PLoS ONE: Adenoviren Lieferung des EMX2 Gene Unterdrückt Wachstum in menschlichen Magen Cancer

Abstrakt

Hintergrund

EMX2 ist ein menschliches Ortholog des Drosophila
leer spiracles Homöoboxgens Dies wurde in der Embryogenese beteiligt. Neuere Studien legen nahe mögliche Beteiligung von EMX2 in menschlichen Krebserkrankungen; jedoch muss die Rolle der EMX2 in der Karzinogenese weitere Exploration.

Ergebnisse |

In dieser Studie haben wir berichtet, dass die Herunterregulierung der EMX2 Expression signifikant mit EMX2 Promotor-Hypermethylierung in Magenkrebs korreliert. Wiederherstellen EMX2 Expression eines Adenovirus-Abgabesystem in Magenkrebs-Zelllinien fehlt endogenen EMX2-Expression unter Verwendung führte zur Hemmung der Zellproliferation und Wnt-Signalweg sowohl in vitro als auch in einem Modell Magenkrebs Xenotransplantat in vivo. Darüber hinaus beobachteten wir, dass mit dem Adenovirus EMX2 Expressionsvektor behandelten Tiere als signifikant besseres Überleben hatte mit leeren Adenovirus-Vektor behandelt.

Fazit

Unsere Studie legt nahe, dass EMX2 ein mutmaßliches Tumorsuppressor ist menschlichen Magenkrebs. Das Adenovirus-EMX2 können als neuartige Gentherapie zur Behandlung von Patienten mit Magenkrebs Potenzial haben

Citation:. Li J, Mo M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) adenoviralen Lieferung des EMX2 Gene Unterdrückt Wachstum in der menschlichen Magenkrebs. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10.1371 /journal.pone.0045970

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Empfangen: 13. April 2012; Akzeptiert: 23. August 2012; Veröffentlicht am: 21. September 2012

Copyright: © Li et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit die National Natural Science Foundation of China (31170732), der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (Y2101329) und die Habilitations Wissenschaft wurde durch Mittel aus dem National Key Grundlagenforschung und Entwicklung (973) Programm von China (2011CB910800 und 2012CB917304) unterstützt wird, Gründung der Provinz Zhejiang (2010-BSH-031). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart und zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt [1], [2], [3]. Obwohl die globale Inzidenz zurückgegangen ist, bleibt die Inzidenz noch hoch in den asiatischen Ländern [2], [4], [5]. Die meisten Patienten mit Magenkrebs sind im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert [6]. Trotz der Verbesserung der Behandlungsstrategien [7], [8], 5-Jahres-Überleben von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs, die konventionellen Therapien erhalten bleibt weniger als 30% [4]. Daher werden alternative Ansätze dringend erforderlich.

Die Gentherapie, einschließlich viralen und nicht-viralen Gen-Delivery-System, ein vielversprechender Ansatz für die Krebsbehandlung [9]. Unter allen derzeit verfügbaren System, sind rekombinante Adenovirus (Ad) Vektoren besonders vielversprechend. Die Vorteile von Ad Vektoren umfassen die Fähigkeit, hohe Titer zu erzeugen, die Fähigkeit, Zellen effizient, Genomstabilität und geringe Mengen an DNA-Integration in Wirtsgenom [9], [10] zu infizieren, Dividieren und sich nicht teil. Es wurde berichtet, dass die Wiederherstellung von Genen durch diesen Ansatz zur Tumorregression führt und induziert Apoptose in vivo
ohne normales Gewebe [11] zu beeinflussen, [12], [13].

