PLOS ONE: Entrega adenoviral do EMX2 Gene suprime o crescimento no gástrico humano Cancer

Abstract

Fundo

EMX2 é um orthologue humana do Drosophila
gene homeobox spiracles vazia que tem sido implicado na embriogénese. Estudos recentes sugerem possível envolvimento de EMX2 em cancros humanos; no entanto, o papel de EMX2 na carcinogênese precisa de uma maior exploração.

Resultados

Neste estudo, nós relatamos que a infra-regulação da expressão EMX2 foi significativamente correlacionada com a hipermetilação do promotor EMX2 no câncer gástrico. Restaurar EMX2 expressão utilizando um sistema de libertação de adenovírus em linhas celulares de cancro gástrico sem expressão endógena EMX2 conduziu à inibição da proliferação celular e via de sinalização Wnt tanto in vitro e num modelo de xenoenxerto de cancro gástrico in vivo. Além disso, observou-se que os animais tratados com o vector de expressão de EMX2 adenoviral apresentaram melhor sobrevida do que aqueles tratados com vector vazio adenoviral.

Conclusão

O nosso estudo sugere que EMX2 é um supressor tumoral putativo na cancro gástrico humano. O adenoviral-EMX2 pode ter potencial como uma terapia de gene novo para o tratamento de doentes com cancro gástrico

citação:. J Li, Mo M, Chen Z, Chen Z, Q Sheng, Mu H, et al. (2012) entrega adenoviral do EMX2 Gene suprime o crescimento em Câncer gástrico humano. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10.1371 /journal.pone.0045970

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 13 Abril, 2012; Aceito: 23 de agosto de 2012; Publicado: 21 de Setembro 2012 |

Direitos de autor: © Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por recursos do Programa Key Nacional de Pesquisa básica e Desenvolvimento (973) da China (2011CB910800 e 2012CB917304), o National Natural Science Foundation da China (31.170.732), a Fundação de Ciência Natural da província de Zhejiang (Y2101329), e da Ciência Pós-Doutorado Fundação da Província de Zhejiang (2010-BSH-031). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum e segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1], [2], [3]. Embora sua incidência global tem diminuído, a incidência continua a ser elevada nos países asiáticos [2], [4], [5]. A maioria dos pacientes com câncer gástrico são diagnosticados em estágios avançados [6]. Apesar da melhoria nas estratégias de tratamento [7], [8], a sobrevivência de doentes com cancro gástrico avançado que receberam terapias convencionais de 5 anos continua a ser inferior a 30% [4]. Assim, são urgentemente necessárias abordagens alternativas.

A terapia genética, incluindo o sistema de entrega de genes virais e não-virais, é uma abordagem promissora para o tratamento do cancro [9]. Entre todos os sistemas actualmente disponíveis, de adenovirus recombinante (Ad) são vectores particularmente promissora. As vantagens dos vectores Ad incluem a capacidade de produzir títulos elevados, a capacidade de infectar de se dividir e não as células em divisão de forma eficiente, a estabilidade do genoma, e baixos níveis de integração de DNA em genoma do hospedeiro [9], [10]. Tem sido relatado que a restauração de genes através desta abordagem leva a regressão do tumor e induz a apoptose in vivo
sem afetar os tecidos normais [11], [12], [13].

EMX2, ort�logo humana do Drosophila
gene homeobox spiracles vazias (EMS), pertencente à família de genes homeobox que codifica proteínas reguladoras da transcrição (Homeoprotein) essenciais para muitos aspectos do crescimento e diferenciação [14]. EMX2 desempenha um papel vital durante o cérebro [15] e desenvolvimento do esqueleto [16]. Camundongos com mutações EMX2 homozigotos apresentam dramática redução do tamanho das áreas de caudais-medial incluindo córtex occipital e hipocampo [17], [18], [19]. Perturbação de expressão EMX2 pode alterar a taxa de proliferação de células estaminais neuronais adultas [20]. EMX2 também controla reprodução dos mamíferos, ajustando a proliferação de células do endométrio sem afetar a diferenciação [21].

