PLoS One: adenovírus kézbesítése EMX2 Gene elnyomja Growth in Human gyomorkarcinóma

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

EMX2 egy ember ortológját a Drosophila katalógusa üres spiracles homeobox gén, amely szerepet játszik az embriogenezis. A legújabb tanulmányok azt sugallják, esetleges érintettségét EMX2 az emberi daganatok; azonban a szerepe EMX2 a carcinogenesisben igényel további feltárását. katalógusa

Eredmények katalógusa

Ebben a tanulmányban azt jelentette, hogy leszabályozza EMX2 kifejezés szignifikáns korrelációt EMX2 promoter hipermetiláció gyomorrákban. Visszaállítása EMX2 kifejezés használatával egy adenovírus szállítási rendszer gyomor rákos sejtvonalak endogén EMX2 kifejezés vezetett gátlása sejtproliferáció és Wnt jelátadó útvonal mind in vitro, és egy olyan gyomorrák xenograft modell in vivo. Ezen kívül, azt tapasztaltuk, hogy az állatok kezelt adenovírus EMX2 expressziós vektor szignifikánsan jobb túlélési mint a kezelt üres adenovírus-vektor. Katalógusa

Következtetés

A tanulmány azt sugallja, hogy EMX2 egy feltételezett tumor szupresszor a humán gyomorrák. Az adenovirális-EMX2 lehet potenciális mint új génterápiás kezelésére gyomorrákos betegeknél.

bevezető hivatkozás: Li, J, Mo M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) adenovírus szállítása EMX2 Gene elnyomja Growth in Human gyomorrákban. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10,1371 /journal.pone.0045970 katalógusa

Szerkesztő: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japán katalógusa

Beérkezett: április 13, 2012; Elfogadva: augusztus 23, 2012; Megjelent: szeptember 21, 2012 katalógusa

Copyright: © Li et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta pénzeszközöket a Nemzeti Key Basic kutatás és fejlesztés (973) Program of China (2011CB910800 és 2012CB917304), a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (31170732), a Természettudományi Alapítvány Zhejiang tartomány (Y2101329), és a posztdoktori Tudomány Alapítvány a Zhejiang tartomány (2010-BSH-031). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganat, és a második leggyakoribb oka a rák összefüggő halálesetek a világon [1], [2], [3]. Bár globális előfordulása csökkent, az előfordulási továbbra is magas az ázsiai országokban [2], [4], [5]. A legtöbb gyomorrák betegek diagnosztizáltak előrehaladott [6]. Annak ellenére, hogy a javulás kezelési stratégiák [7], [8], az 5 éves túlélés betegek előrehaladott gyomorrák, akik a hagyományos terápiák is kevesebb, mint 30% [4]. Ezért alternatív megközelítések sürgősen szükség van.

A génterápia, beleértve a virális és nem virális génbeviteli rendszer, egy ígéretes megközelítés a rák kezelésében [9]. Között összes rendszer, rekombináns adenovírus (Ad) vektorok különösen ígéretes. Az előnyök a Ad vektorok közé tartozik a képességét, hogy magas titerrel, képes megfertőzni osztódó és nem osztódó sejteket hatékonyan, genom stabilitás, és alacsony a DNS beépülése a gazda genomba, [9] [10]. Leírták, hogy a helyreállítás a gének révén, ez a megközelítés tumor regresszió és apoptózist indukál in vivo katalógusa anélkül, normál szövetekben [11], [12], [13]. Katalógusa

EMX2, humán orthológját a Drosophila katalógusa üres spiracles (eMS) homeobox gén tartozik homeobox géncsalád kódoló transzkripciós szabályozó fehérjék (Homeoprotein) elengedhetetlen sok szempontból a növekedés és differenciálódás [14]. EMX2 létfontosságú szerepet játszik az agy alatt [15] és a csontrendszer fejlődését. [16] Egerek rejtegetése homozigóta EMX2 mutációkat mutatnak drámai méretének csökkentése caudalis mediális területeken, mint például az occipitalis kéreg és a hippocampus [17], [18], [19]. Perturbációja EMX2 kifejezés megváltoztathatja a proliferációs sebesség felnőtt neurális őssejtek [20]. EMX2 is szabályozza emlősök szaporodásában beállításával endometrium sejtek szaporodását, de nem hatnak differenciálás [21]. Katalógusa

