6 ( MAP3K6
, ask2
, MAPKKK6
, MEKK6
, ENSG00000142733), um gene que codifica um membro da serina /treonina cinase da família de proteínas. Vários in silico
métodos previu a SNV em MAP3K6 ser prejudicial para a proteína, e estudos anteriores com MAP3K6
camundongos deficientes [10], bem como a ocorrência de mutações neste gene em ambos os tumores de câncer gástrico primários e linhas celulares de cancro gástrico [11], foram consistentes com mutações no MAP3K6
gene sendo a mutação causador. Sequenciamento de DNA isolado directamente a partir de uma amostra de tumor fixos de um indivíduo demonstrou a presença de um de novo
variante de segunda hit no MAP3K6
. Triagem de um 115 amostras adicionais não relacionados FGC, também negativo para CDH1
mutações, revelou cinco indivíduos com quatro SNVS adicionais em MAP3K6
que foram também previsto para ser patogênico, bem como de outro indivíduo com o SNV identificados na família do Canadá marítimo. A idade de início variou entre MAP3K6
portadores SNV nos cinco famílias, e não tinham desenvolvido câncer, mesmo na fase tardia da vida, sugerindo penetrância incompleta. Este é o primeiro relatório de um câncer hereditário resultante do SNVS em MAP3K6
.

Resultados

clínicas e patológicas Avaliação

Constatamos uma grande Canadian Maritime família de ascendência europeia no decurso da avaliação clínica de rotina no ambulatório de câncer hereditário como parte de Maritime Serviço de Genética médica no Centro de Saúde IWK em Halifax, Nova Scotia, Canadá (Figura 1). Saliva, sangue, ou (FFPE) amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina foram obtidos a partir de 6 membros da família com cancro gástrico, bem como 27 familiares não afectados, e um indivíduo casar-no. Sem consanguinidade era suspeito neste pedigree.

O proband, o indivíduo afetado 1884, foi diagnosticado com carcinoma gástrico metastático e foi submetido a uma gastrectomia total com a idade de 51. O exame patológico revelou um adenocarcinoma pouco diferenciado que surgem no antro do estômago em um fundo de metaplasia intestinal e gastrite crónica. O tumor era composto de uma camada de células em anel de sinete (Figura 2C e D). O carcinoma penetrado através de toda a espessura da muscularis própria, envolvendo a camada serosa. Não há evidência de H. pylori
foi visto.

tia materna do proband, indivíduo 1826, foi diagnosticado com carcinoma gástrico aos 80 anos e foi submetido a uma gastrectomia parcial. O exame anatomopatológico revelou uma moderada a adenocarcinoma pouco diferenciado invadindo a muscular própria (Figura 2A). O tumor foi predominantemente composta de ninhos coesos de células neoplásicas com formação glandular ocasional. As células tumorais com as formas em anel de sinete celulares foram vistos nas áreas sólidas (Figura 2B). A mucosa gástrica adjacente ao tumor mostrou metaplasia intestinal focal sem evidência de H. pylori
.

Em 76 de uma biópsia de estômago de uma outra tia materna ao probando, indivíduo 1841 idade, foi relatado para ter um adenocarcinoma moderadamente diferenciado com a formação glandular. H. pylori
foi identificado na mucosa gástrica fundo. Uma seção biópsia pequena estava disponível para re-exame. Embora esta amostra era muito pequena para uma classificação completa, mostrou ninhos coesos de células neoplásicas com pequenos focos de formação glandular de acordo com um adenocarcinoma pouco diferenciado. Havia algumas células do tumor na amostra que mostram citoplasma claro, mas estes não podem ser definitivamente classificados como células em anel de sinete.

Uma biópsia de estômago na idade 82 do paciente 1844, a mãe do proband, mostrou um adenocarcinoma pouco diferenciado com características anel de sinete. A mucosa fundo mostraram evidências de H. pylori Comprar e metaplasia intestinal irregular.