Estudos recentes sugerem possível envolvimento de EMX2 em cancros humanos [22], [23], [24], [25]. Por exemplo, EMX2 tem sido demonstrada como um supressor tumoral no câncer de pulmão, e baixa expressão EMX2 está associada à diminuição de sobrevida global ea sobrevida livre de recorrência em pacientes com adenocarcinoma pulmonar [22], [23]. Também está relatado que a expressão EMX2 é abundante no endométrio normal de mulheres pós-menopausa, mas ausente ou reduzida em tumores do endométrio, e níveis EMX2 está negativamente correlacionada com a proliferação de [24], [25]. Além disso, pode regular EMX2 tumorigénese através da via de sinalização Wnt, um caminho crítico regulação determinação destino celular, o desenvolvimento do tecido e tumorigénese [26], [27], [28]. EMX2 é encontrado como um repressor directo da expressão Wnt1, e batendo-as do gene EMX2 induz a expressão ectópica de Wnt1 no telencéfalo desenvolvimento e displasia cortical [29]. silenciamento epigenético da expressão EMX2 pode ser importante para a activação aberrante da sinalização de Wnt no cancro do pulmão e consequente proliferação e metástase [22]. No entanto, a função de EMX2 durante tumorigênese e correspondente mecanismo ainda precisa ser mais bem investigado. Neste estudo, são descritos EMX2 como um supressor tumoral no cancro gástrico putativa humana. Nós demonstramos o downregulation EMX2 e sua correlação com estado de metilação da região promotora do gene no câncer gástrico. Mostramos também que a restauração de EMX2 usando um sistema de entrega adenoviral inibe a proliferação celular e sinalização de Wnt in vitro
, e resulta em melhor sobrevida de um modelo de xenoenxerto de cancro gástrico in vivo
. Nossos dados sugerem fortemente o potencial terapêutico de usar o Ad-EMX2 como a terapia genética para o tratamento futuro de pacientes com câncer gástrico.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Xuanwu, University Medical Capital, em Pequim. Um termo de consentimento informado aprovado pelo comitê de ética, foi obtido para cada paciente antes da coleta da amostra de tecido.

cultura de células, 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC) /tricostatina A (TSA) Tratamento e As amostras de tecido

linhas celulares de cancro gástrico humano (AZ521, AGS e MKN28) foram obtidos a partir de China Center for Type Culture Collection (Wuhan, China). As linhas celulares foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina a 37 ° C numa incubadora húmida com 5% de CO _{2. Para analisar a restauração do gene EMX2, as células foram tratadas com 4 uM DAC ou 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, EUA) durante 4 dias, com reposição de meio fresco contendo a mesma dose de DAC ou TSA todos os dias. As células de controlo foram cultivadas com meio fresco contendo DMSO. As células foram, consequentemente, colhidas para Extração de DNA /RNA.}

Um total de 20 tecidos blocos fixados em formalina e embebidos em parafina (10 tecidos de câncer gástrico e 10 tecidos normais adjacentes), bem como RNA total de 15 amostras de displasia gástrica e 20 amostras cirúrgicas de câncer gástrico foram obtidos a partir Xuanwu Hospital, University Medical Capital, em Pequim. O ARN total e o ADN genómico extraído a partir de tecidos normais de adulto humano gástricas foram adquiridos a Biochain (Hayward, CA, EUA).

construções de ADN

Topflash /Fopflash repórteres contendo tipo selvagem e mutante TCF /LEF locais, respectivamente, foram gentilmente cedidas pelo Dr. Yeguang Chen (Universidade de Tsinghua, Pequim, China) vinculativo. A construção de cDNA mutante CTNNB1 (S45Y) também foi gentilmente cedido pelo Dr. Yeguang Chen (Universidade de Tsinghua, Pequim, China). vectores de adenovirus recombinantes expressando EMX2 e o vector de controlo foram adquiridos à Vector Biolabs (Biolabs Vector, Burlingame, CA, USA).