A legújabb tanulmányok azt sugallják, esetleges érintettségét EMX2 humán daganatokban [22], [23], [24], [25]. Például EMX2 igazolták, mint egy tumorszuppresszor tüdőrák, és alacsony EMX2 expresszió csökkenésével jár a teljes túlélés és a kiújulás betegeknek a túlélési tüdő adenocarcinoma [22], [23]. Azt is leírták, hogy EMX2 kifejezés bőséges normál endometrium posztmenopauzában lévő nők, de hiányzik vagy csökkent az endometrium tumorok és EMX2 szint negatívan korrelál elterjedése [24], [25]. Sőt, EMX2 szabályozhatják tumorigenezis keresztül Wnt jelátadó útvonal, egy kritikus szabályozó útvonal sejt sorsát meghatározására, szöveti fejlődés és a tumorgenezis [26], [27], [28]. EMX2 található, mint a közvetlen represszorát Wnt1 kifejezés, és kopogás lefelé a EMX2 gén indukál ektopikus expresszióját Wnt1 a fejlődő telencephalon és kortikális diszplázia [29]. Epigenetikai csendesítése a EMX2 expresszió fontos lehet aberráns aktiválása a Wnt jelátvitel a tüdőrák, és a következményes proliferáció és metasztázis [22]. Azonban, a funkció a EMX2 alatt tumorigenezis és megfelelő mechanizmust kell még tovább tisztázott. Ebben a vizsgálatban, számolunk EMX2, mint egy feltételezett tumor szuppresszor humán gyomorrák. Megmutatjuk, a EMX2 downregulációját és annak kapcsolatát a metilációs állapotát a gén promóter régiójában a gyomorrák. Azt is kimutatták, hogy helyreállítása EMX2 alkalmazásával adenovírus szállítási rendszer gátolja a sejtek szaporodását és Wnt jelátviteli in vitro katalógusa, és az eredmények jobb túlélését gyomorrák xenograftmodellben in vivo katalógusa. Adataink erősen sugallják terápiás potenciálja a Ad-EMX2 génterápia jövőbeni betegek kezelésére gyomorrák. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

Ez a tanulmány hagyta jóvá az etikai bizottság Xuanwu Kórház, Capital Orvostudományi Egyetem Pekingben. Egy írásos beleegyezését adta jóváhagyta az etikai bizottság, kaptuk az egyes betegek előtt szövetmintát gyűjtemény. Katalógusa

Cell Culture, 5-aza-2'-dezoxicitidin (DAC) /trichosztatin A (TSA) kezelés és a szövetminták

az emberi gyomor rákos sejtvonalak (AZ521, AGS és MKN28) kaptuk Kínából Központ Type Culture Collection (Wuhan, Kína). Sejtvonalakat Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközegben, kiegészítve 10% magzati borjúszérummal, penicillinnel és sztreptomicinnel, 37 ° C-on tartottuk nedves inkubátorban, 5% CO _{2. Ahhoz, hogy elemezni helyreállítása EMX2 gén sejteket kezeltünk 4 um DAC vagy 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA), 4 napig, a csere a friss tápközegben, amely az azonos dózisú DAC vagy TSA mindennapi. Kontroll sejteket tenyésztettünk tartalmazó friss tápközeggel DMSO-ban. A sejteket következésképpen betakarított DNS /RNS extrakció.}

Összesen 20 formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetek blokkok (10 gyomorrák szövetek és 10 szomszédos normális szövetekben), valamint a teljes RNS 15 gyomor dysplasia minták és 20 gyomorrák sebészi vettünk Xuanwu Kórház, Capital Orvostudományi Egyetem Pekingben. A teljes RNS és genomikus DNS-t kivonjuk a humán felnőtt normális gyomor- szöveteket szereztünk be BioChain (Hayward, CA, USA).

