Plos ONE: Adenoviralni Dostava EMX2 Gene zavira rast v humani Rak želodca

Povzetek

Ozadje

EMX2 je človek orthologue v Drosophila
prazna spiracles homeobox gena, ki je bil vpleten v embriogeneze. Nedavne študije kažejo, možno sodelovanje EMX2 v človeških rakavih obolenj; Vendar pa je vloga EMX2 v rakotvornost potrebuje nadaljnje raziskovanje.

Rezultati

V tej raziskavi smo poročali, da je bil navzdol regulacija EMX2 izražanja bistveno povezana z EMX2 promotorja hypermethylation raka želodca. Obnavljanje EMX2 izraz uporablja sistem prikazovanja adenovirus v želodcu raka celičnih linijah, ki nimajo lastnih EMX2 izraz privedlo do inhibicije celične proliferacije in NT signalne poti tako in vitro in v želodcu modelu raka ksenotransplantskih in vivo. Poleg tega smo ugotovili, da so živali, ki se zdravijo z adenovirusnega EMX2 izraz vektor bistveno boljše preživetje kot tisti, ki zdravijo s praznim adenovirusni vektor.

Zaključek

Naša študija kaže, da je EMX2 določena domnevna zaviralnih v rak želodca človeško. Adenovirusni-EMX2 lahko potencial kot nova genske terapije za zdravljenje bolnikov z rakom želodca

Navedba. Li J Mo M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q Mu H, et al. (2012) Adenoviralni Dostava EMX2 Gene zavira rast v humani želodca raka. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10,1371 /journal.pone.0045970

Urednik: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonska

Prejeto: April 13, 2012; Sprejeto: 23. avgust 2012; Objavljeno: 21. september 2012

Copyright: © Li et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta s sredstvi iz državnega Key Temeljne raziskave in razvoj (973) Program Kitajske (2011CB910800 in 2012CB917304), National Natural Science Foundation of China (31170732), Naravoslovno Foundation province Zhejiang (Y2101329) in podoktorski znanost fundacija province Zhejiang (2010-BSH-031). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu [1], [2], [3]. Čeprav je njegova incidenca zmanjšala, pojavnost še vedno ostaja visoka v azijskih državah [2], [4], [5]. Večina bolnikov z rakom želodca zboli v poznejših fazah [6]. Kljub izboljšanju strategij zdravljenja [7], [8], 5-letno preživetje bolnikov z napredovalim rakom želodca, ki so prejeli običajne terapije še vedno manj kot 30% [4]. Zato so nujno potrebni alternativni pristopi.

gensko zdravljenje, vključno s sistemom dostave virusne in ne virusnega gena, je obetaven pristop k zdravljenju raka [9]. Med vsemi trenutno na voljo sistem, rekombinantni adenovirus (AD) vektorji so še posebej obetavni. Prednosti vektorjev oglasov vključujejo sposobnosti za proizvodnjo visoke titre, sposobnost, da okuži tako, in ne tako, da celice učinkovito, stabilnost genoma, in nizke stopnje integracije DNA v genom gostiteljske [9], [10]. Ugotovljeno je bilo, da je obnova genov s tem pristopom vodi v regresijo tumorjev in inducira apoptozo in vivo
brez vpliva na normalno tkivo [11] [12] [13].

EMX2, človeški ortholog v Drosophila
homeobox gena prazne spiracles (EMS), spada v Homeobox družini genov, ki kodira transkripcijske regulatorne beljakovine (Homeoprotein), ki so bistvene za številne vidike rasti in diferenciacije [14]. EMX2 igra pomembno vlogo v možganih, [15] in skeletni razvoj [16]. Miši zatočišča homozigotni EMX2 mutacij kažejo dramatično zmanjšanje velikosti repnimi-medialno področjih, vključno temenske korteksa in hipokampusa [17], [18], [19]. Motnje EMX2 izražanja lahko spremeni hitrost širjenja orožja za odrasle živčnih matičnih celic [20]. EMX2 nadzoruje tudi razmnoževanje sesalcev s prilagoditvijo proliferacijo endometrija celic, ne da bi bila izvedba diferenciacije [21].