metilação específicas de PCR (MSP) A sequenciação e bissulfito (BS)

a conversão de bissulfito a partir de tecidos e de células foram realizados sem o pré-requisito para a purificação do ADN utilizando o kit EZ-metilação de ADN directa (Zymo, Orange, CA, EUA). Os tecidos FFPE foram os primeiros em xileno (Sigma) e re-hidratadas em etanol graduado, antes do tratamento com bissulfito de acordo com as instruções do fabricante parafinado-de. Para MSP, DNA modificado é amplificada utilizando iniciadores de MSP (listados abaixo) que especialmente reconhecidos tanto as sequências do promotor EMX2 metilados ou não metilados após tratamento com bissulfito. PCR foi realizada num volume final de 20 ul contendo 1 × tampão de reacção de MSP [30], 0,5 uM de cada iniciador e 1 L de Zymo
Taq ™ DNA Polymerase (Zymo). condição de PCR foi como se segue: 10 min a 95 ° C; 40 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 50 ° C e 30 a 72 ° C; e extensão final de 7 min a 72 ° C. Para BS, a amplificação de ADN com bissulfito-convertido foi realizada num volume final de 50 ul contendo 1 uM de cada iniciador e 2 U BS de Zymo
Taq ™ DNA Polymerase. condição de PCR foi como se segue: 10 min a 95 ° C; 40 ciclos de 30 s a 95 ° C, 40 s a 55 ° C e 1 min a 72 ° C; e extensão final de 7 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram clonados em pmd-18T (Takara, Dalian, China). 5 ou 3 clones positivos seleccionados aleatoriamente de cada grupo foram sequenciados em Xangai Invitrogen (Xangai, China). Iniciadores foram os seguintes:

MSP-M (para a frente): 5'- '

MSP-M (reverso)
: 5'GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3' TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3

MSP-U (para a frente): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '

MSP-U (reverso): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'

BS-A (para a frente): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '

BS-A (reverso): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'

BS-B
(para a frente): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '

BS-B (reverso): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '

imuno-histoquímica (IHQ)

IHC foi realizada seguindo o protocolo padrão. Os anticorpos utilizados no estudo incluiu Ki67 de murganho anti-humano (1:100; BD, San Jose, CA, EUA) e EMX2 rato anti-humano (1:500; Pierce, Rockford, IL, EUA), e Alexa 594-conjugado anticorpo de cabra anti-ratinho secundário (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As lâminas também foram contrastadas com hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 microscópio confocal (Oberkochen, Alemanha) foi usada para analisar a coloração. A intensidade do Ki67 foi quantificada utilizando Imagem Pro® Plus. coloração EMX2 foi visualizado com kit Histostain Além disso DAB (amplo espectro, Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, contrastadas com hematoxilina (Sigma), e fotografado usando um scanner de slides Leica SCN400 (Leica, Alemanha).

Luciferase Assay

células a uma densidade de 5 x 10 ^{3 por poço foram semeadas em placas de 24 poços antes da transfecção. plasmídeos ou Topflash Fopflash foram co-transfectadas com o plasmídeo de PRL-TK. Depois as células foram cultivadas durante 18 horas, a actividade da luciferase foi medida por Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, EUA). A relação entre a actividade da luciferase do pirilampo (Topflash /Fopflash) ea atividade Renilla foi utilizado para a atividade TCF /LEF transcrição.}

Immunoblotting

Ambos proteína total (20 ug) e extractos de citoplasma (40 mg) foram sujeitas a imunotransf erência. Os anticorpos primários incluíram anti-EMX2 (1:500; Pierce), anti-β-Actina (1:5000; Sigma), anti-ciclina D1 (1:500; BD) e anti-c-Myc (1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA).