Paciente 1845, um ao proband uma vez removido de primeira-prima, foi diagnosticado aos 59 anos com um carcinoma indiferenciado, sem características anel de sinete. O tumor foi associada com infiltrado linfóide denso e foi melhor classificado como carcinoma linfoepitelial. H. pylori
não foi observada na mucosa normal adjacente. O tumor foi positivo para duas variantes intrônicas em CDH1
sendo que ambos são esperados para ser benignos (NM_004360.3: c.688-83G > A e c.2439 + 52G > A)
<. p> paciente 2447, um terceiro primo, foi diagnosticado aos 44 anos com um adenocarcinoma pouco diferenciado, sem características de células em anel de sinete. A mucosa gástrica adjacente mostrou extensa metaplasia intestinal. Não havia nenhuma evidência de H. pylori
.

Após a triagem de um painel de 115 probandos com CDH1
câncer gástrico não-familiar, uma família sem relação de Portugal foi adicionado em nosso estudo (Figura 3A). Individual II-6 foi diagnosticado com câncer gástrico aos 62 anos, tendo adenocarcinoma pouco diferenciado do estômago e a presença de células em anel de sinete. A análise imuno-histoquímica mostrou coloração positiva membranoso de E-caderina nas células neoplásicas (Figura 3C), incluindo células em anel de sinete (Figura 3B). Os indivíduos relacionados I-4, II-1 e II-7 foram diagnosticados com câncer gástrico (detalhes histologia desconhecidos) nas idades de 53, 62 e 52, respectivamente. Todos os quatro indivíduos na árvore genealógica Português morreram da doença no prazo de 5 anos do diagnóstico nesta família. Na família canadense Marítimo, 1884, 1844 e 1841 morreram da doença no prazo de um ano de diagnóstico.

O câncer gástrico descrito para os pacientes 1845 e 2447 não tinham anéis de sinete observado e foi diagnosticado com uma idade média anterior ( 52 contra 72, embora o proband foi diagnosticado aos 51 anos). Com base nas diferenças de histologia, nomeadamente a ausência de células em anel de sinete, em 1845 e 2447 em comparação com os outros indivíduos afectados, é possível que a doença nestes dois indivíduos representa uma condição distinta. Como alternativa, é possível que a família está exibindo um padrão fenotípico mais complexa sendo impulsionada por duas (ou mais) genes.

Molecular Mapeamento e Exclusão de genes conhecidos e candidatos

Apesar de 30-40% dos casos hdgc são atribuíveis a mutações no CDH1
, há mutações em exons codificadores de proteínas de CDH1
foram encontrados em indivíduos afetados da família canadense Maritime. Para identificar o loci patogênico nesta família, de alta densidade SNP-genotipagem usando matrizes Illumina foi realizada em cinco indivíduos afetados: a mãe do proband (1844), duas tias maternas afetadas (1826 e 1841), e dois primos distantes (1845 e 2447) bem como vários indivíduos aparentados sem incidência de câncer cujo estado afecto foi tratado como desconhecido (1907, 1924, 1821, e 1822). Para todos os indivíduos, exceto 1845 dados de genotipagem estava disponível em 2,5 milhões de marcadores. Pessoa 1845 tinha sido previamente genotipados a uma densidade de 660k, e não foi capaz de ser re-genotipados a uma densidade mais elevada. Sem ADN adequado para genotipagem de SNP foi obtido a partir da amostra de FFPE o probando (1884). Usando esses dados, foi realizada tanto não paramétrico e análise de ligação paramétrica usando Merlin [12]. Dada a idade tardia de início em muitos membros da família afetados, a penetrância no pedigree Maritime é desconhecida. A fim de ser conservador na identificação de regiões genômicas de interesse, dois modelos dominantes penetrância (50% e 99% penetrância), utilizando indivíduos afetados 1826, 1841, 1844 e 2447 (e indivíduos 1907, 1924, 1821 e 1822 com o estatuto de afeição desconhecida ) foram usados. regiões genômicas identificadas na análise de ligação paramétrica foram geralmente consistentes uns com os outros, independentemente do parâmetro penetrância escolhido (Tabela 1). A análise foi repetida com cada 2.447 tratados como desconhecidos para analisar apenas o pedigree reduzida, onde 2447 e 1845 foram tratados como potenciais fenocópias (Tabela 2). Isto resultou em menores escores globais de nível de detalhe para todas as regiões identificadas, bem como mais e maiores regiões em média, abrangendo uma parcela maior do genoma.