EMX2, der menschliche Ortholog des Drosophila
leer Stigmen (ems) Homöoboxgens, gehört zu der Homeobox-Gen-Familie, die Transkriptionsregulationsproteine ​​(Homeoprotein) von wesentlicher Bedeutung für viele Aspekte des Wachstums und der Differenzierung [14] kodiert. EMX2 spielt eine wichtige Rolle bei der Gehirn [15] und die Entwicklung des Skeletts [16]. Mäuse beherbergen zeigen homozygote EMX2 Mutationen dramatische Verringerung der Größe Schwanzmedialen Bereichen wie Occipitalrinde und Hippocampus [17], [18], [19]. Eine Störung der EMX2 Ausdruck kann die Proliferationsrate von adulten neuralen Stammzellen [20] zu ändern. EMX2 steuert auch Säugetier Reproduktion von Endometrium-Zellproliferation Anpassung ohne Differenzierung zu bewirken [21].

Neuere Studien legen nahe mögliche Beteiligung von EMX2 in menschlichen Krebserkrankungen [22], [23], [24], [25]. Zum Beispiel hat EMX2 als Tumorsuppressor in Lungenkrebs nachgewiesen wurde, und niedrige EMX2 Expression assoziiert mit einer verringerten Gesamtüberleben und Rezidivfreie Überleben bei Patienten mit Lungenadenokarzinomen [22], [23]. Es wird auch berichtet, dass EMX2 Expression in normalen Endometriums postmenopausaler Frauen reichlich vorhanden ist, aber nicht vorhanden oder in endometrialen Tumoren reduziert und EMX2 Pegel negativ mit Proliferation [24], korrelierten [25]. Darüber hinaus kann EMX2 tumorigenesis durch Wnt-Signalweg reguliert, ein kritischer Weg Regulierung des Zellschicksals Bestimmung, Gewebeentwicklung und tumorigenesis [26], [27], [28]. EMX2 wird als direkter Repressor der Wnt1 Ausdruck und Klopfen-down von EMX2 Gen induziert in der Entwicklung Telenzephalon und kortikale Dysplasie [29] ektopische Expression von Wnt1 gefunden. Epigenetische Inaktivierung des EMX2 Expression kann für abweichende Aktivierung des Wnt-Signal bei Lungenkrebs, und damit die Proliferation und Metastasierung [22] von Bedeutung sein. Allerdings müssen die Funktion von EMX2 während tumorigenesis und entsprechenden Mechanismus noch weiter aufgeklärt werden. In dieser Studie berichten wir EMX2 als putative Tumorsuppressor in menschlichen Magenkrebs. Wir zeigen die EMX2 Herabregulation und ihre Korrelation mit Methylierungsstatus des Gens Promotorregion in Magenkrebs. Wir zeigen auch, dass die Wiederherstellung der EMX2 ein adenovirales Abgabesystem unter Verwendung hemmt die Zellproliferation und Wnt-Signal In-vitro-
, und führt zu einer besseren Überleben eines Magenkrebs Xenograftmodell in vivo
. Unsere Daten deuten darauf hin, stark, das therapeutische Potenzial der Verwendung des Ad-EMX2 als Gentherapie für die zukünftige Behandlung von Patienten mit Magenkrebs.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Xuanwu Hospital, Capital Medical University in Peking zugelassen. Eine schriftliche Einverständniserklärung von der Ethikkommission genehmigt, für jeden Patienten vor der Gewebeprobenentnahme erhalten.

Zellkultur, 5-Aza-2'-Desoxycytidin (DAC) /Trichostatin A (TSA) Behandlung und Gewebeproben

menschlichen Magenkrebszelllinien (AZ521, AGS und MKN28) wurden aus China Center for Type Culture Collection (Wuhan, China) erhalten. Zellinien wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, Penicillin und Streptomycin bei 37 ° C in einem feuchten Inkubator mit 5% CO _{2. Um zu analysieren, die Wiederherstellung der EMX2-Gens wurden die Zellen mit 4 &mgr; M DAC oder 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) behandelt für 4 Tage, mit dem Austausch von frischem Medium die gleiche Dosis von DAC oder TSA jeden Tag enthält. Die Kontrollzellen wurden mit frischem Medium DMSO enthält. Zellen wurden folglich für DNA /RNA-Extraktion geerntet.}

Insgesamt 20 Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben Blöcke (10 Magenkrebsgewebe und 10 angrenzenden normalen Geweben) sowie Gesamt-RNA aus 15 Magen Dysplasie Proben und 20 Magenkrebs chirurgische Proben wurden von Xuanwu Hospital, Capital Medical University in Peking erhalten. Die Gesamt-RNA und genomische DNA aus menschlichen adulten normalen Magen-Gewebe extrahiert wurden aus Biochain (Hayward, CA, USA) erworben.

