PLOS ONE: adenoviral Leverans av EMX2 Gene Undertrycker Tillväxten i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

EMX2 är en mänsklig ortologen av Drosophila
tom spiracles homeobox gen som har varit inblandad i embryogenes. Nyligen genomförda studier tyder på möjliga deltagande av EMX2 i humana cancerformer; Men vilken roll EMX2 i cancer behöver ytterligare prospektering.

Resultat

I denna studie, rapporterade vi att nedreglering av EMX2 uttryck var signifikant korrelerad med EMX2 promotor hypermethylation i magcancer. Återställa EMX2 expression med användning av ett adenovirus avgivningssystem i gastriska cancercellinjer som saknar endogent EMX2 uttryck ledde till hämning av cellproliferation och Wnt-signalväg både in vitro och i en magcancer xenograftmodell in vivo. Dessutom observerade vi att djur som behandlats med den adenovirala EMX2 expressionsvek hade signifikant bättre överlevnad än de som behandlades med tom adenovirusvektor.

Slutsats

antyder Vår studie att EMX2 är en förmodad tumörsuppressor i human magcancer. Den adenovirala-EMX2 kan ha potential som ett nytt genterapi för behandling av patienter med magcancer

Citation:. Li J, Mo M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) adenoviral Leverans av EMX2 Gene Undertrycker Tillväxten i Human magcancer. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10.1371 /journal.pone.0045970

Redaktör: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Mottagna: 13 april 2012, Accepteras: 23 augusti 2012; Publicerad: 21 september 2012 |

Copyright: © Li et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av medel från Nationalnyckeln grundläggande forskning och utveckling (973) Program Kina (2011CB910800 och 2012CB917304), National Natural Science Foundation i Kina (31.170.732), Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (Y2101329) och forskar Science Stiftelsen för Zhejiang-provinsen (2010-BSH-031). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är den fjärde vanligaste cancerformen och näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i världen [1], [2], [3]. Även om dess globala förekomsten har minskat, fortfarande förekomsten hög i asiatiska länder [2], [4], [5]. De flesta av gastric cancerpatienter får diagnosen i avancerade stadier [6]. Trots förbättringar i behandlingsstrategier [7], [8], 5-års överlevnad av patienter med avancerad magsäckscancer som fick konventionell behandling är fortfarande mindre än 30% [4]. Därför är alternativa metoder akut behov.

genterapi, inklusive virus och icke-viral gen leveranssystem, är en lovande metod för behandling [9] cancer. Bland alla tillgängliga system rekombinant adenovirus (Ad) vektorer är särskilt lovande. Fördelarna med Ad-vektorer inkluderar förmågan att producera höga titrar, förmåga att infektera dela sig och icke-delande celler effektivt, genomet stabilitet, och låga nivåer av DNA-integrering i värdgenomet [9], [10]. Det har rapporterats att återställning av gener genom denna metod leder till tumörregression och inducerar apoptos In vivo
utan att påverka normala vävnader [11], [12], [13]

EMX2., den mänskliga ortolog av Drosophila
tomma spiracles (EMS) homeobox genen tillhör homeobox genfamiljen som kodar för transkriptionsreglerande proteiner (Homeoprotein) är väsentliga för många aspekter av tillväxt och differentiering [14]. EMX2 spelar en viktig roll under hjärnan [15] och skelettutveckling [16]. Möss som härbärgerar homozygota EMX2 mutationer uppvisar dramatisk storleksminskning av stjärt-mediala områden inklusive occipital cortex och hippocampus [17], [18], [19]. Störning av EMX2 uttryck kan förändra proliferationshastigheten av vuxna neurala stamceller [20]. EMX2 kontrollerar också däggdjur reproduktion genom att justera endometrial celltillväxt utan att påverka differentiering [21].