Também realizamos ligação não paramétrica (NPL), um método com menos pressupostos subjacentes sobre o modelo de herança subjacente, utilizando indivíduos afetados 1826, 1841, 1844 e 2447 (wide pedigree-) ou com a remoção de 2447 como um fenocópia potencial especificando que eles sejam de estatuto desconhecido (sub-pedigree). intervalos de largura genómicas-pedigree foram principalmente consistente com os identificados utilizando os dois modelos paramétricos (Tabela 3). Exclusão de 2447 resultou numa pontuação inferior global máximo (1,204), o que foi encontrado em diversos intervalos ao longo do genoma (Tabela 3).

intervalos genómicos identificados deste modo foram usadas para filtrar os dados de sequenciação para identificar exome mutações causadores potenciais. Para ser ampla na identificação de possíveis mutações causais, tanto no caso de grande pedigree e sub-pedigree os intervalos dos respectivos paramétrica e análises não-paramétricas foram combinados. Para a linhagem de largura analisa esta era a união dos intervalos descritos na Tabela 1, juntamente com os intervalos apropriados na Tabela 3 (incluindo 2447) e para a análise de sub-linhagem a união de intervalos encontrados na Tabela 2 com intervalos adequados na Tabela 3 ( excluindo 2447).

Whole exome Sequencing

a seguir, realizada a sequenciação de todo o exome em duas das tias maternas afetadas ao probando (1826 e 1841) eo terceiro primo afetado (2447). Priorizamos e filtrada variantes com base em sua frequência entre populações europeias de descida (< 2% e um filtro mais rigoroso at < 1%) dos 1000 conjuntos de dados Genomas e exome projeto de sequenciamento, bem como outros exomes sequenciados ao mesmo prestador de sequenciamento, localização dentro de uma região genómica de interesse, e a consequência funcional da mutação (alteração da sequência de proteína ou de local de splicing do transcrito que codifica pelo menos uma proteína que codifica). Variantes de interesse foram então sequenciadas por seqüenciamento Sanger em outros indivíduos afetados. Variante de filtração baseado em intervalos genómicos foi realizada separadamente para cada hipótese (todo-pedigree e reduziu-pedigree) (Tabelas S1 e S2). Além da identificação e filtração de variantes genéticas, avaliou a profundidade sequenciamento de cobertura dos exons (definidos pelo conjunto de consenso CDS) dentro de regiões genômicas de interesse e em resultados exome sequenciação individuais. Além disso, temos procurado por variantes potencialmente compartilhados que foram "mascarados" por problemas de cobertura. Para todas as variantes observadas em um ou mais exomes, se nenhuma variante foi observada no exome restante (s), avaliou-se que era devido à baixa cobertura ou cobertura de lacunas dentro do exão. Para variantes em que isso era verdade nós filtrada usando critérios padronizados (como acima). Usando esses critérios de filtragem, diversas variantes com baixa MAF e, potencialmente, ter um efeito no nível de codificação da proteína foram observadas nas regiões genômicas de grande pedigree de interesse que tinham sido identificadas por análise de ligação paramétrico; no entanto, nenhum estavam presentes em todos os indivíduos afetados. Além disso há "mascaradas" variantes candidatos foram identificados pelos mesmos critérios.

Nós consideramos a possibilidade de que indivíduos 1845 e 2447 têm uma condição clínica distinta, e examinou as variantes compartilhados entre probando e família imediata. Usando os mesmos critérios de filtragem como acima, mas usando apenas os indivíduos exomes de 1826 e 1841, foram identificados um total de 127 variantes. filtragem mais rigorosa para as variantes raras (MAF < 1%) reduziu este número para 85 (Tabela S2). Um subconjunto destas variantes, com base em uma combinação de factores (mutações em CÓSMICA [13], previu efeito da mutação, a conservação do aminoácido codificado, revisão da literatura, os padrões de expressão conhecidos em tumores e tecidos normais, fenótipos de doença associados com o gene) foram sequenciados para acompanhamento no proband e sua mãe. Uma variante no MAP3K6
(Chr1, NM_004672) foi de particular interesse. Uma mutação identificada em MAP3K6
(. C [2837C > T]; [=], p.P946L) foi considerado um forte candidato com base nas associações conhecidas de outras quinases MAP com câncer, e várias publicações elucidar um papel para MAP3K6 na tumorigênese [10], [11], [14], [15]. Esta variante tem sido relatado previamente (rs141787524) com uma frequência menor alelo de 0,7% no Projeto 1000 Genomas (grupo de descendência Europeia) e uma frequência de 0,4% na população europeia-americana (exome Variant Server (NHLBI GO Projeto exome Sequencing ( ESP):. http://evs.gs.washington.edu/EVS [Acessado em outubro de 2013]) foi visto como uma variante heterozigótica em 11 (de 1532) outros exomes sequenciados na Innovation Centre Genome Quebec, correspondendo a um MAF de 0,36%.