DNA-Konstrukten

TOPFLASH /Fopflash Reporter enthält Wildtyp und Mutante TCF /LEF Bindungsstellen wurden jeweils mit freundlicher Unterstützung von Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, China) zur Verfügung gestellt. Eine Mutante CTNNB1 (S45Y) cDNA-Konstrukt wurde auch freundlicherweise von Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, China). Rekombinante Adenovirus-Vektoren exprimieren EMX2 und der Steuervektor wurden von Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA).

Methylierungs-spezifische PCR (MSP) und Bisulfit-Sequenzierung (BS)

die Bisulfit-Konvertierung von Geweben und Zellen wurden ohne die Voraussetzung für die DNA-Reinigung unter Verwendung von DNA-Methylierungs-EZ-Direct Kit (Zymo, orange, CA, USA) durchgeführt. Die FFPE Gewebe wurden zuerst de-paraffinized in Xylol (Sigma) und in abgestuften Ethanol rehydratisiert vor Bisulfit-Behandlung pro Herstelleranweisungen. Für MSP wird modifizierte DNA unter Verwendung von MSP-Primer amplifiziert (siehe unten), die speziell entweder den methylierten oder unmethylierten EMX2 Promotor-Sequenzen nach Bisulfit-Behandlung anerkannt. PCR wurde in einem Endvolumen von 20 ul, enthaltend 1 × MSP-Reaktionspuffer [30] ausgeführt, 0,5 uM von jedem Primer und 1 U von Zymo Taq
™ DNA Polymerase (Zymo). PCR-Bedingungen waren wie folgt: 10 min bei 95 ° C; 40 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 50 ° C und 30 bei 72 ° C; und 7 min abschließende Extension bei 72 ° C. Für BS, Amplifikation von Bisulfit-umgewandelte DNA wurde in einem Endvolumen von 50 &mgr; l, enthaltend 1 &mgr; M jedes Primers und BS 2 U von Zymo Taq
™ DNA Polymerase durchgeführt wird. PCR-Bedingungen waren wie folgt: 10 min bei 95 ° C; 40 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 40 s bei 55 ° C und 1 min bei 72 ° C; und 7 min abschließende Extension bei 72 ° C. Die PCR-Produkte wurden kloniert in PMD-18T (Takara, Dalian, China). Entweder 5 oder 3 zufällig ausgewählte positive Klone aus jeder Gruppe wurden in Shanghai Invitrogen (Shanghai, China) sequenziert. Die Primer waren wie folgt:

MSP-M (vorwärts): 5 'TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3'

MSP-M (rückwärts): 5 'GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3'

MSP-U (vorwärts): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '

MSP-U (rückwärts): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'

BS-A (vorwärts): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '

BS-A (Rückseite): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'

BS-B (vorwärts): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '

BS-B (rückwärts): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '

Immunhistochemie (IHC)

IHC folgenden Standardprotokoll durchgeführt wurde. Antikörper, die in der Studie eingeschlossen Maus anti-human Ki67 (1:100; BD, San Jose, CA, USA) und Maus-anti-human EMX2 (1:500; Pierce, Rockford, IL, USA) und Alexa 594-konjugiertes Ziege-anti-Maus-Sekundärantikörper (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Die Objektträger wurden auch mit hochest 33342 (Invitrogen) gegengefärbt. Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop (Oberkochen, Deutschland) wurde verwendet, um die Färbung zu untersuchen. Die Intensität der Ki67 wurde mit Bild Pro® Plus-quantifiziert. EMX2 Färbung wurde mit Histostain Plus-DAB-Kit (breites Spektrum, Invitrogen) visualisiert gemäß Herstellerangaben, mit Hämatoxylin gegengefärbt (Sigma) und fotografierte eine Leica SCN400 Dia-Scanner (Leica, Deutschland) mit.