DNS-konstrukciók

Topflash /Fopflash riporterek tartalmazó vad típusú és mutáns TCF /LEF kötőhelyek képezte szívességéből Dr. Chen Yeguang (Tsinghua Egyetem, Peking, Kína). A mutáns CTNNB1 (S45Y) cDNS-konstrukciót is bocsátotta rendelkezésünkre Dr. Chen Yeguang (Tsinghua Egyetem, Peking, Kína). Rekombináns adenovírus vektorok expresszáló EMX2 és a kontroll vektor cégtől vásároltuk Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA).

metiiációspeeifikus PCR (MSP) és biszulfit szekvenálás (BS)

a biszulfit konverzió szövetek és sejtek nélkül végeztük előfeltétele a DNS-tisztítási segítségével EZ a DNS-metilációs-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). A FFPE szövetek voltak első de-paraffinized xilolban (Sigma) és rehidratált felszálló etanol, mielőtt biszulfit kezelés per gyártó utasításai szerint. Mert MSP, módosított DNS-t amplifikáljuk MSP primereket (lásd alább), amely kifejezetten elismert vagy a denaturált vagy metilálatlanok EMX2 promoterszekvenciák után biszulfit kezelés. PCR-t fut végtérfogatban 20 ul, amely 1 × MSP reakció puffert [30], 0,5 uM mindegyik primerből és 1 U Zymo Taq
™ DNS-polimerázt (Zymo). A PCR-körülmények a következők voltak: 10 perc 95 ° C-on; 40 ciklus 30 s 95 ° C hőmérsékleten, 30 s 50 ° C és 30 72 ° C; és 7 perc végső lánchosszabbítás 72 ° C-on. BS, amplifikálásához biszulfit-átalakított DNS végeztük végtérfogatban 50 ul, amely 1 uM mindegyik BS primert és 2 egység Zymo Taq
™ DNS-polimerázt. A PCR-körülmények a következők voltak: 10 perc 95 ° C-on; 40 ciklus 30 s 95 ° C hőmérsékleten, 40 s 55 ° C-on és 1 perc 72 ° C-on; és 7 perc végső lánchosszabbítás 72 ° C-on. A PCR-termékeket klónoztuk PMD-18T (Takara, Dalian, Kína). 5 vagy 3 véletlenszerűen kiválasztott pozitív klónok minden csoportból szekvenáltuk Shanghai Invitrogen (Shanghai, Kína). Primereket a következő:

MSP-M (előre): 5'-TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 '

MSP-M (fordított): 5'-GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3'

MSP-U (előre): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 'katalógusa

MSP-U (fordított): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3' katalógusa

BS-A (előre): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 'katalógusa

BS-A (vissza): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3' katalógusa

BS-B (előre): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 'katalógusa

BS-B (fordított): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 'katalógusa

Az immunhisztokémia (IHC) hotelben

IHC végeztük következő standard protokoll. Antitestek a tanulmányban használt tartalmazza egér anti-humán Ki67 (1:100; BD, San Jose, CA, USA) és egér anti-humán EMX2 (1:500; Pierce, Rockford, IL, USA), és Alexa 594 konjugált kecske anti-egér szekunder antitesttel (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A metszeteket is ellenfestettük hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 konfokális mikroszkóppal (Oberkochen, Németország) alkalmaztunk, hogy megvizsgálja a festés. Az intenzitás a Ki67 mennyiségileg az Image Pro Plus. EMX2 festéssel tettük láthatóvá Histostain Plus DAB-reagenskészlet (széles spektrumú, Invitrogen) szerint gyártó utasításai, hematoxilinnel ellenfestettük (Sigma), és fényképezett segítségével egy Leica SCN400 dia szkenner (Leica, Germany).

Luciferase Assay

sejteket olyan sűrűségben, 5 × 10 ^{3 lyukanként oltottunk 24 lyukú lemezekre a transzfekciót megelőzően. Topflash vagy Fopflash plazmidokat együtt transzfektáltuk PRL-TK plazmidnak. Miután sejteket tenyésztettünk 18 órán át, a luciferáz aktivitását úgy mértük, Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA). Közötti arány szentjánosbogárluciferáz tevékenység (Topflash /Fopflash) és Renilla aktivitás használt TCF /LEF transzkripciós aktivitását. Katalógusa}

immunblotolást katalógusa

Mindkét összfehérje (20 mg) és a citoplazma kivonatokat (40 mg) vetettük alá immunoblot. A primer antitesteket tartalmazza az anti-EMX2 (1:500; Pierce), anti-β-aktin (1:5000; Sigma), az anti-ciklin D1 (1:500; BD) és anti-c-Myc (1:200; santa Cruz Biotechnoiogy, CA, USA).

