PLoS ONE: Галектин-3 Облегчает подвижность клеток в рака желудка путем повышающей регуляции Протеаза-рецептор, активируемый-1 (PAR-1) и матриксных металлопротеиназ-1 (ММР-1)

Абстрактный

Фон
<р> Galectin-3, как известно, регулирует метастазирования рака. Тем не менее, не был определен основной механизм. Благодаря исследованиям ДНК микрочипов после галектин-3 глушителей, мы показали здесь, что галектин-3 играет ключевую роль в повышающей регуляции выражения протеазы активированного рецептора-1 (PAR-1) и матрица металлопротеиназы-1 (ММР-1) PAR-1 способствуя тем самым желудочной метастазирования рака.

Методология /Основные выводы
<р> Мы исследовали уровни экспрессии Galectin-3, PAR-1 и ММР-1 в тканях рака желудка пациента, а также влияние глушителей этих белков с конкретными миРНК и чрезмерного их выражения с использованием специфических Ленти-вирусные конструкции. Мы также использовали данио модель эмбриона для анализа В естественных условиях
клеток желудка вторжения. Эти исследования показали, что: а) галектин-3 глушителей уменьшает экспрессию PAR-1. б) галектин-3 избыточная экспрессия повышает клеточную миграцию и инвазию и это увеличение может быть отменено PAR-1 глушителей, указывая, что галектин-3 увеличивает клеточную миграцию и инвазию через PAR-1 до-регулирования. с) галектин-3 непосредственно взаимодействует с АР-1 транскрипционный фактор, и этот комплекс связывается с PAR-1 промотор и приводы PAR-1 транскрипции. d) галектин-3 также усиливает фосфо-паксиллина, нисходящую цель PAR-1, за счет увеличения ММР-1 выражение. ММР-1 глушителей блоки фосфо-паксиллина амплификации и клеток, вызванное вторжением галектина-3 избыточная экспрессия. е) Сайленсинг либо галектина-3, PAR-1 или ММР-1 значительно сократить миграцию клеток в сосуды в данио модели эмбриона. е) Галектин-3, PAR-1, и ММР-1 высоко выражены и колокализуются в злокачественных тканей от больных раком желудка.