Esta SNV esteve presente em quatro indivíduos afetados na família Maritime (1884, 1826, 1844, 1841), dos quais três mostraram claramente a presença de células em anel de sinete. Apenas uma pequena biópsia estava disponível para a tia materna de 1841, portanto, não foram capazes de confirmar definitivamente a presença ou ausência de células em anel de sinete. o MAP3K6
SNV também esteve presente em cinco dos 27 parentes Atualmente não afetados amostrados, e não estava presente no casou-in relativa. Uma das operadoras foi homozigotos para a SNV e durou mais de 80 anos sem câncer relatados. Embora sem consanguinidade foi relatado na família, e não foi observada nenhuma evidência de variação do número de cópia nos dados de genótipos de SNP, este indivíduo foi também homozigóticos para uma região de 10 Mb englobando o locus. Os portadores restantes tinham idades 33-51, e como a idade de início da doença foi geralmente mais tarde, seu estado era considerado "desconhecido". Ambos os indivíduos, 1845 e 2447, com o câncer gástrico fenotipicamente distintas foram negativos para o MAP3K6
SNV.

Somatic variantes dentro do tumor

A seguir, usou o DNA isolado a partir de uma seção tumoral da amostra FFPE dos afetados MAP3K6
SNV transportadora 1884 (probando) para triagem de SNVS somáticas adicionais ou perda de heterozigosidade (LOH) dentro do próprio tumor. Para além da variante p.P946L, nós identificada uma nova SNV gene MAP3K6
na posição C [1516C > T]. Conduzindo a uma mudança p.H506Y de aminoácidos (Tabela 4), e foram capazes inferir que a SNV foi somaticamente adquiridos com base em dados de sequência do cônjuge e filhos.

Verificação nos processos
independentes FGC

Nós selecionados amostras de DNA de 115 indivíduos um FGC não relacionados adicionais usando um multiplexado alvo próxima geração de ensaio de sequenciação. As amostras eram de famílias independentes que preencheram os critérios internacionais gástrica consórcio ligação câncer (IGCLC) para difuso hereditário câncer gástrico (106), mas já havia testado negativo para mutação do CDH1
lócus ou câncer gástrico intestinal familiar. Dentro deste grupo, foram identificados cinco heterozigotos SNVS adicionais no MAP3K6
gene (Tabela 4): a. Truncando SNV (. C [2544delC], p.F849Sfs * 142), três SNVS missense (c [2872C > a], p.P958T;. c [598G > T], p.D200Y; e c [620T >. G], p.V207G), e um outro indivíduo com o p.P946L (c [2837C >. T] ) variante, previamente encontrados na família Marítima (Figura 4). Mutações no MAP3K6
só foram descobertos nos indivíduos que preenchem os critérios para o cancro gástrico difuso (106). O indivíduo neste romance coorte paciente portador da variante p.P946L é pensado para ser relacionado com a família Maritime.

A SNV truncando foi observada em um indivíduo Português com uma história familiar de câncer gástrico (Figura 3A). Enquanto isso SNV tem um identificador dbSNP (rs34008139), nenhuma frequência população tem sido associada a ele a partir de qualquer dos 1000 Genomas ou projetos de servidor exome variante. Este SNV também foi avaliado na base de dados cósmica (estado somática /linha germinativa não especificada) [13], em uma amostra de carcinoma do intestino grosso. O exame histológico do tumor do probando mostrou um cancro gástrico pouco diferenciado com células em anel de sinete, mantendo a expressão da proteína E-caderina na membrana celular (Figura 3B e 3C).