Ensaio de Proliferação

O crescimento celular foi determinado por CellTiter 96 Aqueous Proliferação Assay Kit (Promega). As linhas de células foram plaqueadas em placas de 96 poços de cultura com o número de 5 × 10 ^{2 células /poço. Depois que as células foram cultivadas durante dias 0, 2, 3 e 4, as soluções de MTS foram adicionados ao meio e incubou-se durante 1,5 h. A absorvância a 490 nm foi medida utilizando o modelo 680 leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).}

Ensaio de formação de colónias

Células (1 × 10 ^{3) infectados com o vector adenoviral que expressa EMX2 ou vector vazio foram semeadas em triplicado em placas de 100 mm. Meio fresco foi trocado a cada 3 dias. Depois de cultura durante 3-4 semanas, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min, lavadas com PBS, coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 20 min e fotografado.}

Extração de RNA e quantitativo em tempo real transcrição reversa -PCR (RT-PCR)

extracção de ARN e em tempo real de RT-PCR foram realizados como previamente descrito [31]. As sequências dos iniciadores foram previamente descritos [22].

Modelo Animal e adenoviral Vector Entrega

Todos os experimentos ratos foram conduzidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos no biotério da Universidade de Tsinghua e aprovado pelo Institutional animal Care e Use Committee da Universidade de Tsinghua. xenotransplantes câncer gástrico foram estabelecidos em ratinhos nus Balb /C fêmeas com 5 semanas de idade. Resumidamente, depois cultivadas até à confluência, as células MKN28 ou AGS foram trypisnized e ressuspensas em PBS (pH 7,4) e, em seguida, misturado 01:01 (v /v) com Matrigel (vigorosa) a 4 ° C para injectar um rato num volume total de 150 ul. A mistura foi s.c injetado flanco direito de 16 ratos fêmeas com 10 ^{7 células por rato (dia 0). No dia 7, os ratinhos portadores de tumores locais variou de 50 a 100 mm 2 receberam uma injecção intra-tumoral directa de 1 × 10 9 unidades do adenovírus indicado (diluído com PBS num volume total de formação de placas 100 ul). A formação do tumor foi monitorado por até 1 ½ meses. O tamanho do tumor foi medido usando paquímetro e determinado multiplicando por 0,5 x largura 2 × comprimento. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a sobrevivência dos dois grupos de animais tratados. No final da experiência, os tumores de cada tratamento foram recolhidos em 10% de formalina tamponada, embebidos em parafina e cortados em fatias de 5 mm de espessura para uma maior detecção de Ki-67. proteínas citosólicas e lisado de células inteiras também foram extraídos os tumores para análise de Western.}

Análise Estatística

Todos os dados foram calculados como média ± desvio padrão. Diferenças entre os grupos foram comparados com o teste t de um estudante em frente e verso. A P valor
de 0,05 ou menos foi considerado significativo.

Resultados

regulação negativa do EMX2 no câncer gástrico humano

Foram examinados expressão EMX2 em nove linhas celulares de cancro humanas gástricas, assim como de tumores e tecidos normais adjacentes emparelhados de dez doentes com cancro gástrico (Figura 1). Usando o tempo real de RT-PCR, verificou-se que a expressão de EMX2 foi significativamente regulada negativamente em oito dos nove linhas celulares examinadas, quando comparada com a de tecido gástrico normal (P < 0,01, Figura 1A). Por outro lado, uma linha de células de AZ521 demonstraram níveis semelhantes de expressão em que EMX2 como controlo normal (Figura 1A). A fim de detectar a expressão de proteína EMX2 em amostras de tecido do doente, imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada e a intensidade de coloração IHC foi quantificada por Image Pro® Plus. Todas as dez amostras analisadas foram encontrados para exibir qualquer falta de expressão EMX2 ou diminuição dos níveis de expressão EMX2 em tecidos de cancro, quando comparado com as suas contrapartes normais (P < 0,01, Figura 1B). Para estabelecer o possível papel da EMX2 na progressão patológica de cancro gástrico humano, analisamos a expressão EMX2 usando RNA total que obtida a partir de quinze amostras de displasia gástrica e vinte amostras cirúrgicas de câncer gástrico. Descobrimos que a expressão EMX2 foi significativamente regulada negativamente em amostras de displasia (P < 0,05). E quase perdido em amostras de cancro em comparação com que no adulto tecido do estômago normal (Figura 1C), o que sugere que a regulação negativa EMX2 pode ocorrer na fase de pré-canceroso não-invasiva