Выводы /Значение
<р> Галектин-3 играет ключевую роль активирующий рецептор клеточной поверхности путем расширения производства протеазы и повышает желудка метастазирование рака. Galectin-3 имеет потенциал, чтобы служить в качестве полезной фармакологической мишени для профилактики желудка метастазирование рака
<р> Образец цитирования:. Ким S-J, Шин J-Y, Ли K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Парк SH, и др. (2011) Галектин-3 Облегчает подвижность клеток в рака желудка путем повышающей регуляции Протеаза-рецептор, активируемый-1 (PAR-1) и матриксных металлопротеиназ-1 (ММР-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. DOI: 10.1371 /journal.pone.0025103
<р> Редактор: Жан-Марк Vanacker, Институт де Génomique Fonctionnelle де Лион, Франция
<р> Поступило: 18 мая 2011 года; Принято: 23 августа 2011 года; Опубликовано: 22 сентября, 2011
<р> Copyright: © 2011 Ким и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование был поддержан Национальным центром рака (НКК) Республики гранта Корея (НКС-0910150 и НКС-0810060), инновационный научно-исследовательский институт клеточной терапии, Республика Корея (A062260), и это исследование было поддержано программой исследований Basic442 науки через Национальный исследовательский фонд (СИФ) при финансовой поддержке Министерства образования, науки и техники (1031790-1), Республика Корея. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> раки, которые распространяются (метастазировать) от их оригинального сайта на другой участок тела, называются метастазами рака. метастатического рака имеют плохой прогноз и высокую смертность [1]. Полное понимание биологического механизма (ов), участвующих в метастазировании и рациональных подходов к предотвращению или управления метастазирование может привести к практическим подходам к улучшению выживаемости пациентов, страдающих метастатическим рака. В предыдущих исследованиях, мы обнаружили, что галектин-3 увеличивает клетку рака желудка моторики путем повышающей регуляции fascin-1, актин-цитоскелета белка группирования [2]. Галектин-3 представляет собой белок 31 кД углевода-узнавание, участвует в онкогенеза, рост и метастазирование раковых клеток [3], [4], [5] и его высокая экспрессия в нескольких человеческих раковых клеток было обнаружено, коррелирует с плохим прогнозом метастатического рака.
<р> Для выяснения роли галектина-3 в метастазирования рака, мы разобранном свое выражение в раковых клетках желудка, используя его миРНК и исследовали результаты в экспрессии генов с помощью анализа ДНК микрочипов [6]. Среди предыдущих результатов, мы обнаружили значительное снижение уровня протеаз-активированный рецептор-1 (PAR-1), члена семейства трансмембранных G-белками рецепторов [7], и его активатора, матрица металлопротеиназы-1 ( ММР-1) (рис S1). Расколотая PAR-1 является автоматическим фосфорилируется и трансдуцированная внеклеточным сигналом (ами) через различные пути, и играет важную роль в метастазирования опухоли [7], [8], [9]. Избыточная экспрессия PAR-1 было сообщено в нескольких видов рака, в том числе меланом, рака молочной железы и рака желудка. ММР-1 также повышающей регуляции в самых разнообразных поздних стадиях рака, и значительная отрицательная корреляция наблюдалась между ее экспрессии и выживаемости пациентов [10], [11], [12], [13]. Кроме того, несколько исследований показали, что MMP-1 играет решающую роль в метастазирования рака молочной железы [14], печени и рака толстой кишки [15], и рака желудка [16], [17], среди других. Оказывается, что когда-то секретируется, MMP-1 способствует инвазию раковых клеток путем деградации внеклеточного матрикса и /или подслизистых слоев лимфатической [10], [14]. Многочисленные исследования показали, что ингибирование ММР приводит к торможению инвазии клеток [18], [19].
<Р> HESE выводы привели нас к предположению, что галектин-3, PAR-1 и ММР-1 могут быть вовлечены в усиление миграции и инвазии рака желудка. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели исследования для их роли в клеток рака желудка. В обоих случаях в пробирке
и виво
исследования в области, мы использовали данио модель эмбриона для определения их влияния на миграцию и инвазии раковых клеток с живыми органелл. Мы также определили уровни экспрессии галектина-3, PAR-1 и ММР-1 в злокачественных тканях от больных раком желудка для клинических корреляций между этими белками в человеческих образцах.

Результаты

Глушащий галектин -3 или PAR-1 уменьшает миграцию и инвазию клеток рака желудка человека
<р> уровни экспрессии галектина-3 и PAR-1 были высокими в большинстве желудочных линий раковых клеток. Мы притихли Galectin-3 и PAR-1 в MKN-28 клеток, использующих соответствующие миРНК. Лечение с галектин-3 миРНК пониженные уровни экспрессии обоих галектина-3 и PAR-1, в то время как PAR-1 процедура миРНК снизился только PAR-1 выражение в то время как никакой разницы не наблюдалось в галектин-3 (рис 1А). Трансфекция СНУ-638 клеток, которые изначально не проявляют экспрессии Галектин-3, с галектин-3-кодирующей плазмиды приводит к увеличению экспрессии обоих PAR-1 и галектин-3 (Фигура 1В). Глушащий либо галектин-3 или PAR-1 снижается общее число мигрирующих ( р
&л; 0,001) (рис 1C) и вторжение в клетки ( р
&л; 0,001) (рис 1D), почти наполовину. Эти данные показали, что галектин-3 увеличилась PAR-1 экспрессию и как Galectin-3 и PAR-1 модулированный желудка миграцию раковых клеток и инвазию.

Galectin-3 усиливает миграцию клеток рака желудка /вторжения путем увеличения PAR-1 выражение
<р> Мы исследовали связь между галектин-3-индуцированных увеличением миграции клеток и вторжения с одной стороны, и PAR-1 выражение с другой стороны. Мы заражены SNU638 клетки с лентивирусов, содержащей кассету экспрессии галектин-3, и исследовали выражения галектина-3 и PAR-1 и миграции измеряемой ячейки. Мы обнаружили, что избыточная экспрессия галектина-3 сопровождалось увеличением ПАР-1 мРНК и белок выражений (рис 2А), а также миграцию клеток (<ЕМ> р
≪ 0,001) (Фигура 2В) и инвазию клеток ( р
&л; 0,001) деятельность (рис. 2в) Эти увеличения были снижены на PAR-1 глушителей. Эти результаты свидетельствуют о том, что галектин-3 способствует миграции и инвазии клеток рака желудка путем до регуляции PAR-1.