Proliferation Assay

a sejtnövekedést úgy határoztuk meg, CellTiter 96 Aqueous Proliferation Assay Kit (Promega). A sejtvonalakat szélesztettünk 96 mérőhelyes szövettenyésztő lemezeken, száma 5 × 10 ^{2 sejt /mérőhely. Miután a sejteket tenyésztettünk 0., 2., 3. és 4., az MTS-oldatokat adunk a közeghez, és inkubáltuk 1,5 órán át. Az abszorbanciát 490 nm-en mértük mikrotiterlemez-leolvasó Modell 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).}

telepképző assay

sejteket (1 × 10 ^{3) fertőzött a adenovirális vektor expresszáló EMX2 vagy üres vektorral oltottunk három párhuzamosban 100 mm-es edények. Friss tápközeget 3 naponként cserélnek. After tenyésztjük 3-4 hétig, a sejteket fixáltuk 4% paraformaldehiddel 10 percig, PBS-sel mossuk, megfestettük 0,1% -os kristályibolya 20 percig és lefényképeztük.}

RNS-extraháló és kvantitatív, valós idejű reverz transzkripció -PCR (RT-PCR)

RNS extrakció és a valós idejű RT-PCR-rel végeztük a korábban leírtak [31]. A primer szekvenciákat korábban leírt [22]. Katalógusa

Animal Model és adenovírus vektor Delivery katalógusa

Minden egérkísérletek alatt végeztük specifikus kórokozóktól mentes körülmények az állattartó létesítmények Tsinghua Egyetem és jóváhagyta az Institutional Animal Care and Use Committee Tsinghua Egyetemen. Gyomorrák xenograftok alakult át 5-hetes nőstény BALB /c csupasz egerekben. Röviden, miután tenyésztjük összefolyásig, MKN28 vagy AGS sejteket trypisnized és újra szuszpendáljuk PBS-ben (pH = 7,4), majd a vegyes 01:01 (v /v) A Matrigel (élénk), 4 ° C-on kell beadni egy egér teljes térfogatban 150 ul. Az elegyet s.c. injektáljuk jobb horpasz 16 nőstény egerek 10 ^{7 sejt per egér (0 nap). A 7. napon az egerek hordozó helyi daganatok között mozgott 50-100 mm 2 kapott közvetlen belüli tumor injekció 1 × 10 9 plakk-képző egység, a feltüntetett adenovírus (hígítjuk PBS-sel össztérfogatban 100 ul). A tumorképződés követtük maximum 1 ½ hónap. A tumor méretét mértük tolómércével, és határozza meg, megszorozzuk 0,5 × szélessége 2 × hosszát. A Kaplan-Meier-módszerrel becslésére túlélés a két csoport a kezelt állatokban. A befejezése a kísérlet, a tumorok minden kezelés gyűjtöttük 10% -os pufferolt formaiinban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, és vágjuk 5 jim vastagságú szeleteket további Ki-67 érzékelés. Citoszol fehérjéit és a teljes sejtlizátumot szintén kivont olyan tumorok a Western-analízis.}

Statisztikai elemzés

Minden adat számoltuk átlagérték ± standard deviáció. Csoportok közötti különbségeket hasonlítottuk össze egy kétoldalú Student-féle t-teszt. A P katalógusa értéke 0,05 vagy kisebb tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

downregulációját EMX2 Humán gyomorkarcinóma katalógusa

Megvizsgáltuk EMX2 kifejezést kilenc emberi gyomor rákos sejtvonalak, valamint a daganat és párosítva szomszédos normál szöveteket a tíz gyomorrák beteg (1. ábra). A valós idejű RT-PCR-rel, azt találtuk, hogy az expresszió a EMX2 szignifikánsan downregulált nyolc a kilenc vizsgált sejtvonalakban képest, hogy a szokásos gyomor szövet (P < 0,01, ábra az 1A). Másrészről, az egyik sejtvonal AZ521 mutatta, hasonló szintű EMX2 expresszió mint amely normál kontroll (1a ábra). Annak érdekében, hogy észlelni EMX2 protein expresszió beteg szövetminták, immunhisztokémiai (IHC) végeztünk, és az intenzitás IHC festést mennyiségileg fényképek Pro Plus. Mind a tíz vizsgált minták találtak, hogy mutat bármelyik hiánya EMX2 kifejezés vagy csökkent szintje EMX2 kifejezés a rákos szövetekben, összehasonlítva a normális társaik (P < 0,01, 1B). Annak megállapítására, milyen szerepet játszhatnak a EMX2 patológiás progressziójában emberi gyomorrák, elemeztük EMX2 kifejezés használata a teljes RNS-t kaptunk, tizenöt gyomor diszplázia minták és húsz gyomorrák sebészi mintákat. Azt találtuk, hogy EMX2 expressziója szignifikánsan csökkent expressziót a dysplasia minták (P < 0,05), és majdnem elvesztette a rák mintákat összehasonlítva a felnőttkori normális gyomor szöveteiben (1C), ami arra utal, hogy a EMX2 alulszabályozottsághoz is előfordulnak, nem invazív rákmegelőző színpadon.