Nya studier tyder på möjliga deltagande av EMX2 i humana cancerformer [22], [23], [24], [25]. Till exempel har EMX2 visats som en tumörsuppressor vid lungcancer, och låg EMX2 uttryck associeras med minskad total överlevnad och återfall överlevnad hos patienter med lung adenokarcinom [22], [23]. Det har också rapporterats att EMX2 uttrycket är rikligt förekommande i normal endometrium av postmenopausala kvinnor men frånvarande eller minskas i endometriala tumörer, och EMX2 nivåer är negativt korrelerade med spridning [24], [25]. Dessutom kan EMX2 reglera tumörbildning genom Wnt-signalväg, en kritisk väg reglerar determinering, vävnadsutveckling och tumörbildning [26], [27], [28]. EMX2 återfinns som en direkt repressor av Wnt1 uttryck, och knackar ner av EMX2 genen inducerar ektopisk expression av Wnt1 i utvecklings telencephalon och kortikal dysplasi [29]. Epigenetisk tystande av EMX2 expression kan vara viktigt för avvikande aktivering av Wnt-signalering i lungcancer och åtföljande proliferation och metastas [22]. Men funktion EMX2 under tumörbildning och motsvarande mekanism fortfarande behöver belysas ytterligare. I denna studie rapporterar vi EMX2 som en förmodad tumörsuppressor i human gastric cancer. Vi demonstrerar EMX2 nedreglering och dess korrelation med metyleringsstatus av genen promotorregionen i magcancer. Vi visar också att återställande av EMX2 använder en adenoviral leveranssystem hämmar celltillväxt och Wnt signalering In vitro
, och resulterar i bättre överlevnad av en magcancer xenograft modell In vivo
. Våra data tyder starkt på den terapeutiska potentialen att använda Ad-EMX2 som genterapi för framtida behandling av patienter med magsäckscancer.

Material och metoder

Etik Statement

Denna studie godkändes av den etiska kommittén i Xuanwu sjukhus, Capital Medical University i Peking. Ett skriftligt informerat samtycke som godkänts av den etiska kommittén, erhölls för varje patient före vävnadsprovtagning.

Cell Culture, 5-aza-2'-deoxicytidin (DAC) /trichostatin A (TSA) Behandling och vävnads~~POS=TRUNC

mänskliga gastric cancercellinjer (AZ521, AGS och MKN28) erhölls från Kina Center for Type Culture Collection (Wuhan, Kina). Cellinjer odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 10% fetalt bovinserum, penicillin och streptomycin vid 37 ° C i en fuktig inkubator med 5% CO _{2. För att analysera restaurering av EMX2 genen behandlades celler med 4 | iM DAC eller 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) under 4 dagar, med byte av färskt medium innehållande samma dos av DAC eller TSA vardagliga. Kontrollceller odlades med färskt medium innehållande DMSO. Cellerna därför skördas för DNA /RNA-extraktion.}

Totalt 20 formalinfixerade paraffininbäddade vävnader block (10 magcancer vävnader och 10 närliggande normala vävnader), samt total RNA från 15 gastric dysplasi prover och 20 magcancer kirurgiska prover erhölls från Xuanwu sjukhus, Capital Medical University i Peking. Totalt RNA och genomiskt DNA som extraherats från human vuxen normala gastriska vävnader köptes från BioChain (Hayward, CA, USA).

DNA-konstruktioner

Topflash /Fopflash reportrar innehållande vildtyp och mutant TCF /LEF bindningsställen respektive tillhandahölls vänligen av Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, Kina). En mutant CTNNB1 (S45Y) cDNA konstruktionen också vänligen tillhandahållen av Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, Kina). Rekombinanta adenovirusvektorer som uttrycker EMX2 och styrvektorn köptes från Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA).