Galectin-3 способствует PAR-1 транскрипции путем взаимодействия с AP-1 комплекса
<р> затем мы попытались выяснить, как галектин-3 регулирует PAR-1 выражение. Потому что это было сообщено, что AP-1 транскрипционных деятельность регулируется Galectin-3 [20], мы сосредоточились на роли этого фактора транскрипции в этой связи (рис 2D). Мы провели исследования иммунопреципитации и определили, что галектин-3 непосредственно взаимодействовали с обоими Фра-1 и С-июня в комплекс АР-1, и что это взаимодействие было связано с повышающей регуляции АР-1 транскрипционной активности (рис 2E). Далее, мы исследовали активность связывания ДНК АП-1 с и без галектина-3 микросхемой анализа (рис 2F). Мы обнаружили, что комплекс АР-1 связан промотор PAR-1 в присутствии галектина-3, но не в его отсутствии. Мы также оценивали транскрипционную активность АР-1 с помощью анализа люциферазы после трансфекции репортерной плазмидой, содержащей АР-1 фиксирующей последовательности перед люциферазы вождения минимального промотора в LacZ или галектина-3 сверхэкспресирующим СНУ-638 клеток ( р
&л; 0,001) (рис 2G). Транскрипционной активности АР-1 значительно увеличился в галектина-3 сверхэкспресирующим клетки, но не в LacZ над-экспрессирующих клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что галектин-3 способствовало связывание промотора ПАР-1, путем взаимодействия с комплекс АР-1, тем самым увеличивая ПАР-1 экспрессию путем регуляции транскрипции.

Галектин-3 повышает экспрессию ММР-1 и активация PAR-1 сигнализации
<р> MMP-1 сообщалось регулировать активацию PAR-1 путем расщепления PAR-1 тросовой внутриклеточной сигнализации, и влиять на вторжение клеток [21]. Как показано на рисунке S1, мы показали, что галектин-3 регулируется ММР-1 выражение. Таким образом, мы подтвердили взаимосвязь галектина-3, ММР-1 и PAR-1. Мы проанализировали уровни экспрессии мРНК MMP-9, которая является нижестоящей мишенью PAR-1 [8], после того, как глушителей галектин-3, ММР-1 и PAR-1 по отдельности (рис 3А). В то время как галектин-3 глушителей снижала экспрессию всех трех молекул (MMP-1, ПАР-1 и ММР-9), ММР-1 глушение уменьшается только MMP-9 выражение, а не те, галектина-3 или PAR-1. Интересно, что PAR-1 глушителей получают те же эффекты, MMP-1 глушителей. Мы также обнаружили фосфорилирования белка цитоскелета паксиллина (pY181), отличительной чертой активации PAR-1 [22], [23]. После того, как глушителей галектин-3, ММР-1 и PAR-1 по каждому отдельному случаю, была снижена phosphorylaion из паксиллина, который предложил Galectin-3 также регулируется PAR-1 активность. Мы также проверили снижение ММР-9 активности после глушителей галектина-3, ММР-1 и PAR-1 по отдельности (рис 3А).

Galectin-3 сверхэкспресирующим SNU638 клетки показали увеличение уровня экспрессии ММР -1 и PAR-1 белок, а также их мРНК, в дополнение к фосфорилированным паксиллина (pY181). В этих клетках, ММР-1 глушение снижается фосфорилирование паксиллина без изменения экспрессии галектина-3 или PAR-1 (рис 3б). Кроме того, ММР-1 глушение снижается вторжение клеток, которая инициируется галектина-3 по-выражения ( р
&л; 0,001) (рис 3C), откуда следует, что галектин-3 увеличилась ММР-1 приводит к экспрессии активация PAR-1 сигнализации.