Nedavne študije kažejo, možno sodelovanje EMX2 v človeški raka [22] [23] [24] [25]. Na primer, EMX2 je bil dokazan kot supresorski tumorja na pljučnega raka, in nizko izražanje EMX2 je povezano z zmanjšano splošno preživetje in ponavljanja brezplačno preživetje pri bolnikih s pljučnimi adenokarcinome [22], [23]. Prav tako je poročal, da je EMX2 izraz bogat v normalnem endometrija žensk po menopavzi, a odsotna ali zmanjša endometrija tumorjev, in ravni EMX2 so v negativni korelaciji s širjenjem [24], [25]. Poleg tega lahko EMX2 urediti tumorigeneze skozi NT signalne poti, kritična pot, ki ureja določitev usoda celic, razvoj tkiv in tumorigeneze [26] [27] [28]. EMX2 najdemo kot neposredni represorju za Wnt1 izražanja, in potrkala navzdol od EMX2 gena povzroči zunajmaternično izražanje Wnt1 v telencephalon v razvoju in skorje displazije [29]. Epigenetsko utišanje izražanja EMX2 je lahko pomemben za odklonskega aktivacijo signalizacije NT na pljučnega raka, in posledično širjenja in metastaz [22]. Vendar pa je funkcija EMX2 v tumorigeneze in ustrezen mehanizem še vedno treba dodatno pojasniti. V tej študiji smo poročajo EMX2 kot domnevni zaviralnih raka človeške želodčne. Mi dokazati EMX2 downregulation in njeno skladnost z metilacijskega statusa gena promotorja regiji raka želodca. Prav tako kažejo, da je obnova EMX2 z uporabo sistema adenovirusno dostave zavira proliferacijo in NT signalizacija in vitro
, in ima za posledico boljše preživetje želodca modelu raka ksenotransplantskih in vivo
. Naši podatki močno kažejo na terapevtski potencial uporabe Ad-EMX2, kot je genska terapija za nadaljnje zdravljenje bolnikov z rakom želodca.

Etika Izjava materiale in metode

Ta študija je odobril odbor za etiko bolnišnice Xuanwu, Capital Medicinski univerzi v Pekingu. pisno privolitev, ki ga predlaga odbor za etiko odobren, je bila pridobljena za vsakega bolnika pred zbiranjem tkivo vzorca.

Cell Culture, 5-aza-2'-deoksicitidin (DAC) /trichostatin A (TSA) Zdravljenje in Tkivo Vzorci

linije človekovih želodčni rak celic (AZ521, AGS in MKN28) so bili pridobljeni iz Kitajske Center za Type Culture Collection (Wuhan, Kitajska). Celične linije smo kultivirali v mediju, modificiranem Dulbeccovem Eagle je dopolnjen z 10% fetalnim bovinim serumom, penicilin in streptomicin pri 37 ° C v vlažnem inkubatorju s 5% CO _{2. Analizirati obnovo EMX2 gena, smo celice obdelali s 4 uM DAC ali 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) 4 dni, z zamenjavo svežega medija, ki vsebuje enak odmerek DAC ali TSA vsakdanji. Kontrolne celice kultiviramo s svežo medij, ki vsebuje DMSO. Celice so zato pridobljeni DNK /ekstrakcijo RNA.}

Skupno 20-formalin fiksni parafinskih vgrajeni tkiv bloki (10 želodca rakavih tkiv in 10 sosednjih normalnih tkiv), kot tudi celotno RNA iz 15 želodčnih vzorcev displazijo in 20 rak želodca kirurški vzorci so bili pridobljeni iz bolnišnice Xuanwu, Capital Medicinski univerzi v Pekingu. Total RNA in genomske DNA, pridobljeni iz človeške odraslih normalnih želodčnega tkiva so bili kupljeni od Biochain (Hayward, CA, ZDA).