Luciferase Assay

Die Zellen in einer Dichte von 5 x 10 ^{3 pro Well in 24-Well-Platten vor der Transfektion ausgesät. TOPFLASH oder Fopflash Plasmide wurden co-transfiziert mit PRL-TK-Plasmid. Nachdem die Zellen für 18 Stunden kultiviert wurden, wurde die Luciferase-Aktivität durch Doppel-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA) gemessen. Das Verhältnis zwischen Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität (TOPFLASH /Fopflash) und Renilla-Aktivität wurde für TCF /LEF-Transkriptionsaktivität verwendet.}

Immunoblotting

Sowohl Gesamtprotein (20 ug) und Cytoplasma-Extrakte (40 ug) wurden Immunblotting unterzogen. Die primären Antikörper enthalten anti-EMX2 (1:500; Pierce), anti-β-Actin (1:5000; Sigma), anti-Cyclin D1 (1:500; BD) und Anti-c-Myc (1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

Proliferationstest

Das Zellwachstum wurde durch CellTiter 96 Wässrige Proliferation Assay Kit (Promega) bestimmt. Die Zelllinien wurden ausplattiert in 96-Well-Kulturplatten mit der Anzahl von 5 × 10 ^{2 Zellen /Vertiefung. Nachdem die Zellen 0 Tage kultiviert wurden, 2, 3 und 4 wurden die MTS-Lösungen für 1,5 h in das Medium gegeben und inkubiert. Die Absorption bei 490 nm wurde unter Verwendung von Mikroplatten-Reader-Modell gemessen 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).}

Koloniebildungstest

Die Zellen (1 × 10 ^{3) infiziert mit Adenovirus-Vektor exprimieren EMX2 oder leeren Vektor wurden in dreifacher Ausfertigung in 100-mm-Schalen ausgesät. Frisches Medium wurde alle 3 Tage gewechselt. Nach kultiviert für 3-4 Wochen, für 10 min gewaschen Zellen wurden mit PBS, gefärbt mit 0,1% Kristallviolett für 20 min und fotografiert mit 4% Paraformaldehyd fixiert.}

RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-Reverse Transkription PCR (RT-PCR)

RNA-Extraktion und Echtzeit-RT-PCR durchgeführt wurden, wie zuvor beschrieben [31]. Die Primer-Sequenzen wurden zuvor beschrieben [22].

Tiermodell und adenoviraler Vektor Lieferung

Alle Mäuse Experimente wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Tieranlage der Tsinghua-Universität durchgeführt und von der Institutional genehmigt Animal Care und Use Committee der Tsinghua-Universität. Magenkrebs Xenotransplantate wurden gegründet in 5 Wochen alten weiblichen Balb /c Nacktmäusen. Kurz gesagt, nach der zu kulti Konfluenz wurden MKN28 oder AGS Zellen trypisnized und in PBS (pH 7,4) und dann vermischt 1.01 (v /v) resuspendiert, mit Matrigel (Vigorous) bei 4 ° C einer Maus in einem Gesamtvolumen von einzuspritzen 150 &mgr; l. Die Mischung wurde s.c. in die rechte Flanke von 16 weiblichen Mäusen injiziert mit 10 ^{7 Zellen pro Maus (Tag 0). Am Tag 7 Mäuse lokalen Tumore tragen lag im Bereich von 50 bis 100 mm 2 eine direkte intratumorale Injektion von 1 empfangen × 10 9 plaquebildenden Einheiten des angegebenen Adenovirus (verdünnt mit PBS in einem Gesamtvolumen von 100 &mgr; l). Die Tumorbildung wurde für bis zu 1 ½ Monaten überwacht. Die Tumorgröße wurde unter Verwendung von Dicke und bestimmt, gemessen durch um 0,5 × Breite Multiplikation 2 × Länge. Die Kaplan-Meier-Verfahren wurde zur Abschätzung Überleben der beiden Gruppen der behandelten Tiere verwendet. Nach Beendigung des Experiments wurden die Tumore aus jeder Behandlung wurden in 10% gepuffertem Formalin, in Paraffin eingebettet gesammelt und geschnitten in 5 &mgr; m dicke Scheiben für weitere Ki-67-Detektion. Cytosolproteine ​​und Ganzzelllysat wurden auch von diesen Tumoren für die Western-Analyse extrahiert.}