Избыточная экспрессия ММР-1 в раковых клетках увеличивает вторжение клеток путем активации PAR-1 сигнализации
<р> Мы подтвердили, что до регуляции ММР-1 по галектина-3 имеет важное значение для активации PAR-1 сигнализации и повышенной клеток рака желудка инвазии. Лентивирус (pLECE3 Вектор), содержащий ММР-1 кассету экспрессии, регулируемый CMV-промотора был получен и в инфицированных AGS клеток рака желудка (рис 4A-B). Как и следовало ожидать, MMP-1 сверхэкспрессии увеличило инвазии потенциал клеток рака желудка, и PAR-1 глушение значительно изменила это увеличение ( р
&л; 0,001) (рис 4В). Это также подтверждается тем фактом, что избыточная экспрессия ММР-1 увеличилась фосфорилирование паксиллина, и что дополнительное глушение PAR-1 заблокирован такого фосфорилирования (рис 4а). В ММР-1 сверхэкспрессией клетки, галектин-3 глушителей снижала экспрессию PAR-1, но не то, что ММР-1, а также фосфорилирование паксиллина и клеточной инвазии (рис 4A-B). Эти наблюдения указывают, что избыточная экспрессия ММР-1 увеличилась раковых клеток invasivity активацией PAR-1 сигнализации. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что галектин-3 повышал экспрессию обоих PAR-1 и ММР-1, и что повышенная экспрессия ММР-1 активируется ПАР-1 сигнализации, которая, в свою очередь, облегчило инвазии раковых клеток. Эти события схематически изображены на рисунке 4C.

Сайленсинг galecin-3, PAR-1 или ММР-1 блоков желудка миграции раковых клеток В естественных условиях
в данио модели
<р> Трансгенные данио, Tg (kdrl: EGFP) s843
[24], выразить EGFP конкретно в их сосудистую систему. Соответствующие данио эмбрионы являются прозрачными с зелеными флуоресцентными судов. Мы использовали эти рыбы для проведения В естественных условиях
исследования желудка миграции клеток человека рак (рис 5А). Когда красный флуоресцентный меченые клетки AGS вводили в желточный мешок из эмбрионов данио на 48 HPF (ч после оплодотворения), большинство трансплантированных клеток AGS были расположены в центре желтка эмбрионов на 4 ч после трансплантации ( ТВД). После того, как 26 HPT, как нормальные и scRNA трансфицированные клетки мигрировали в магистральный области, и проживал в сосуде ствола и /или хвоста у эмбрионов на 50 ТВД. Тем не менее, количество мигрировавших клеток AGS, в котором каждый из галектина-3, PAR-1 или ММР-1 замалчиваются, значительно уменьшилось (Фиг.5В). Мы также подсчитывали количество эмбрионов данио, которые отображают мигрирующих клеток и полученные результаты показаны (рис S2). Восемьдесят четыре девяносто три процента эмбрионов данио, которые были пересажены с контрольными клетками или scRNA обработанных клеток, отображаемые клетки, мигрирующие в их туловища и хвоста судов при 50 ТВД. Тем не менее, только от 7 до 11% эмбрионов, которые были пересажены с клетками, в которых галектин-3, PAR-1 или ММР-1 были молчащих, показаны миграции клеток. Эти результаты свидетельствуют о, что во-первых, данио модель эмбрион может быть использован для контроля миграции клеток рака желудка в качестве живого животного, а во-вторых, что глушение каждого из галектина-3, PAR-1 и ММР-1 вызвало значительное снижение желудка миграции раковых клеток в естественных условиях
.

Выражения галектина-3, PAR-1 и ММР-1 повышены, параллельно, в злокачественных тканях больных раком желудка
<р> Мы определили мРНК и уровни экспрессии белка галектина-3, PAR-1 и ММР-1 в нормальных и злокачественных тканей из 20 больных раком желудка, затем используют RT-PCR с использованием анализатора изображения J. Как показано на рисунке 5С и рис S3, 73,7% больных раком показали более высокие уровни экспрессии галектина-3 и 70% из них показали более высокие уровни ПАР-1 и ММР-1 в их злокачественных тканей, чем у их нормальных аналогов. Кроме того, среди Galectin 3-положительных пациентов, 71,4% были также PAR-1 положительно в то время как 64,3% были также ММР-1 положительный (рис 5D). Эти данные указывают на то, что существует параллельное увеличение экспрессии галектина-3, а также PAR-1 и ММР-1, в злокачественных желудочных тканей. Мы также обнаружили, что эти белки колокализуются в злокачественных областях тканей, а не в незлокачественных областях (рис 5в). Галектин-3 присутствовал в обоих цитозоле и ядра, в то время как PAR-1 и ММР-1 рассматривались в основном в цитозоле и мембраны в пределах той же самой области (5С). Эти результаты свидетельствуют о том, что оба PAR-1 и ММР-1 выражения достоверно коррелирует с galctin-3 экспрессии в больных раком желудка.