Correção entre Expression EMX2 e sua metilação do promotor Estado

Foram examinados estado de metilação do promotor EMX2 em nove linhas celulares de cancro gástrico e tecido gástrico normal. Regiões de ilhas CpG (CGI) foram identificados com MethPrimer de -800 a -470 e -55 a 459, em relação aos locais de iniciação da transcrição esperados (+1) de EMX2 gene (Figura 2A). estado de metilação foi analisada por sequenciação usando bissulfito (BS) (Figura 2B) e PCR (MSP) específicos para a metilação (Figuras 2C-2D). O nosso BS e MSP resultados mostraram que o promotor EMX2 nas células dos tecidos e AZ521 gástricas normais era não metilado, enquanto que nos outros oito linhas celulares examinadas foi densamente metilado (Figuras 2B-2C). Estes resultados são consistentes com os níveis de expressão EMX2 nestas linhas celulares: ricos em tecido normal e AZ521, mas baixa nos outros oito linhas celulares examinadas. Uma mistura de banda metilado e não metilado foi encontrado em várias linhas de células, incluindo MKN28, N87, e SNU16 indicando metilação parcial. Além disso, descobrimos que o estado de metilação das amostras de tecido de pacientes reveladas por MSP é consistente com os níveis de expressão EMX2 nas amostras (Figura 2D, quatro dos dez pares de amostras de tecidos foram examinados devido à indisponibilidade de ADN genómico a partir dos outros seis pares ). Estes dados sugerem que a regulação negativa da expressão EMX2 pode ser um resultado do seu promotor hiper-metilação no cancro gástrico.

Para investigar ainda mais a correlação entre a expressão EMX2 e a metilação do promotor, foram tratados linhas de células MKN28 e AGS com uma inibidor da metiltransferase de DAC, e um TSA inibidor da desacetilase de histona. A linha celular AZ521 foi utilizado como um controlo negativo como sua região promotora é não metilado. Observou-se que a banda específica unmethylation foi significativamente aumentada (Figura 3A) com níveis de expressão EMX2 regulados positivamente em conformidade (Figura 3B) por meio de tratamento em ambas as DAC AGS e células MKN28, ao passo que as células em AZ521 permaneceu inalterado (Figura 3). O tratamento de TSA com efeitos mínimos no estado de metilação e tanto os níveis de expressão EMX2. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem fortemente a infra-regulação da expressão EMX2 foi significativamente correlacionada com a hipermetilação do promotor EMX2 no cancro gástrico humano.

inibição do crescimento celular por EMX2 Adenovirus-entregues in vitro

a seguir, examinaram o papel de EMX2 no crescimento celular de células de cancro gástrico. O crescimento de células AGS e MKN28 foi suprimida de forma significativa após infecção com adenovírus expressando EMX2 (Ad-EMX2) em comparação com um controlo de vector vazio (Ad-Ctrl) (P < 0,001, Figura 4A), ao passo que o crescimento de células AZ521 não foi afectada (P > 0,05, Figura 4A). Estas observações também foram confirmados por ensaio de formação de colónias (Figura 4B). Nossos resultados demonstram a função de anti-proliferação de EMX2 em células cancerosas gástricas