Metylering-specifik PCR (MSP) och Bisulfite Sequencing (BS) Review

bisulfit konvertering från vävnader och celler utfördes utan en förutsättning för DNA-rening med hjälp av EZ DNA-metylering-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). De FFPE vävnader var första de-paraffinized i xylen (Sigma) och rehydreras i graderade etanol, före bisulfit behandling per tillverkarens instruktioner. För MSP, modifieras DNA amplifieras med användning av MSP primers (se nedan) som är speciellt erkända antingen metylerade eller ometylerade EMX2 promotorsekvenser efter bisulfit behandling. PCR kördes i en slutlig volym av 20 pl innehållande 1 × MSP-reaktionsbuffert [30], 0,5 pM av varje primer och 1 U av Zymo Taq
™ DNA-polymeras (Zymo). PCR villkor var enligt följande: 10 min vid 95 ° C; 40 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid 50 ° C och 30 vid 72 ° C; och 7 min slutlig förlängning vid 72 ° C. För BS, amplifiering av bisulfit-konverterade DNA utfördes i en slutlig volym av 50 ^ il innehållande 1 ^ M av varje BS primer och 2 U av Zymo Taq
™ DNA-polymeras. PCR villkor var enligt följande: 10 min vid 95 ° C; 40 cykler av 30 s vid 95 ° C, 40 s vid 55 ° C och 1 min vid 72 ° C; och 7 min slutlig förlängning vid 72 ° C. PCR-produkterna klonades in i PMD-18T (Takara, Dalian, Kina). Antingen 5 eller 3 slumpmässigt utvalda positiva kloner från varje grupp sekvenserades i Shanghai Invitrogen (Shanghai, Kina). Primrar var enligt följande:

MSP-M (framåt): 5'-TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 '

MSP-M (bakåt): 5'- GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3'

MSP-U (framåt): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '

MSP-U (bakåt): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'

BS-A (framåt): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '

BS-A (bakåt): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'

BS-B (framåt): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '

BS-B (bakåt): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '

Immunohistokemi (IHC) Review

IHC utfördes efter standardprotokoll. Antikroppar som används i studien inkluderade mus-antihuman Ki67 (1:100, BD, San Jose, CA, USA) och mus-antihuman EMX2 (1:500, Pierce, Rockford, IL, USA), och Alexa 594-konjugerad get anti-mus sekundär antikropp (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Objektglasen också motfärgades med hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 konfokalmikroskop (Oberkochen, Tyskland) användes för att undersöka färgningen. Intensiteten av Ki67 kvantifierades med Image Pro® Plus. EMX2 färgning visualiserades med Histostain Plus DAB-kit (brett spektrum, Invitrogen) i enlighet med tillverkarens instruktioner, motfärgades med hematoxylin (Sigma), och fotograferades med användning av en Leica SCN400 slide scanner (Leica, Tyskland).

Luciferase Assay

Celler vid en densitet av 5 x 10 ^{3 per brunn såddes i 24-brunnsplattor före transfektion. Topflash eller Fopflash plasmider samtransfekterades med PRL-TK plasmid. Efter celler odlades under 18 timmar, var luciferasaktiviteten mättes genom Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA). Förhållandet mellan firefly luciferasaktivitet (Topflash /Fopflash) och Renilla aktivitet användes för TCF /LEF transkriptionsaktivitet.}

Immunoblotting

Både totalt protein (20 ug) och cytoplasma extrakt (40 mikrogram) utsattes för immunoblotting. De primära antikropparna inkluderade anti-EMX2 (1:500; Pierce), anti-β-aktin (1:5000; Sigma), anti-cyklin D1 (1:500; BD) och anti-c-Myc (1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

proliferationsanalys

Celltillväxt tillväxt~~POS=HEADCOMP bestämdes genom CellTiter 96 Aqueous Proliferation Assay Kit (Promega). Cellinjerna utströks i 96-brunnars odlingsplattor med antalet 5 × 10 ^{2 celler /brunn. Efter det att cellerna odlades i dagar 0, 2, 3 och 4, de MTS lösningarna sätts till mediet och inkuberas i 1,5 h. Absorbansen vid 490 nm mättes med användning av mikroplattläsare modell 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).}

kolonibildningsanalys

Celler (1 x 10 ^{3) infekterade med adenovirusvektor som uttrycker EMX2 eller tom vektor såddes i tre exemplar i 100 mm skålar. Färskt medium byttes var 3 dagar. Efter odlades under 3-4 veckor, fixerades celler med 4% paraformaldehyd under 10 min, tvättades med PBS, färgades med 0,1% kristallviolett i 20 minuter och fotograferades.}