Statistische Analyse

Alle Daten berechnet wurden als Mittelwert ± Standardabweichungen. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit einem zweiseitigen Student-t-Test verglichen. A P
Wert von 0,05 oder weniger wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse |

Das Herunterregulieren von EMX2 in menschlichen Magenkrebs

Wir untersuchten EMX2 Ausdruck in neun menschlichen Zelllinien Magenkrebs, sowie Tumor und benachbarten normalen Geweben gepaart von zehn Patienten mit Magenkrebs (Abbildung 1). Verwendung von Echtzeit-RT-PCR, fanden wir, dass die Expression von EMX2 deutlich in acht der neun Zelllinien herunterreguliert wurde, als zu untersuch dass im Vergleich in normalem Magengewebe (P < 0,01, 1A). Auf der anderen Seite, AZ521 einer Zelllinie zeigte eine ähnliche Höhe der EMX2 Ausdruck wie in normalen Kontrolle (1A). Um EMX2 Proteinexpression in Patienten Gewebeproben zu detektieren, die Immunhistochemie (IHC) wurde durchgeführt, und die Intensität der IHC-Färbung wurde durch Bild Pro® plus quantifiziert. Alle zehn analysierten Proben wurden gefunden Geweben zeigen entweder fehlende EMX2 Expression oder verringerte Mengen an EMX2 Expression in Krebs im Vergleich zu ihren normalen Gegenstücken (P < 0,01, 1B). Um die mögliche Rolle von EMX2 in pathologischen Progression humaner Magenkrebs etablieren, analysierten wir EMX2 Expression unter Verwendung von Gesamt-RNA, die wir von fünfzehn Magen Dysplasie Proben zwanzig Magenkrebs chirurgischen Proben erhalten. Wir fanden heraus, dass EMX2 Expression signifikant in Dysplasie Proben (P < 0,05) nach unten reguliert wurde. Und fast in Krebsproben im Vergleich zu derjenigen bei erwachsenen normalen Magengewebe (Abbildung 1C) verloren, was darauf hindeutet, dass EMX2 Herabregulation bei nicht-invasive Präkanzerose auftreten könnte

Korrektur zwischen EMX2 Expression und der Status-Promotor-Methylierung

Wir Methylierungsstatus des EMX2 Promoter Magenkrebszelllinien und normalen Magen-Gewebe untersucht in neun. Regionen von CpG-Inseln (CGI) wurden mit MethPrimer von -800 bis -470 und -55 bis 459 relativ zu den erwarteten Transkriptionsstartstellen (+1) von EMX2 Gens (2A) identifiziert. Methylierungszustand wurde unter Verwendung von Bisulfit-Sequenzierung (BS) (2B) und methylierungsspezifische PCR (MSP) (2C-2D) analysiert. Unsere BS und MSP Ergebnisse zeigten, dass der EMX2-Promotor in normalen Magen-Gewebe und AZ521 Zellen war nicht methylierten, während in den anderen acht Zelllinien untersucht sie dicht methyliert wurde (2B-2C). Diese Ergebnisse sind konsistent mit den EMX2 Expressionsniveaus in diesen Zelllinien: high in normalem Gewebe und AZ521, aber niedrig in den anderen acht Zelllinien untersucht. Eine Mischung aus methylierter und nicht methylierter Band wurde in mehreren Zelllinien, einschließlich MKN28, N87 und SNU16 anzeigt, teilweise Methylierung gefunden. Des Weiteren fanden wir, dass Methylierungsstatus des Patienten Gewebeproben von MSP offenbart mit den EMX2 Expressionsspiegel in den Proben (2D konsistent ist, vier der zehn Paare von Gewebeproben aufgrund der Nichtverfügbarkeit von den anderen sechs Paare von genomischer DNA untersucht wurden, ). Diese Daten legen nahe, dass die Herunterregulierung von EMX2 Ausdruck ein Ergebnis seiner Promoter Hypermethylierung in Magenkrebs sein kann.