DNA konstrukti

Topflash /Fopflash novinarji, ki vsebujejo divji tip in mutirani TCF /LEF vezavnih mest oziroma so posredovale dr Yeguang Chen (Tsinghua University, Peking, Kitajska). Mutantni CTNNB1 (S45Y) cDNA konstrukt je prijazno tudi dr Yeguang Chen (Tsinghua University, Peking, Kitajska). Rekombinantni adenovirus vektorji, ki izražajo EMX2 in krmilni vektor so bili kupljeni od Vector BioLabs (Vector BioLabs, Burlingame, CA, ZDA).

metilacije specifične PCR (MSP) in Bisulfite zaporedja (BS)

bisulfit pretvorbo iz tkiv in celic so bile izvedene brez predpogoj za čiščenje DNA z uporabo EZ DNA metilacije-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, ZDA). V FFPE tkiva so prvi de-paraffinized v ksilena (Sigma) in rehidrirane v razvrstijo etanola, preden bisulfita zdravljenje na navodila Izdelava je. Za MSP, se spremeni DNK pomnožili z uporabo PPN začetnih oligonukleotidov (navedene spodaj), ki so posebej priznane niti na metiliranih ali nemetilirane EMX2 promotorja sekvence po bisulfita zdravljenja. PCR je vodila v končnem volumnu 20 ul z 1 × PPN reakcijskega pufra [30], 0,5 um vsakega temeljni premaz in 1 U Zymo Taq
™ DNA polimerazo (Zymo). PCR pogoj je bil naslednji: 10 min pri 95 ° C; 40 ciklov po 30 sekund pri 95 ° C, 30 s pri 50 ° C in 30 pri 72 ° C; in 7 min končno razširitev pri 72 ° C. Za BS, pomnoževanju bisulfit-pretvori DNA je bila izvedena v končnem volumnu 50 ul vsebujejo 1 um vsak BS Temelj in 2 U Zymo Taq
™ DNA polimerazo. PCR pogoj je bil naslednji: 10 min pri 95 ° C; 40 ciklov po 30 sekund pri 95 ° C, 40 s pri 55 ° C in 1 min pri 72 ° C; in 7 min končno razširitev pri 72 ° C. PCR produkt so klonirali v PMD-18T (Takara, Dalian, Kitajska). 5 ali 3 naključno izbranih pozitivnih klonov iz vsake skupine so sekvenco v Šanghaju Invitrogen (Shanghai, Kitajska). Temeljni premazi so bili naslednji:

MSP-M (naprej): 5'TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 '

MSP-M (nazaj): 5'GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3'

MSP-U (naprej): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '

MSP-U (nazaj): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'

BS-A (naprej): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '

BS-A (nazaj): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'

BS-B (naprej): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '

BS-B (nazaj): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '

Imunohistokemija (IHC)

IHC smo izvedli po standardnem protokolu. Protitelesa, ki se uporabljajo v študiji, so miši proti človeški Ki67 (1:100, BD, San Jose, CA, ZDA) in miši proti humanemu EMX2 (1:500, Pierce, Rockford, IL, ZDA) in Alexa 594 konjugiranim kozji anti-miš sekundarno protitelo (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Ploščice smo jih nasprotno tudi hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 konfokalna mikroskop (Oberkochen, Nemčija) je bila uporabljena za preučitev barvanje. Intenzivnost Ki67 je količinsko, z uporabo Image Pro® Plus. EMX2 obarvanje smo vizualizirali s Histostain Plus DAB kit (širok spekter, Invitrogen), v skladu z navodili Proizvodnja je, jih nasprotno s hematoksilinom (Sigma), in fotografirali s pomočjo Leica SCN400 slide skener (Leica, Nemčija).

luciferazni test

Cells na gostoto 5 × 10 ^{3 per so posejali v 24 vdolbinami pred transfekciji. Topflash ali Fopflash plazmidi so co-transfekciji s PRL-TK plazmida. Po bile celice kultiviramo 18 ur, je luciferaza aktivnost izmerjena z dvojno-Glo luciferazni test sistema (Promega, Madison, ZDA). Razmerje med kresničkino luciferazne aktivnosti (Topflash /Fopflash) in renilla dejavnost je bila uporabljena za TCF /LEF prepisu dejavnosti.}

imunoblot

Tako skupnih beljakovin (20 mikrogramov) in citoplazma ekstrakti (40 mikrogramov) bili podvrženi imuno. Primarna protitelesa vključeni anti-EMX2 (1:500; Pierce), anti-β-aktina (1:5000, Sigma), anti-ciklin D1 (1:500, BD) in anti-c-myc (1:200; santa Cruz Biotechnology, CA, ZDA).

orožja Vsebnost

rast celic je bila določena z CellTiter 96 Vodna orožja Test Kit (Promega). Celične linije smo nanesli v kulturi plošče s 96 vdolbinami s številom 5 × 10 ^{2 celic /vdolbinico. Potem ko so bile celice kultiviramo dneve 0, 2, 3 in 4 so rešitve MTS dodamo k mediju in inkubirali 1,5 h. Absorbanco pri 490 nm smo merili s pomočjo bralnika mikroplošča modelom 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA).}