RNA-extraktion och kvantitativ realtids omvänd transkription -PCR (RT-PCR) Review

RNA-extraktion och realtids-RT-PCR utfördes såsom tidigare beskrivits [31]. Primersekvenserna tidigare beskrivits [22].

djurmodell och adenovirusvektor Delivery

Alla möss experiment utfördes under specifika patogenfria förhållanden i djuranläggning Tsinghua University och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén Tsinghua University. Gastric cancer xenografter etablerades i 5 veckor gamla BALB /c-nakenmöss. Kortfattat, efter odlades till konfluens, MKN28 eller AGS-celler trypisnized och återsuspenderades i PBS (pH 7,4) och blandades därefter 01:01 (volym /volym) med matrigel (Kraftig) vid 4 ° C för att injicera en mus i en total volym av 150 ^. Blandningen s.c injicerades i högra flanken av 16 honmöss med 10 ^{7-celler per mus (dag 0). På dag 7, möss med lokala tumörer varierade från 50 till 100 mm 2 fick en direkt intratumoral injektion av 1 x 10 9 plackbildande enheter av den indikerade adenovirus (utspädd med PBS i en total volym av 100 | j, l). Den tumörbildning följdes i upp till 1 ½ månader. Tumörstorleken mättes med hjälp av skjutmått och bestäms genom att multiplicera med 0,5 x bredd 2 x längd. Kaplan-Meier-metoden användes för att uppskatta överlevnaden av de två grupperna av behandlade djur. Vid fullbordandet av experimentet, var tumörerna från varje behandlings uppsamlades i 10% buffrad formalin, inbäddades i paraffin och skars till 5 ^ m tjocka skivor för vidare Ki-67 detektering. Cytosoliska proteiner och hela cellysat också extraheras från dessa tumörer för Western-analys.}

Statistisk analys

Alla data beräknades som medel ± standardavvikelser. Skillnader mellan grupper jämfördes med ett dubbelsidigt Students t-test. En P
värde på 0,05 eller mindre ansågs vara betydande.

Resultat

nedreglering av EMX2 i Human Gastric Cancer

Vi undersökte EMX2 uttryck i nio humana gastriska cancercellinjer, samt tumörer och parade intilliggande normala vävnader från tio patienter med ventrikelcancer (Figur 1). Använda realtid RT-PCR, fann vi att uttryck av EMX2 signifikant nedregleras i åtta av de nio cellinjer undersöktes i jämförelse med den i normal gastrisk vävnad (P < 0,01, Figur 1A). Å andra sidan, en cellinje AZ521 visade liknande nivå av EMX2 uttryck som den i normal kontroll (Figur 1A). För att upptäcka EMX2 proteinuttryck i patientvävnadsprover, var immunohistokemi (IHC) utförs och intensiteten av IHC färgning kvantifierades från Image Pro® Plus. Alla tio analyserade proverna befanns uppvisa någon brist på EMX2 uttryck eller minskade nivåer av EMX2 uttryck i cancervävnader jämfört med deras normala motsvarigheter (P < 0,01, Figur 1B). För att fastställa eventuella roll EMX2 i patologisk progression av human magcancer, analyserade vi EMX2 uttryck med hjälp av total RNA som vi fått från femton gastric dysplasi prover och tjugo magcancer kirurgiska prover. Vi fann att EMX2 uttryck signifikant nedregleras i dysplasi prov (P < 0,05). Och nästan förlorat i cancerprover jämfört med hos vuxna normal mage vävnad (Figur 1C), vilket tyder på att EMX2 nedreglering kan inträffa vid icke-invasiv precancerösa stadium