Javítás között EMX2 Expression és promoter metilációs státusának

Megvizsgáltuk metilációs állapotát a EMX2 promoter kilenc gyomorrák sejtvonalakat és normál gasztrikus szövetben. Régiók CpG-szigetek (CGI) azonosítottuk MethPrimer származó -800 hogy -470 és -55 459 képest a várt transzkripciós start oldalak (+1) a EMX2 gén (2A ábra). Metilációs állapotát elemeztük a biszulfit szekvenálás (BS) (2B) és metilációs-specifikus PCR (MSP) (2C-2D). A BS és MSP eredmények azt mutatták, hogy a EMX2 promoter normális gyomor- szövet- és AZ521 sejtek nem metilált, míg a többi nyolc vizsgált sejtvonalakban volt sűrűn metilezett (2B-2C). Ezek az eredmények összhangban vannak azzal a EMX2 expressziós szinteket ezekben a sejtvonalakban: nagy, normál szövetben és AZ521, de alacsony a többi nyolc vizsgált sejtvonalakban. Keveréke metilált és metilálatlan sáv található számos sejtvonalban beleértve MKN28, N87, és SNU16 jelezve részleges metilezés. Továbbá azt találtuk, hogy metiiációs állapotát a páciens szöveti minták által feltárt MSP összhangban van a EMX2 expressziós szinteket a minták (2D, ábra, négy tíz pár szöveti mintákat miatt vizsgált elérhetetlensége genomiális DNS-t a többi hat pár ). Ezek az adatok arra utalnak, hogy downregulációját EMX2 kifejezés lehet eredményeként a promoter hiper-metiláció gyomorrákban. Katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálja az összefüggést EMX2 expresszió és a promoter metiláció kezeltünk MKN28 és AGS sejtvonalak egy metiltranszferáz inhibitor DAC és egy hiszton dezacetiláz inhibitorral TSA. Sejtvonal AZ521 használtunk negatív kontrollként, mivel a promoterrégió metilálatlan. Megfigyeltük, hogy a unmethylation adott sávban szignifikánsan emelkedett (3A ábra) A EMX2 expressziós szintje serkentett megfelelően (3B, ábra) történő DAC kezelés egyaránt AGS és MKN28 sejtek, míg azok, AZ521 sejtek változatlan maradt (3. ábra). A kezelés a TSA csak minimális hatást mindkét metilációs állapotát, és EMX2 expressziós szintek. Mindent összevetve, az eredmények erősen azt jelzik, leszabályozza EMX2 expresszió szignifikáns korrelációt mutatott a EMX2 promoter hipermetiláció humán gyomorrák. Katalógusa

gátlása Cell Growth adenovírus által szállított EMX2 in vitro katalógusa

Mi következő játszott szerepét vizsgálták EMX2 sejtnövekedésre gyomorrák-sejtek. A növekedés a AGS és MKN28 sejtek szignifikánsan elnyomja a fertőzés adenovírussal expresszáló EMX2 (Ad-EMX2), mint egy üres vektor (Ad-Ctrl) (P < 0,001, ábra a 4A), mivel a növekvő AZ521 sejtek nem érintette (P > 0,05, 4A). Ezek a megfigyelések is megerősítette telepképző assay (4b ábra). Eredményeink azt mutatják, az anti-proliferációs funkciója EMX2 gyomorrákban sejtekben. Katalógusa

visszaszorításáról Wnt jelátviteli útvonal adenovírus által szállított EMX2 katalógusa