Colony Ustanovitveni Vsebnost

Cells (1 × 10 ^{3) okuženih z adenovirusno vektorski izražanje EMX2 ali prazen vektor smo posejali v treh izvodih v 100-mm jedi. Sveži medij spremeni vsakih 3 dni. Po kultivirali pri 3-4 tednih, smo celice pritrjen s 4% paraformaldehida v 10 min, speremo s PBS, obarvane z 0,1% kristal vijoličnim 20 minut in fotografirali.}

RNK Pridobivanje in Kvantitativna realnem času reverzno transkripcijo -PCR (RT-PCR)

ekstrakcijo RNA in v realnem času RT-PCR smo izvedli kot je opisano predhodno [31]. V začetnih oligonukleotidov sekvence so bile prej opisano [22].

Animal Model in Adenoviralni Vector dostava

Vsi miši eksperimenti so bili izvedeni v skladu s posebnimi pogoji, brez patogenov v živalski objekt Tsinghua University in institucionalnih odobril Nega živali in uporaba Odbor Tsinghua University. Želodčni rak ksenotransplantati so bile določene v 5 tednov starih ženski BALB /c golih miših. Na kratko, potem gojimo do izliva, MKN28 ali AGS celice trypisnized in resuspendirali v PBS (pH 7,4) in nato zmešamo 01:01 (v /v) z Matrigel (močnem) pri 4 ° C vbrizgamo eno miško celotnem volumnu 150 ul. Zmes s.c. injicirali v desni bok 16 mišjih samicah z 10 ^{7 celic na miški (dan 0). 7. dan, miši, ki nosijo lokalne tumorjev v razponu od 50 do 100 mm 2 prejeli neposredno znotraj tumoralne injekcijo 1 x 10 9 plošča tvorijo enote naveden adenovirus (razredčimo s PBS v celotnem volumnu 100 ul). Nastanek tumor so spremljali do 1½ mesecev. velikost tumorja je bila izmerjena z uporabo čeljust in določi z množenjem 0,5 × širine 2 x dolžino. Metoda Kaplan-Meier smo uporabili za oceno preživetja dveh skupin zdravljenih živali. Ob zaključku poskusa so tumorji pri vsakem zdravljenju zbrane v 10% formalinu zapufrani, vgrajeni v parafin in narežemo na 5-mikrometrskimi debele rezine za nadaljnje odkrivanje Ki-67. Citosolnih proteinov in celotno celični lizat so bili pridobljeni tudi iz teh tumorjev za zahodni analizo.}

Statistična analiza

Vsi podatki so izračunani kot sredstvo ± standardne odklone. Razlike med skupinami smo primerjali z dvostranskim t-test. A P
vrednost 0,05 ali manj, je bila ocenjena kot pomembna.

Rezultati

downregulation od EMX2 v humani Rak želodca

Proučili smo EMX2 izraz v devet človeške želodčne rakave celične linije, kot tudi tumorja in paru sosednji normalnih tkiv od desetih pacientov želodca z rakom (slika 1). Uporabo v realnem času RT-PCR, smo ugotovili, da je bila ekspresija EMX2 močno navzdol reguliranih v osmih od devetih celičnih linij preučiti primerjavi s tisto pri normalnem želodčnega tkiva (P < 0,01, slika 1A). Po drugi strani pa je ena celična linija AZ521 pokazali podoben nivo EMX2 izražanja kot to normalno kontrolo (slika 1A). Da bi odkrili EMX2 izražanje proteinov v vzorcih bolnikov tkiva, je bila imunohistokemija (IHK) izvedena in intenzivnost IHC obarvanje je količinsko ga Image Pro® Plus. Vseh deset analizirajo vzorce, je bilo ugotovljeno, da kažejo bodisi pomanjkanje EMX2 izražanja ali v primerjavi s svojimi običajnimi kolegi znižane ravni EMX2 izražanja v tumorskih tkivih (P < 0,01, slika 1B). Da bi ugotovili morebitno vlogo EMX2 v patoloških napredovanje raka človeškega želodca, smo analizirali EMX2 izraza z celotno RNA, ki smo jih pridobili od petnajst želodca vzorcev displazijo in dvajset rakom želodca kirurških vzorcev. Ugotovili smo, da je EMX2 izraz občutno navzdol reguliranih v vzorcih displazijo (P < 0,05). skoraj izgubljena v vzorcih raka primerjavi s tisto pri odraslih normalno želodcu tkiva (slika 1C), kar kaže, da lahko pride pri neinvazivno predrakavih fazi EMX2 downregulation