weiter auf die Korrelation zwischen EMX2 Expression und der Promotor-Methylierung zu untersuchen, behandelten wir MKN28 und AGS-Zelllinien mit einem Methyltransferase-Inhibitor DAC und ein Inhibitor TSA-Histon-Deacetylase. Die Zelllinie AZ521 wurde als eine negative Kontrolle als Promotorregion unmethyliert ist. Wir beobachteten, dass die unmethylation spezifische Bande deutlich erhöht war (3A) mit Ebenen EMX2 Expression hochreguliert entsprechend (3B) auf DAC Behandlung in beiden AGS und MKN28-Zellen, während die Zellen in AZ521 unverändert (Abbildung 3). Die Behandlung der TSA hatte minimale Auswirkungen auf sowohl Methylierungsstatus und EMX2 Expressionsniveaus. Zusammengenommen unsere Ergebnisse deuten darauf hin die Herunterregulierung der EMX2 Expression signifikant mit dem EMX2 Promotor-Hypermethylierung in menschlichen Magenkrebs korreliert.

Hemmung des Zellwachstums von Adenovirus-gelieferten EMX2 in vitro

Als nächstes untersuchten wir die Rolle der EMX2 auf das Zellwachstum von Magenkrebszellen. Das Wachstum von AGS und MKN28 Zellen wurde deutlich bei der Infektion unterdrückt mit Adenovirus exprimieren EMX2 (Ad-EMX2), verglichen mit einem leeren Vektor-Kontrolle (Ad-ctrl) (P < 0,001, 4A), während das Wachstum von AZ521 Zellen nicht betroffen war (P > 0,05, 4A). Diese Beobachtungen wurden durch Koloniebildungstest (4B) bestätigt. Unsere Ergebnisse zeigen die Anti-Proliferation Funktion von EMX2 in Magenkrebszellen

Unterdrückung der Wnt-Signalweg von Adenovirus-gelieferten EMX2

Die Funktion der EMX2 hat Wnt-Signalweg in Verbindung gebracht worden. Daher untersuchten wir die Beziehung zwischen EMX2 und Wnt-Signal bei Magenkrebs. Wir haben ein TOPFLASH /Fopflash Reportertest TCF /Lef-Transkriptionsaktivität durch kanonische Wnt-Signalweg reguliert zu messen. Wir fanden, dass TCF /LEF-abhängige Transkriptionsaktivität signifikant von Ad-EMX2 in AGS und MKN28 Zellen ohne endogene EMX2 Expression inhibiert wurde (P < 0,05), aber nicht in AZ521-Zellen, die endogene EMX2 (P > 0,05, 5A). Konsequent, Proteinspiegel von cytosolischen β-Catenin und kanonischen Wnt-Signalweg nachgeschaltete Ziele c-myc und Cyclin D1 in diesen AGS und MKN28-Zellen, infiziert mit Ad-EMX2 unterdrückt wurden, aber nicht in AZ521-Zellen (Wiederherstellung der EMX2 Expression in diesen Zelllinien nach ad-EMX2 Infektion durch Western bestätigt wurde) (5B). Zur weiteren Untersuchung der Relevanz der Wnt-Signalweg Herunterregulierung und Proliferation Unterdrückung von Ad-EMX2, wir transfiziert und exprimiert stabilisierte β-Catenin (S45Y Mutation) in diesen Magenkrebszellen infiziert mit Ad-EMX2. Wir beobachteten, dass Überexpression β-Catenin signifikant die Wachstumsunterdrückungswirkung von Ad-EMX2 in beiden AGS und MKN28-Zellen attenuiert (P < 0,01), aber nicht in AZ521-Zellen (5C). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse eine wichtige Rolle von EMX2 bei der Unterdrückung der Wnt-Signalweg bei Magenkrebs.