A funkció EMX2 összefüggésbe hozták a Wnt jelátviteli; Ezért megvizsgáltuk a kapcsolatát EMX2 és Wnt jelátviteli gyomorrákban. Mi egy Topflash /Fopflash riporter assay mérésére TCF /LEF-függő transzkripciós aktivitását szabályozzák kanonikus Wnt útvonal. Azt találtuk, hogy a TCF /LEF-függő transzkripciós aktivitás szignifikánsan gátolta az Ad-EMX2 AGS és MKN28 sejtek endogén EMX2 kifejezés (P < 0,05), de nem a AZ521 expresszáló sejtek endogén EMX2 (P > 0,05, 5A ábra). Egyenletesen, fehérje szintjeit a citoszol β-catenin és a kanonikus Wnt útvonal downstream célpontok c-myc és a ciklin D1 elnyomták ezekben AGS és MKN28 fertőzött sejtek Ad-EMX2, de nem AZ521 sejtekben (helyreállítása EMX2 expresszió ezen sejtvonalak után Ad-EMX2 fertőzést Western) (5B). Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a relevanciáját Wnt útvonal down-szabályozás és proliferáció elnyomása Ad-EMX2, mi transzfektált és kifejezte stabilizált β-catenin (S45Y mutáció) ezekben a gyomorrák fertőzött sejtek Ad-EMX2. Megfigyeltük, hogy túl-expresszáló β-catenin szignifikánsan csökkentette a növekedés elnyomása hatását Ad-EMX2 mind AGS és MKN28 sejteket (P < 0,01), de nem a AZ521 sejtekben (5C). Együttesen ezek az eredmények alátámasztják fontos szerepe EMX2 gátlását Wnt útvonal gyomorrákban. Katalógusa

elnyomása Gyomorrák Növekedési adenovírus által szállított EMX2 in vivo katalógusa

hoztuk létre a MKN28 és AGS xenograftmodellekben felfedezni a terápiás potenciálja adenovírus-szállított EMX2 gyomorrák in vivo katalógusa. Egy héttel a beoltás után, hordozó egerek helyi daganatok terjedő 50-100 mm ^{2 kapott közvetlen intratumorális injekció 1 × 10 9 plakk-képző egység, a jelzett adenovírus. Tumorok növekedését az Ad-EMX2 fertőzött egereket jelentősen lassabb, mint a kontroll csoportban (P < 0,05, ábra a 6A maradt két panelek). A befejezéskor a kísérlet tumor tömege az Ad-EMX2 fertőzött egerekben szintén szignifikánsan kisebb, mint a kontroll csoportban (P < 0,05 MKN28 tumor, a P < 0,01 AGS tumor, ábra a 6A jobb panel). Festődés intenzitása proliferatív marker Ki67 tumor próbadarabok befejezésekor a kísérlet azt mutatta, hogy a szállítást a Ad-EMX2 jelentősen csökkentette a Ki-67 festődés (P < 0,01, 6B ábra), ami arra utal, sejtproliferáció gátlását a tumorokban. Ezen túlmenően, a túlélés a Ad-EMX2 fertőzött csoportban szignifikánsan jobb volt, mint a kontroll csoportban (p = 0,014, ábra a 6C). Összhangban a in vitro katalógusa elemzés citoszolikus β-catenin és kanonikus Wnt útvonal downstream célpontok c-myc és a ciklin D1 is downregulált Ad-EMX2 fertőzött MKN28 és AGS daganatok (helyreállítása EMX2 kifejezés ezekben az in vivo tumorok is megerősítette nyugati) (ábra 6D). Mindezzel együtt, az eredmények azt mutatják terápiás potenciálja adenovírus-szállított EMX2 kezelésére gyomorrák. Katalógusa}

Vita katalógusa

Homeobox géneket jól ismert jelentőségű fejlesztés évtizedek óta, miközben a tanulmány ezen gének alatt onkogenezissel még gyerekcipőben jár. Aberráns homeobox génexpressziók dokumentálták különböző rákos [32], [33], ami azt változásait hemeobox kifejezések fontos lehet onkogenezis. Ez nyújthat a molekuláris bázisát potenciális klinikai alkalmazások. Azonban számos alapvető kérdést kell még teljesen kiküszöbölni, beleértve a molekuláris mechanizmusokat, hogy a meghajtó kóros expressziója, és a későbbi célok és jelátviteli utak, amelyek elősegítik onkogenezis. Ebben a tanulmányban betekintést nyújtanak a következő kérdéseket vizsgálja EMX2 humán gyomorrák. Katalógusa