Supressão de Wnt via de sinalização por Adenovirus entregue EMX2

A função de EMX2 tem sido associada a via de sinalização Wnt.; portanto, estudaram a relação entre EMX2 e sinalização Wnt no câncer gástrico. Utilizou-se um ensaio de repórter Topflash /Fopflash para medir a actividade de transcrição TCF /LEF-dependente regulada por canônica via Wnt. Descobrimos que a actividade de transcrição TCF /LEF-dependente foi significativamente inibida pelo Ad-EMX2 em células AGS e MKN28 sem expressão EMX2 endógena (P < 0,05), mas não em células AZ521 expressam EMX2 endógena (P > 0,05, Figura 5A). Consistentemente, os níveis de proteína de citosólica β-catenina e canónica via Wnt alvos a jusante de c-myc e Ciclina D1 foram suprimidas nestes AGS e células MKN28 infectadas com Ad-EMX2, mas não em células AZ521 (restauração de expressão EMX2 nestas linhas celulares, após infecção ad-EMX2 foi confirmada por Western) (Figura 5B). Para examinar ainda mais a relevância de Wnt via infra-regulação e supressão de proliferação por Ad-EMX2, nós transfectado e expresso estabilizado β-catenina (mutação S45Y) nestas células cancerosas gástricas infectadas com Ad-EMX2. Observou-se que a sobre-expressando β-catenina atenuou significativamente o efeito de supressão do crescimento de Ad-EMX2 em ambos os AGS e células MKN28 (P < 0,01), mas não em células AZ521 (Figura 5C). Tomados em conjunto, estes resultados suportam um papel importante de EMX2 na supressão da Wnt percurso no câncer gástrico.

Supressão do crescimento Câncer Gástrico por Adenovirus entregue EMX2 in vivo

Nós estabelecemos a MKN28 e AGS modelos de xenotransplante para explorar o potencial terapêutico da EMX2 entregues por adenovírus para câncer gástrico in vivo
. Uma semana após a inoculação, os ratinhos portadores de tumores locais que variam de 50 a 100 mm ^{2 receberam uma injecção intratumoral directa de 1 × 10 9 unidades formadoras de placa do adenovírus indicado. O crescimento de tumores em ratinhos infectados Ad-EMX2 foram significativamente mais lenta do que no grupo de controlo (P < 0,05, Figura 6A deixou dois painéis). Na conclusão da massa tumoral experimento em camundongos infectados Ad-EMX2 também significativamente menor do que no grupo controle (P < 0,05 para tumor MKN28, P < 0,01 para tumor AGS, Figura 6A painel da direita). Intensidade de coloração de Ki67 um marcador proliferativa de espécimes de tumor no final da experiência mostrou que a entrega de Ad-EMX2 diminuiu significativamente o Ki-67 de coloração (P < 0,01, Figura 6B), sugerindo a inibição da proliferação celular em tumores. Além disso, a sobrevivência do grupo Ad-EMX2 infectados foi significativamente melhor do que a do grupo controle (P = 0,014, Figura 6C). Consistente com nosso in vitro
análise, citosólica β-catenina e canônico da via Wnt alvos a jusante c-myc e ciclina D1 também foram reprimidos em Ad-EMX2 infectado MKN28 e tumores AGS (restauração de expressão EMX2 nestes in vivo Os tumores também foi confirmada por Western) (Figura 6D). Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstram um potencial terapêutico de EMX2 entregues por adenovírus para tratar o câncer gástrico.}

Discussão

Os genes homeobox têm sido bem conhecido por sua importância no desenvolvimento durante décadas, enquanto o estudo de estes genes durante oncogênese ainda está em sua infância. gene homeobox expressões aberrantes foram documentados em vários cancros [32], [33], indicando que as alterações de expressão hemeobox pode ser importante para a oncogénese. Isto pode proporcionar uma base molecular para aplicações clínicas potenciais. No entanto, várias questões fundamentais ainda precisam ser totalmente resolvido, incluindo os mecanismos moleculares que conduzem a expressão aberrante, e os alvos a jusante e vias de sinalização que promovem a oncogênese. Neste estudo, nós fornecemos insights sobre essas questões, investigando EMX2 no cancro gástrico humano.