A variante foi encontrada em p.D200Y de probandos duas famílias não relacionadas, e tem sido observado dentro do genoma de coorte 1000 (rs41291098), mas também é raro, com uma frequência menor alelo (MAF) de 0,4% em ambos os grupos de descendência 1000 genomas e exome Sequencing projecto europeu. A variante p.P958T (rs75893867) não tem MAF relatado em ambos os 1000 genomas ou exome Sequencing conjuntos de dados descendentes de europeus Project, e só foi identificado em 1000 Genomas entre a coorte japonesa com uma frequência de 2,2%. No entanto, tem sido identificada na cósmica (COSM99077) como uma mutação somática a partir de um paciente de carcinoma gástrico. A variante p.V207G foi identificado no Projeto conjunto de dados exome Sequenciação Europeia-americana com um MAF de 0,01%. Não foi identificado entre os grupos de descendência europeus e europeus em 1000 Genomas, mas foi observada dentro de outros grupos populacionais com uma gama de frequências de alelos menores.

Junto com MAP3K6
, 50 genes adicionais anteriormente sugerido para ser envolvida em risco de doença do trato gastrointestinal superior foram sequenciadas para este grupo utilizando um ensaio à base de painel personalizado (manuscrito submetido). Genes para a tela baseada em MiSeq costume foram seleccionados com base na revisão da literatura, bem como genes de interesse em projectos de colaboração. Nos casos em que MAP3K6
variantes missense foram identificados, há outras variantes candidatos foram encontrados.

Segunda-Hit Análise no Tumor da família Português

tecido tumoral FFPE foi disponível para o proband da família Português carregando os p.F849Sfs * 142 germinal truncando mutação. mutações somáticas foram excluídos na sequência de codificação e intron-exon completos limites da MAP3K6
no tumor do proband. A falta de LOH no MAP3K6
gene também pode ser inferido neste tumor, tanto como do tipo selvagem e alelos mutantes podem ser identificadas no local da mutação da linha germinativa (Recurso Figura S2). Por isso, procurou por mecanismos alternativos de inactivação putativos. Hipermetilação de ilhas CpG dentro de promotores de genes e regiões reguladoras é um fenômeno comum que conduz a expressão do gene diminuição no câncer [16]. MAP3K6
regulação por hipermetilação do promotor foi descrito para células-tronco mesenquimais da medula óssea humana [17], embora uma correlação de hipermetilação e expressão do gene não foi estabelecida. Temos procurado por MAP3K6
ilhas CpG [18] e encontrou duas ilhas CpG, um na região do promotor e outro exão 10 e parte do intron jusante abrangente (Figura 5 e Suplementar Figura S1). A ilha CpG jusante (ilha CpG 2) está perto de uma DNase local hipersensível previsto para abrigar promotor associado recursos (feature regulamentar Ensembl ID ENSR00000533270, Figura 5). Nós bissulfito-tratadas a partir de ADN: linfócitos do sangue periférico do probandos (PBLs); tumor do probando; quatro amostras de controlo estômago normais diferentes, e; sete linhas de células de cancro gástrico. Para o promotor ilha CpG (CpG Island 1), nenhuma hipermetilação foi detectada utilizando dois conjuntos de iniciadores diferentes (Figura 5 e Supl. Figura S1). Em relação CpG Island 2, observamos metilação completa para o DNA do tumor e não metilação do DNA PBL. Curiosamente, a análise de metilação de CpG ilha 2 em mucosa normal estômago de controles exibido um padrão de metilação parcial. Em linha com o resultado obtido para DNA do tumor, todas as sete linhas celulares de cancro gástrico exibido metilação completa (Figura 5 e Suppl. Figura S1).

Patogenicidade de SNVS em MAP3K6

Nós aplicamos uma variedade de in silico
métodos para prever a patogenicidade do SNVS missense observados. Apesar de não haver consenso total entre os programas (Tabela 5), ​​todos os SNVS foram consideradas prejudiciais por pelo menos um programa e, exceto p.V207G e p.P958T, as outras quatro variantes descritas neste relatório foram previstos para ser prejudicial por pelo menos 3 dos 7 métodos. Além disso, o EvoD [19] predição consenso (com base em uma combinação equilibrada do EvoD, PolyPhen2 [20], e peneirar [21] pontuações) relataram que três das variantes (p.D200Y, p.V207G, p.H506Y ) foram deletério ou susceptível de ser prejudicial. As restantes duas variantes, p.P946L e p.P958T, foram previstos para ser susceptível modificações neutras embora fossem evolutivamente conservada de ultra-e bem conservado (de acordo com a classificação EvoD taxa evolutiva), respectivamente; ao passo que apenas um dos outros três variantes (p.D200Y) foi considerado bem conservados e os outros dois foram menos conservada. Como em (i) um MAP3K6
truncando variante foi encontrada, (ii) havia uma segunda variante identificada bater no indivíduo a quem foi examinado tecido FFPE, e (iii) todos os programas testados são concebidos para prever patogenicidade com base na perda de função, é provável que as variantes descritas levar a uma diminuição da função ou fenótipo negativo dominante.