Korrigering mellan EMX2 Expression och dess Promoter metylering status

Vi undersökte metylering status EMX2 promotorn i nio gastric cancercellinjer och normal gastrisk vävnad. Regioner i CpG-öar (CGI) identifierades med MethPrimer från -800 till -470 och -55 till 459 i förhållande till de förväntade transkriptionsstartställen (+1) av EMX2 genen (Figur 2A). Metyleringsstatus analyserades genom användning av bisulfit sekvensering (BS) (Figur 2B) och metylering-specifik PCR (MSP) (figurerna 2C-2D). Vår BS och MSP Resultaten visade att EMX2 promotorn i normala mag vävnad och AZ521 celler var ometylerade, medan de övriga åtta cellinjerna undersökte det tätt denaturerad (figurerna 2B-2C). Dessa resultat överensstämmer med de EMX2 expressionsnivåerna i dessa cellinjer: höga i normal vävnad och AZ521, men låg i de andra åtta cellinjerna som undersökts. En blandning av metylerade och ometylerade band återfanns i flera cellinjer inklusive MKN28, N87, och SNU16 indikerar partiell metylering. Dessutom fann vi att metylering status patientvävnadsprover avslöjade av MSP är förenlig med EMX2 uttrycksnivåer i dessa prov (Figur 2D, fyra av de tio par vävnadsprover undersöktes på grund av avsaknad av genomiskt DNA från de andra sex par ). Dessa data tyder på att nedreglering av EMX2 uttryck kan vara ett resultat av dess promotor hyper-metylering i magcancer.

För att ytterligare undersöka sambandet mellan EMX2 uttryck och promotorn metylering, behandlade vi MKN28 och AGS-cellinjer med en metyltransferas-inhibitor DAC och en histondeacetylasinhibitor TSA. Cellinjen AZ521 användes som en negativ kontroll som dess promotorregion är icke-metylerad. Vi observerade att unmethylation specifikt band ökade signifikant (figur 3A) med EMX2 uttrycksnivåer uppreglerade därefter (figur 3B) vid behandling DAC i både AGS och MKN28 celler, medan de i AZ521 celler förblev oförändrad (Figur 3). Behandlingen av TSA hade minimala effekter på både metyleringsstatus och EMX2 expressionsnivåer. Sammantaget våra resultat tyder starkt på nedreglering av EMX2 uttryck var signifikant korrelerad med EMX2 promotor hypermethylation i human magsäckscancer.

Hämning av celltillväxt av adenovirus-levererade EMX2 in vitro

vi undersökte nästa roll EMX2 på celltillväxt av gastric cancerceller. Tillväxten av AGS och MKN28 celler signifikant undertryckt vid infektion med adenovirus som uttrycker EMX2 (Ad-EMX2) jämfört med en tom vektorkontroll (Ad-ctrl) (P < 0,001, Figur 4A), medan tillväxten av AZ521 celler inte påverkades (P > 0,05, Figur 4A). Dessa observationer bekräftades också av kolonibildningsanalys (Figur 4B). Våra resultat visar att anti-spridning funktion av EMX2 i gastric cancerceller