O nosso estudo relataram uma diminuição e perda de expressão EMX2 em linhas celulares de cancro gástrico e tecidos tumorais primárias significativa, e mostrou que a regulação baixa foi significativamente correlacionada com hiper-metilação do promotor EMX2, sugerindo silenciamento epigenético como um importante mecanismo de desregulação EMX2 no cancro gástrico humano. Com efeito, a modificação epigenética tem sido proposta como um mecanismo chave responsável pela regulação negativa homeobox genes ou silenciamento em outros tipos de tecido de cancro em que estes genes funcionam na supressão de tumores [14], [32]. Além disso, a nossa observação de dowregulation EMX2 na displasia gástrica não-invasivo suporta um possível papel importante de EMX2 na progressão patológica do câncer gástrico humano. Uma limitação do nosso estudo é o número de amostras de tecido analisado. Um número maior de amostras de doentes devem ser examinados para validar ainda mais a descoberta de metilação-silenciamento de EMX2 no câncer gástrico. No entanto, nossos resultados fornecem uma primeira evidência direta para apoiar este mecanismo em câncer gástrico e identificar EMX2 como novo supressor tumoral putativo no câncer gástrico.

Além disso, investigamos as vias oncogênicas importantes através do qual EMX2 funcionavam no câncer gástrico , e descobriu que via de sinalização Wnt pode desempenhar um papel-chave mediando a função EMX2. Nós ilustrada em ensaios de proliferação que expressão elevada de EMX2 exógeno significativamente o crescimento suprimido de linhas celulares de cancro gástrico sem expressão de gene endógeno (células AGS e MKN28), consistentes com relatos anteriores de que a diferença na expressão EMX2 está negativamente correlacionada com a proliferação de outros tipos de células de cancro [ ,,,0],24], [25]. Também demonstramos que via de sinalização Wnt foi drasticamente inibida por EMX2 in vivo
e in vitro
, fornecendo mais evidências de que via de sinalização Wnt pode mediar a função de EMX2 no câncer como proposto anteriormente [22 ].

Finalmente, nossos resultados indicam o potencial da utilização da terapia genética EMX2 para o tratamento de câncer gástrico. A infecção de tumores com Ad-EMX2 suprimiu significativamente a proliferação e, mais importante, a melhoria da sobrevivência global. É digno de nota que o sistema de libertação foi utilizado para o tratamento era de adenovirus recombinante de serotipo 5 (Ad5), o vector mais frequentemente utilizada em vários tipos de terapia genética do cancro [11], [12], [34], [35]. Comparado com vectores virais adeno-associados (AAV) e sistemas de entrega retrovirais, vectores adenovirais, tais como Ad5, claramente têm muitas vantagens. Por exemplo, vectores adenovirais têm amplo tropismo permitindo eficiente segmentação em muitos tecidos de interesse, uma grande capacidade de carga e alta transdução de eficiência relativa ao sistema de AAV [10] e também um não-integração de características que de outra forma induzir o risco de mutagénese aleatória de genoma [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Além disso, os vectores adenovirais podem ser manipuladas para os vírus oncolí ticos cancerosas selectivo [39], [40], [41], que são críticas para a aplicação clínica de terapia genética do cancro. No entanto, ainda existem muitos desafios da utilização de vectores de adenovírus para entregar terapias genéticas em pacientes. Por exemplo, eles podem ser rapidamente perdido a partir de células que se dividem rapidamente após a infecção. Outros factores que afectam a aplicação clínica de entrega adenoviral incluem a capacidade de empacotamento e gama de hospedeiros de vectores adenovirais, o seu perfil de expressão do gene e a tendência para provocar respostas imunes, particularmente importante se a administração repetida é necessária [42], [43]. No entanto, a In vivo
estudo da infecção ad-EMX2 sugere que a terapia genética EMX2 pode ter potencial para se tornar uma estratégia terapêutica anti-tumor clínica para o tratamento do cancro gástrico no futuro.

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