Discussão

Aqui nós apresentamos a primeira evidência de que mutações germinativas em MAP3K6
estão ligados ao câncer hereditário. Quatro indivíduos com câncer gástrico de uma família canadense Maritime foram encontrados para transportar uma variante heterozigótica no gene MAP3K6
, levando a uma mudança p.P946L aminoácido. Esta variante da linha germinal, localizado no cromossoma 1, foi identificado em duas das três amostras exome e estava localizado dentro de uma região identificada por análise paramétrica e não paramétrica de ligação no interior da sub-linhagem (1845 e 2447 tratados como "desconhecido" estado da doença) . O significado do MAP3K6
variante foi apoiada pela identificação de uma segunda-hit mutação somática no MAP3K6
gene em p.H506Y presente no DNA isolado directamente a partir de uma seção tumoral de um paciente amostra FFPE. Dois indivíduos do pedigree com câncer gástrico, mas com algumas diferenças fenotípicas não carregam a mutação; no entanto, há variantes candidatos foram identificados compartilhada entre todos os indivíduos afetados dentro de qualquer região identificada, por ligação paramétrico realizado em todo o pedigree.

Triagem de famílias adicionais do FGC revelou outros cinco MAP3K6
mutações, incluindo uma mutação p.F849Sfs * 142 germinal observado no proband Português, que é esperado para levar a proteína truncada. Após a exclusão de mutações somáticas e LOH, um potencial mecanismo de segunda batida foi encontrado via
hipermetilação em uma ilha CpG intragenic perto de um elemento regulador associado-promotor previsto (DNAse I site de hipersensibilidade). A relevância da metilação neste região do gene MAP3K6
não pôde ser verificado, em termos de impacto na expressão do gene, no entanto, a possibilidade de atuar como uma possível segunda-hit inativação mecanismo (parcial ou total) é elevada, devido à os resultados obtidos em linhas celulares de cancro do estômago e normais. Se assim for, este pode muito bem representar um outro exemplo do conceito cada vez mais reconhecido que a metilação do DNA no corpo gene não é apenas uma testemunha passiva da transcrição de genes, mas está ativamente envolvido em vários processos de regulação gênica [22], que justificam uma investigação mais aprofundada. Histopatologia A análise do indivíduo da família Português transportando esta mutação truncando destaque células em anel de sinete como parte do fenótipo tumoral, como fez a maioria dos indivíduos a partir da sub-pedigree Maritime (exceto 1841, em que o estatuto anel de sinete foi inconclusivo devido à falta de material suficiente).

Apesar de MAP3K6
mutações não foram previamente identificados no câncer herdada, há um crescente corpo de evidências que MAP3K6
tem um papel importante na patogênese do câncer . Em camundongos, onde MAP3K6
é normalmente expressa em tecido gástrico e da pele, a perda de MAP3K6
em ratinhos knockout homozigóticos foi encontrado para aumentar a susceptibilidade ao câncer de pele induzido [10]. Os ratos não desenvolveram câncer espontaneamente; No entanto, a indução química realizada na presença de um estímulo inflamatório levou a um maior número de tumores da pele em ratinhos deficientes MAP3K6
do que nos animais de controlo. O número de tumores em heterozigotos ( MAP3K6
^{+/-) ratos, bem como o seu tamanho, foi intermediária entre o tipo selvagem e ratinhos knock-out, sugerindo um papel para MAP3K6
dosagem em seus efeitos [10].}

• PLoS ONE: Comparativo Proteomics Análise de câncer gástrico Stem Cells
• PLOS ONE: Diminuiu-Core fucosila�o Contribui para malignidade em gástrica Cancer