A tanulmány szerint jelentős csökkenése és a veszteség EMX2 kifejezés gyomorrákban sejtvonalak és primer tumor szövetben, és kimutatta, hogy a downregulációját szignifikáns korrelációt hiper-metiláció a EMX2 promoter, ami arra utal, epigenetikai hangtompító fontos mechanizmus EMX2 diszreguláció humán gyomorrák. Valóban, epigenetikus módosítás javasolták kulcsfontosságú felelős mechanizmus homeobox gének downregulation vagy hangtompító más rákos szövetek esetében, ahol ezek a gének működnek daganat megszüntetése [14], [32]. Sőt, a megfigyelése EMX2 dowregulation a non-invazív gyomor dysplasia támogatja egy lehetséges fontos szerepét EMX2 patológiás progresszió humán gyomorrák. Egyik korlátja, a tanulmány száma szövetminták elemezték. A nagyobb számú beteg minták meg kell vizsgálni, hogy még inkább megerősítik azt a megállapítást, metiláció-elhallgattatása EMX2 gyomorrákban. Ezen eredmények egy első közvetlen bizonyíték, hogy támogassa ezt a mechanizmust a gyomorrák és azonosítani EMX2 mint feltételezett új tumor szupresszor gyomorrákban. Katalógusa

Emellett megvizsgáltuk fontos onkogén utakat, amelyeken keresztül EMX2 működött gyomorrák , és megállapította, hogy Wnt jelátadó útvonal lehet kulcsszerepet játszik közvetítő EMX2 funkciót. Illusztráltuk proliferációs assay, hogy a magas expressziója exogén EMX2 jelentősen elnyomja növekedését gyomor rákos sejtvonalak endogén génexpresszió (AGS és MKN28 sejtek), amely összhangban áll a korábbi jelentéseket, hogy a különbség a EMX2 kifejezése negatívan korrelál proliferáció más rákos sejt típusok [ ,,,0],24], [25]. Azt is kimutatták, hogy a Wnt jelátadó útvonal drámaian gátolja EMX2 in vivo
és a in vitro katalógusa, amely további bizonyíték arra, hogy a Wnt jelátviteli közvetítheti a funkciója EMX2 rákos mint korábban javasolt [22 ].

Végül, eredményeink azt mutatják, a potenciális használó EMX2 génterápiás kezelésére gyomorrák. Fertőzés tumorok Ad-EMX2 jelentősen elnyomja elterjedése és ami még fontosabb, javította az átlagos túlélési. Érdemes megjegyezni, hogy a szállítási rendszer mi kezelésére használt volt rekombináns adenovírus 5-ös szerotípusú (Ad5), a leggyakrabban használt vektor számos típusú rák génterápiás [11], [12], [34], [35]. Összehasonlítva adeno-asszociált vírus (AAV) és retrovírus bejuttató rendszerek, adenovirális vektorok, mint például a Ad5, egyértelműen számos előnye van. Például adenovírus vektorok széles tropizmusával lehetővé teszi a hatékony célzás számos szövetekben történő, nagy teherbírással és nagy jelátviteli hatékonyság relatív AAV rendszer [10], valamint a nem-integráló jellemzők, amelyek egyébként indukálják kockázatát random mutagenezis genom [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Sőt, adenovirális vektorok is tervezték, hogy a rák-szelektív onkolitikus vírusokkal [39], [40], [41], amelyek kritikus klinikai alkalmazása a rák génterápia. Azonban még mindig sok kihívásai használata adenovirális vektorok szállít gén terápiák betegekben. Például, lehet őket gyorsan elvesztette a sejtekből, amelyek megosztják gyorsan a fertőzés után. Befolyásoló egyéb tényezők klinikai alkalmazása adenovirális szállítási tartalmazzák a csomagolást kapacitás és a fogadó tartományban adenovírus-vektorok, a génexpressziós profil és a tendencia, hogy immunválasz kiváltására, különösen fontos, ha az ismételt adagolás szükséges, [42], [43]. Mindazonáltal, a mi in vivo
vizsgálatban az Ad-EMX2 fertőzés azt sugallja, hogy EMX2 génterápia lehet lehetősége, hogy egy klinikai tumorellenes terápiás stratégia kezelésére gyomorrák a jövőben.

• PLoS One: differenciális expressziója foszfolipáz C Epsilon 1 társul krónikus sorvadásos gyomorhurut és gyomorfekély Cancer
• PLoS One: elhallgattatása XB130 társul Mind a Prognózis és kemoszenzitivitás Gyomorsav Cancer