Popravek med EMX2 izražanja in njeno promotor metilacije Status

preučiti smo metilacijskega statusa promotorja EMX2 v devetih želodčnih raka celičnih linijah in normalno želodčnega tkiva. Regije CpG otokov (CGI), so bile ugotovljene z MethPrimer od -800 do -470 in -55 do 459 v primerjavi s pričakovanimi prepis start mestih (+1) v EMX2 gena (slika 2A). Stanje metilacija smo analizirali s pomočjo bisulfita zaporedja (BS) (slika 2B) in metilacija-specifične PCR (MSP) (Sliki 2C-2D). Naša BS in rezultati izrabe PPN pokazala, da je EMX2 promotor v normalnih želodčnih celic, tkiv in AZ521 nemetiliran, medtem ko je v ostalih osmih celičnih linij pregleda je bilo gosto metiliramo (sliki 2B-2C). Ti rezultati so skladni z ravnmi EMX2 izražanja v teh celičnih linijah: visoko v normalnem tkivu in AZ521, vendar nizko v drugih osmih celičnih linij pregledanih. Zmes metiliranega in nemetiliran pasu je bilo v več celičnih linij, vključno MKN28, N87, in SNU16 kaže delno metilacije. Poleg tega smo ugotovili, da je stanje metilacija vzorcev pacientov tkiva s PPN razkrijejo v skladu z ravnmi EMX2 izražanja v teh vzorcih (slika 2D, so bile proučene štiri od desetih parov vzorcev tkiva zaradi nedostopnosti genomske DNA iz drugih šest parov ). Ti podatki kažejo, da so lahko downregulation od EMX2 izražanja posledica njegovega promotorja hiper-metilacije raka želodca.

Da bi še dodatno raziskati povezavo med EMX2 izražanja in promotorja metilacije smo obdelan MKN28 in AGS celičnih linij z inhibitor metiltransferaze DAC in inhibitor TSA histon deacetilaze. Celično linijo AZ521 bila uporabljena kot negativna kontrola za svoj promotorski regiji nemetiliran. Opazili smo, da je bila specifična skupina unmethylation znatno povečal (slika 3a) s stopnjami EMX2 izražanja molekul ustrezno (slika 3B) ob zdravljenju DAC v obeh AGS in MKN28 celic, medtem ko so v AZ521 celicah ostala nespremenjena (slika 3). Zdravljenje TSA imela minimalne vplive na metilacijskega statusa in EMX2 stopnjah izražanja. Skupaj, naši rezultati jasno kažejo navzdol-ureditev EMX2 izražanja je bistveno povezana z EMX2 promotorja hypermethylation raka človeškega želodca.

inhibicijo celične rasti, ki jih adenovirusa-dostavljeno EMX2 in vitro

Mi poleg preučila vlogo EMX2 na rast celic želodca rakavih celic. Rast AGS in MKN28 celic je bistveno zatreti na okužbo z adenovirus izražanje EMX2 (Ad-EMX2) v primerjavi s praznim nadzor nad prenašalci (Ad-ctrl) (P < 0,001, slika 4A), medtem ko je rast AZ521 celic ni vplivalo (P > 0,05, slika 4A). Te ugotovitve so bile potrjene tudi z formacijo kolonija testom (slika 4B). Naši rezultati kažejo, funkcijo proti širjenju EMX2 v želodčnih rakavih celic