bekämpande av Wnt-signalväg av adenovirus-levererade EMX2

Funktionen hos EMX2 har kopplats till Wnt-signalväg. Därför studerade vi förhållandet mellan EMX2 och Wnt signalering i magcancer. Vi använde en Topflash /Fopflash reporter analys för att mäta TCF /LEF-beroende transkriptionsaktivitet regleras av kanoniska Wnt väg. Vi fann att TCF /LEF-beroende transkriptionsaktivitet hämmades signifikant av Ad-EMX2 i AGS och MKN28 celler som saknar endogent EMX2 expression (P < 0,05), men inte i AZ521 celler som uttrycker endogent EMX2 (P > 0,05, figur 5A). Konsekvent, proteinnivåer av cytosoliskt β-catenin och kanonisk Wnt pathway mål nedströms c-myc och cyklin D1 undertrycktes i dessa AGS och MKN28-celler infekterade med Ad-EMX2, men inte i AZ521 celler (restaurering av EMX2 uttryck i dessa cellinjer efter ad-EMX2 infektion bekräftades genom Western) (figur 5B). För att ytterligare undersöka relevansen av Wnt väg nedreglering och spridning undertryckande av Ad-EMX2, vi transfekterade och uttryckte stabiliserade β-catenin (S45Y mutation) i dessa gastric cancerceller infekterade med Ad-EMX2. Vi observerade att överuttryck β-catenin signifikant försvagade tillväxten undertryckande effekten av Ad-EMX2 i båda AGS och MKN28-celler (P < 0,01), men inte i AZ521 celler (figur 5C). Sammantaget ger dessa resultat stöder en viktig roll EMX2 i undertryckande av Wnt väg i magcancer.

bekämpande av ventrikelcancer Tillväxt genom adenovirus-levererade EMX2 in vivo

Vi etablerade MKN28 och AGS xenograft modeller för att undersöka den terapeutiska potentialen hos adenovirus levererade EMX2 för magcancer in vivo
. En vecka efter ympning, möss med lokala tumörer som sträcker sig från 50 till 100 mm ^{2 fick en direkt intratumoral injektion av 1 x 10 9 plackbildande enheter av den angivna adenovirus. Tillväxten av tumörer i Ad-EMX2 infekterade möss var signifikant långsammare än den i kontrollgruppen (P < 0,05, figur 6A lämnade två paneler). Vid fullbordandet av experimentet tumörmassa hos Ad-EMX2 infekterade möss också signifikant mindre än den i kontrollgruppen (P < 0,05 för MKN28 tumör, P < 0,01 för AGS tumör, figur 6A högra panelen). Färgningsintensitet av en proliferativ markör Ki67 av tumörprover vid fullbordande av försöket visade att tillförsel av Ad-EMX2 minskade signifikant den Ki-67-färgning (P < 0,01, Figur 6B), vilket tyder på cell-proliferation inhibition i tumörer. Dessutom, survival of the Ad-EMX2 infekterade gruppen var signifikant bättre än den hos kontrollgruppen (P = 0,014, Figur 6C). I överensstämmelse med vår In vitro
analys nedströms mål cytosoliskt β-catenin och kanonisk Wnt pathway c-myc och cyklin D1 också nedregleras i Ad-EMX2 infekterade MKN28 och AGS tumörer (återställande av EMX2 uttryck i dessa in vivo tumörer bekräftades också av västerländska) (Figur 6D). Sammantaget våra resultat visar en terapeutisk potential adenovirus levererade EMX2 att behandla magcancer.}

Diskussion

homeobox gener har väl känt för sin betydelse i utvecklingen i årtionden, medan studiet av dessa gener under onkogenes är fortfarande i sin linda. Avvikande homeobox genuttryck har dokumenterats i olika typer av cancer [32], [33], vilket indikerar förändringarna i hemeobox uttryck kan vara viktigt för onkogenes. Detta kan ge en molekylär grund för potentiella kliniska applikationer. Men flera grundläggande frågor måste fortfarande vara fullt upp, även de molekylära mekanismer som driver avvikande uttryck, och mål nedströms och signalvägar som främjar onkogenes. I denna studie genom insikter i dessa frågor genom att undersöka EMX2 i human gastric cancer.