Unterdrückung von Magenkrebs Wachstum von Adenovirus-gelieferten EMX2 in vivo

Wir die MKN28 gegründet und AGS Xenotransplantatmodellen das therapeutische Potenzial von Adenovirus-gelieferten EMX2 für Magenkrebs in vivo
zu erkunden. Eine Woche nach der Inokulation, Mäuse lokalen Tumore tragen im Bereich von 50 bis 100 mm ^{2 erhielt eine direkte intratumorale Injektion von 1 × 10 9 plaquebildenden Einheiten des angegebenen Adenovirus. Wachstum von Tumoren in Ad-EMX2 infizierten Mäuse waren deutlich langsamer als die in der Kontrollgruppe (P < 0,05, 6A links zwei Tafeln). Nach Beendigung des Massenexperiment Tumor in Ad-EMX2 infizierten Mäusen auch deutlich geringer als in der Kontrollgruppe (P < 0,05 für MKN28 Tumor, P < 0,01 für AGS Tumor, 6A rechts). Färbeintensität einer proliferativen Markers Ki67 von Tumorproben bei Beendigung des Versuchs zeigte, daß die Lieferung von Ad-EMX2 signifikant die Ki-67 verminderte Färbung (P < 0,01, 6B), was darauf hindeutet Zellproliferationshemmung in Tumoren. Außerdem Überleben des Ad-EMX2 infizierten Gruppe war signifikant besser als die der Kontrollgruppe (P = 0,014, Figur 6C). In Übereinstimmung mit unserer In-vitro-
Analyse, cytosolische β-Catenin und kanonische Wnt-Signalweg Downstream-Targets c-myc und Cyclin D1 wurden auch in Ad-EMX2 downregulated infizierten MKN28 und AGS Tumoren (Wiederherstellung der EMX2-Expression in diesen in vivo Tumoren auch durch Western) (6D) bestätigt wurde. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse ein therapeutisches Potential von Adenovirus-gelieferten EMX2 Magenkrebs zu behandeln.}

Diskussion

Homeobox-Gene wurden für seine Bedeutung in der Entwicklung seit Jahrzehnten gut bekannt, während die Untersuchung der diese Gene während der Onkogenese ist noch in den Kinderschuhen. Aberrant homeobox Genexpressionen wurden in verschiedenen Krebsarten [32], [33], was anzeigt, die Änderungen von hemeobox Ausdrücke möglicherweise wichtig für Onkogenese dokumentiert. Dies kann eine molekulare Basis für mögliche klinische Anwendungen. Allerdings müssen einige grundlegende Fragen umfassend angegangen werden, die molekularen Mechanismen, einschließlich, die die abweichenden Expression und nachgelagerten Ziele und Signalwege fahren, die Onkogenese fördern. In dieser Studie stellen wir Erkenntnisse zu diesen Fragen von EMX2 in der menschlichen Magenkrebs zu untersuchen.

Unsere Studie berichtete über eine signifikante Abnahme und der Verlust der EMX2-Expression in Magenkrebs-Zelllinien und Primärtumorgewebe und zeigte, dass die Herunterregulierung war signifikant mit Hypermethylierung des EMX2-Promotor, was darauf hindeutet, epigenetische Silencing als ein wichtiger Mechanismus für EMX2 Dysregulation in menschlichen Magenkrebs korreliert. Tatsächlich hat epigenetische Modifikation als ein Schlüsselmechanismus für Homeoboxgene Herabregulation oder Silencing in anderen Krebsgewebe Typen, bei denen diese Gene funktionieren in der Tumorunterdrückung [14], [32] vorgeschlagen. Darüber hinaus sind unsere Beobachtung EMX2 dowregulation in nicht-invasive Magen Dysplasie unterstützt eine mögliche wichtige Rolle bei pathologischen EMX2 Progression humaner Magenkrebs. Eine Einschränkung unserer Studie ist die Anzahl der Gewebeproben analysiert. Eine größere Anzahl von Patientenproben müssen die Feststellung von methylierungs Silencing EMX2 in Magenkrebs weiter zu validieren, zu untersuchen. Dennoch liefern unsere Ergebnisse einen ersten direkten Beweis dafür, diesen Mechanismus in Magenkrebs und identifizieren EMX2 als mutmaßliche neue Tumorsuppressor bei Magenkrebs zu unterstützen.