Zatiranje NT signalne poti, ki jih Adenovirus dostavljena EMX2

Funkcija EMX2 je bila povezana z NT signalne poti.; Zato smo raziskovali odnos med EMX2 in NT signalizacijo na raka želodca. Uporabili smo Topflash /Fopflash novinar test za merjenje TCF /LEF-odvisno transkripcijske aktivnosti, ki jih kanonske NT poti urejeno. Ugotovili smo, da je TCF /LEF-odvisno prepisovanje dejavnost močno zavira Ad-EMX2 v AGS in MKN28 celic nimajo lastnih EMX2 izraz (P < 0,05), vendar ne v AZ521 celic, ki izražajo endogene EMX2 (P > 0,05, slika 5A). Dosledno, vsebnosti beljakovin v citosolnega beta-catenin in kanonične NT poti v smeri toka cilje c-myc in ciklin D1 so zatreti v tem letnem pregledu rasti in MKN28 celic, okuženih z Ad-EMX2, vendar ne v AZ521 celic (obnova EMX2 izražanja v teh celičnih linijah po okužba ad-EMX2 je potrdil zahodni) (slika 5B). Da bi še dodatno preuči ustreznost NT pot navzdol ureditev in zatiranju jedrskega orožja s strani Ad-EMX2 smo transfektirali in izrazil stabiliziran beta-catenin (S45Y mutacij) v teh želodčnih rakavih celic, okuženih z Ad-EMX2. Opazili smo, da prekomerno izražanje beta-catenin znatno zmanjšalo dušenje učinek rasti Ad-EMX2 v obeh letnem pregledu rasti in MKN28 celic (P < 0,01), vendar ne v AZ521 celic (slika 5C). Če povzamemo, ti rezultati potrjujejo pomembno vlogo EMX2 v zatiranju NT poti z rakom želodca.

Zatiranje Rak želodca rast, ki jo adenovirusa-dostavljeno EMX2 in vivo

Ugotovili smo v MKN28 in AGS ksenotransplantskih modeli raziskati terapevtski potencial, adenovirus podal EMX2 za rakom želodca in vivo
. En teden po okužbi, miši, ki nosijo lokalne tumorjev v razponu od 50 do 100 mm ^{2 prejela neposredno intratumorska injekcijo 1 x 10 9-plaque tvorijo enote navedenega adenovirusa. Rast tumorjev v okuženih miših Ad-EMX2 bili bistveno počasneje kot pri kontrolni skupini (P < 0,05 Slika 6A zapustila dva panela). Ob zaključku mase iz poskusa tumorja pri Ad-EMX2 okuženih miši tudi bistveno manjše kot pri kontrolni skupini (P < 0,05 za MKN28 tumorja, P < 0,01 za AGS tumorja, Slika 6A desno ploščo). Obarvanjem intenzivnost proliferativne označevalca Ki67 tumorskih vzorcev ob zaključku poskusa so pokazali, da dajanje po Ad-EMX2 bistveno zmanjšana-67 Ki obarvanje (P 0,01, slika 6b), ki kažejo inhibicijo proliferacije celic v tumorjih. Poleg tega je bilo preživetje Ad-EMX2 okužene skupine bistveno boljši kot pri kontrolni skupini (P = 0,014, slika 6C). V skladu z našimi in vitro
analiza, citosolno β-catenin in kanonično NT procesi nižji stopnji tarče c-myc in ciklin D1 so navzdol reguliranih tudi Ad-EMX2 okuženih MKN28 in AGS tumorjev (obnova EMX2 izražanja v in vivo tumorji so potrdili tudi zahodni) (slika 6D). Skupaj, naši rezultati kažejo, terapevtski potencial, adenovirus dostavi EMX2 za zdravljenje raka želodca.}

Pogovor

Homeobox geni so znana po svojem pomenu v razvoju že desetletja, medtem ko študija ti geni med onkogenezo je še vedno v povojih. Neobičajne homeobox gena izrazi so bile dokumentirane v različnih raka [32], [33], kar kaže na spremembe hemeobox izrazov bi bilo pomembno za onkogenezo. To lahko molekularno osnovo za morebitne klinične aplikacije. Vendar pa je treba še nekaj temeljnih vprašanj, ki jih je treba v celoti obravnavati, vključno molekularne mehanizme, ki poganjajo v abnormalnih in nadaljnjim ciljev in signalnih poti, ki spodbujajo onkogenezo. V tej študiji, nudimo vpogled v ta vprašanja, ki jih preiskuje EMX2 v človeškega raka želodca.