Vår studie rapporterade en signifikant minskning och förlust av EMX2 expression i gastriska cancercellinjer och primära tumörvävnader, och visade att nedreglering var signifikant korrelerad med hyper-metylering av EMX2 promotorn, vilket tyder på epigenetiska tysta som en viktig mekanism för EMX2 dysreglering i human magcancer. I själva verket har epigenetisk modifiering föreslagits som en viktig mekanism som ansvarar för homeobox gener nedreglering eller tysta i andra typer av cancer vävnads där dessa gener fungerar i tumörundertryckning [14], [32]. Dessutom stöder vår observation av EMX2 dowregulation i icke-invasiv gastric dysplasi en möjlig viktig roll EMX2 i patologisk progression av human magcancer. En begränsning med vår studie är det antal vävnadsprover som analyserats. Ett större antal patientprover måste undersökas för att ytterligare bekräfta upptäckten av metylering-tysta EMX2 i magcancer. Ändå våra resultat ger en första direkta bevis för att stödja denna mekanism i magcancer och identifiera EMX2 som en förmodad ny tumörsuppressor i magcancer.

Dessutom undersökte vi viktiga onkogena vägar genom vilka EMX2 fungerat i magcancer , och fann att Wnt-signalväg kan spela en nyckelroll förmedla EMX2 funktion. Vi illustreras i proliferationsanalyser som högt uttryck av exogen EMX2 signifikant undertryckte tillväxten av magcancer cellinjer som saknar endogena genuttryck (AGS och MKN28 celler), i överensstämmelse med tidigare rapporter om att skillnaden i EMX2 uttryck negativt korrelerad med spridning i andra typer av cancerceller [ ,,,0],24], [25]. Vi visade också att Wnt-signalväg dramatiskt hämmas av EMX2 In vivo Mössor och In vitro
, ger ytterligare belägg för att Wnt-signalväg kan förmedla funktion EMX2 i cancer som tidigare föreslagit [22 ].

Slutligen våra resultat tyder på möjligheten av att använda EMX2 genterapi för behandling av gastrisk cancer. Infektion av tumörer med Ad-EMX2 undertryckte signifikant spridning och ännu viktigare, förbättrad överlevnad. Det är anmärkningsvärt att leveranssystem vi används för behandling var rekombinanta adenovirus serotyp 5 (Ad5), den mest använda vektor i flera typer av cancer genterapi [11], [12], [34], [35]. Jämfört med adeno-associerad viral (AAV) och retrovirusleveranssystem, adenovirala vektorer, såsom Ad5, tydligt har många fördelar. Till exempel, adenovirusvektorer har bred tropism möjliggör effektiv inriktning på många vävnader av intresse, en stor lastkapacitet och hög omvandlingseffektiviteten i förhållande till AAV-systemet [10] och även en icke-integrerande egenskaper som annars inducerar risken för slumpmässig mutagenes av genomet [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Dessutom kan adenovirusvektorer modifieras till cancerselektiva onkolytiska virus [39], [40], [41], som är avgörande för klinisk tillämpning av genterapi mot cancer. Det finns dock fortfarande många utmaningar med att använda adenovirala vektorer för att leverera genterapier hos patienter. Till exempel, kan de snabbt förlorad från celler som delar snabbt efter infektion. Andra faktorer som påverkar klinisk tillämpning av adenoviral leverans inkluderar förpackningskapacitet och värd utbud av adenovirala vektorer, deras genuttryck profil och tendens att framkalla immunsvar, särskilt viktig om det krävs upprepad dosering [42], [43]. Ändå föreslår vår in vivo
studie av Ad-EMX2 infektion som EMX2 genterapi kan ha potential att bli en klinisk antitumör terapeutisk strategi för behandling av magcancer i framtiden.

• PLOS ONE: differentiellt uttryck av fosfolipas C Epsilon en är associerad med kronisk atrofisk gastrit och ventrikelcancer
• PLOS ONE: tysta XB130 är förknippad med både prognosen och Chemosensitivity för magcancer