Darüber hinaus haben wir wichtige onkogenen Wege, über die EMX2 funktioniert bei Magenkrebs untersucht , festgestellt, dass Wnt-Signalweg eine zentrale Rolle der Vermittlung der EMX2-Funktion spielen. Wir veranschaulicht in Proliferationsassays, die eine hohe Expression von exogenen EMX2 signifikant unterdrückt das Wachstum von Magenkrebs-Zelllinien endogene Genexpression fehlt (AGS und MKN28-Zellen), was mit früheren Berichten, dass diese unterschiedliche EMX2 Expression negativ mit Proliferation in anderen Krebs-Zelltypen korreliert [ ,,,0],24], [25]. Wir zeigten auch, dass Wnt-Signalweg dramatisch durch EMX2 gehemmt wurde in vivo
und In-vitro-
, ein weiterer Beweis, dass Wnt-Signalweg die Funktion der EMX2 in der Krebs vermitteln kann, wie zuvor vorgeschlagen [22 ].

Schließlich unsere Ergebnisse das Potential der Verwendung EMX2 Gentherapie für die Behandlung von Magenkrebs anzeigt. Infektion von Tumoren mit Ad-EMX2 signifikant unterdrückt Proliferation und was noch wichtiger ist, eine verbesserte Gesamtüberleben. Es ist bemerkenswert, dass das Liefersystem, das wir für die Behandlung verwendeten rekombinanten Adenovirus Serotyp 5 (Ad5) ist, das am häufigsten verwendete Vektor in verschiedene Arten von Krebs-Gentherapie [11], [12], [34], [35]. Verglichen mit adeno-assoziierter viraler (AAV) und retrovirale Zuführungssysteme, adenoviralen Vektoren, wie Ad5, haben deutlich viele Vorteile. Zum Beispiel haben Adenovirusvektoren breite Tropismus eine effiziente auf vielen Geweben von Interesse Targeting, eine große Nutzlast und hohe Transduktionseffizienz in Bezug auf AAV-System [10] und ein ebenfalls nicht-integrierenden Merkmale, die sonst das Risiko einer zufälligen Mutagenese von Genom [induzieren ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Darüber hinaus können adenovirale Vektoren zu Krebs-selektive onkolytische Viren konstruiert werden [39], [40], [41], die für die klinische Anwendung von Krebs-Gentherapie kritisch sind. Es gibt jedoch noch viele Herausforderungen der Verwendung von adenoviralen Vektoren Gentherapien bei Patienten zu liefern. Beispielsweise können sie schnell aus den Zellen verloren gehen, die schnell nach der Infektion unterteilen. Andere Faktoren, die klinische Anwendung von adenoviralen Lieferung umfassen Verpackungskapazität und Wirtsspektrum von Adenovirus-Vektoren, deren Genexpressionsprofil und die Tendenz zu beeinflussen, um Immunantworten auslösen, vor allem dann wichtig, wenn eine wiederholte Verabreichung erforderlich ist [42], [43]. Dennoch unsere in vivo
Studie von Ad-Infektion EMX2 legt nahe, dass EMX2 Gentherapie Potential kann eine klinische Antitumor therapeutische Strategie für die Behandlung von Magenkrebs in der Zukunft werden.

• PLoS ONE: Differential Expression von Phospholipase C Epsilon 1 ist im Zusammenhang mit chronischer atrophischer Gastritis und Magenkrebs
• PLoS ONE: Silencing von XB130 zugeordnet ist, sowohl die Prognose und Chemosensitivity von Magenkrebs