Naša študija poroča o precejšnjem zmanjšanju in izgubo EMX2 izražanja v želodcu raka celičnih linij in primarnih tumorskih tkivih, in pokazala, da je downregulation je pomembno povezana s hiper-metilacije promotorja EMX2, kar kaže na epigenetsko utišanje kot pomemben mehanizem za EMX2 disregulacijo raka človeškega želodca. Dejansko je epigenetsko sprememba predlagana kot ključni mehanizem, odgovoren za homeobox genov downregulation ali utišanje v drugih vrstah raka tkiva, kjer so ti geni delujejo v zatiranju tumorja [14], [32]. Poleg tega je naš opazovanje EMX2 dowregulation v neinvazivno želodca displazijo podpira morebitno pomembno vlogo EMX2 v patološkega napredovanje raka človeškega želodca. Ena od omejitev naše raziskave je število vzorcev tkiv analiziranih. je treba preučiti, da bi še dodatno potrditev ugotovitve metilacije-utišanje EMX2 v raka želodca Večje število vzorcev bolnikov. Kljub temu so naši rezultati so prvi neposreden dokaz, da podpre ta mehanizem v raka želodca in prepoznajo EMX2 kot domnevnega novega zaviralnih raka želodca.

Poleg tega smo raziskovali pomembne onkogeni poti, preko katerih EMX2 delovala rakom želodca in ugotovil, da lahko NT signalizacijo poti igrajo ključno vlogo posredniško funkcijo EMX2. prikazano smo v testih orožja, da je visoka izraz eksogenega EMX2 bistveno zatreti rast želodca raka celičnih linij, ki nimajo endogeni izražanje genov (AGS in MKN28 celice), v skladu s prejšnjimi poročili je ta razlika v EMX2 izražanja negativno korelirana s širjenjem v drugih vrstah rakavih celic [ ,,,0],24], [25]. tudi Pokazali smo, da je bila NT signalizacijo pot močno zavira EMX2 in vivo
in in vitro
, ki zagotavlja dodatne dokaze, ki bi lahko NT signalizacija pot posrednice funkcijo EMX2 v raka, kot je že predlagal [22 ].

na koncu so naši rezultati kažejo na možnost uporabe EMX2 genske terapije za zdravljenje raka želodca. Okužba tumorjev z Ad-EMX2 bistveno zatreti orožja in kar je še pomembneje, izboljšanje skupnega preživetja. Omeniti je treba, da je sistem za dostavo smo uporabili za zdravljenje rekombinantni adenovirus serotipa 5 (Ad5), najpogosteje uporabljen vektor v več vrstah genski terapiji raka [11], [12], [34], [35]. V primerjavi z adeno-asociiran virusni (AAV) in retrovirusnih dostavnih sistemov adenovirusnih vektorjev, kot Ad5, očitno imajo veliko prednosti. Na primer, adenovirusni vektorji imajo širok tropizma omogoča učinkovito ciljanje na mnogih tkivih interesov, veliko koristne obremenitve in učinkovitosti glede visoke pretvorniškim na sistem AAV [10] in tudi ne-vključevanje značilnosti, ki sicer povzroči tveganje za naključno mutagenezo genoma [ ,,,0],10], [36] [36] [37] [38]. Poleg tega se lahko adenovirusni vektorji biti zasnovan tako, da z rakom selektiven onkolitični virusi [39] [40] [41], ki so ključnega pomena za klinično uporabo genske raka terapije. Vendar pa je še vedno veliko izzivov uporabe adenovirusnih vektorjev za zagotavljanje genske terapije pri bolnikih. Na primer, lahko jih hitro izgubi iz celice, ki se hitro delijo po okužbi. Drugi dejavniki, ki vplivajo na klinično uporabo adenovirusno izvajanju vključujejo pakirne zmogljivosti in vrsto gostitelja adenovirusnih vektorjev, njihovo izražanja genov profil in težnja, da izzove imunski odziv, še posebej pomembno, če je potrebno večkratno dajanje [42], [43]. Kljub temu je naš in vivo
študija okužbe Ad-EMX2 kažejo, da ima lahko EMX2 genska terapija lahko postanejo klinični anti-tumor terapevtska strategija za zdravljenje raka želodca v prihodnosti.

• Plos ONE: Diferencialni Izražanje fosfolipaze C Epsilon 1 je povezana s kronično atrofični gastritis in želodca Cancer
• Plos ONE: utišanje XB130 je povezan tako z prognozo in Chemosensitivity želodčne Cancer