Обсуждение
<р> Это исследование показало, что галектин-3 расширение желудка миграцию раковых клеток и вторжение. Механически, это связано Galectin-3 повышающей регуляции PAR-1 рецептором клеточной поверхности, а также активность ММР-1 протеазы. Это согласуется с докладами, которые демонстрируют корреляцию между экспрессией PAR-1 и опухолевой инвазии и метастазирования в язвы желудка и некоторых других видов рака [25], [26], [27]. Это исследование является первым, чтобы продемонстрировать непосредственное взаимодействие галектина-3 и АР-1 сложных компонентов, C-Jun и Фра-1, а также регулирования PAR-1 по выражению АР-1 транскрипционный фактор. Так как уже было показано, другие, что избыточная экспрессия Фра-1 способствует инвазии раковых клеток и метастазирование [28], повышающей регуляции PAR-1 по с-Jun и Fra-1, казалось, возможный механизм, объясняющий связь галектина-3, индуцированной повышающей регуляции PAR-1 рецептором клеточной поверхности, а также активность ММР-1 протеазы. Эта возможность поддерживается нашими результатами параллельных и колокализуются выражений галектина-3 и PAR-1 в злокачественных тканях больных раком желудка.
<Р> Это новое наблюдение, что Galectin-3 увеличивает ММР-1 выражение , Очевидно, что избыточная экспрессия ММР-1 может увеличить желудка вторжения активность раковых клеток, блокируя клетки к клетке и клетки для матричных взаимодействий путем деградации ECM. Таким образом, увеличение ММР-1 выражение способствует галектина-3 могут иметь двойной эффект, а именно, PAR-1 активации и деградации ECM, и оба имеют решающее значение для желудка метастазирование рака. Тем не менее, как галектин-3 регулирует ММР-1 выражение до сих пор неясно, потому что экспрессия ММР-1 регулируется целым рядом сложных событий, включая перекрестные помехи между несколькими транскрипционных факторов, таких как-1 AP, преобразователь сигнала и активатор транскрипция-3, MAP киназы, и гипоксия-индуцируемый фактор-1 в условиях гипоксии [29], [30], [31].
<р> Создание данио ( Danio rerio
) модель эмбриона для изучения миграции и инвазии клеток рака желудка является особым достижением данного исследования, поскольку подходящие животные модели не были доступны для изучения не человеческого желудка метастазирования рака до сих пор. Данио модель для изучения генной инженерии рака и /или опухолевые ксенотрансплантаты, имеет много преимуществ, в том числе возможности прямого и обратного генетического анализа, прозрачности эмбрионов [32], а также пригодности для GFP маркировки сосудов [32], [33], [34]. Это исследование показало, что RFP маркированы желудочные раковые клетки вторгся кровеносные сосуды в то время как галектин-3, MMP-1 или PAR-1 притихли желудочные раковые клетки не могли. Таким образом, данио эмбрион кажется перспективной моделью для изучения инвазию и метастазирование раковых клеток, хотя дальнейшие исследования явно необходимо, чтобы подтвердить этот вывод.
<Р> В заключение, наши исследования показали, что галектин-3 ускоряются рак желудка подвижность клеток путем повышающей регуляции ФАР-1 и ММР-1. Необходимы дальнейшие исследования, очевидно, что необходимо для установления роли галектина-3 в метастазирования рака и его пригодность в качестве терапевтической мишени для выбранных видов рака.

Материалы и методы

ТКАНЕЙ

Пары 2 мм образцы размером биопсии были получены от аденокарциномы желудка тканей у 20 пациентов, перенесших диагностическую эндоскопию и эндоскопическую подслизистую диссекцию, в Национальном онкологическом центре в Корее, после получения их письменного информированного согласия. Образцы ткани замораживали в жидком азоте при температуре -70 ° С сразу после биопсии до использования. Некоторые из образцов ткани были paraffindized для иммуногистохимического исследования, по мере необходимости. Эти исследования были одобрены Институциональным наблюдательным советом Национального онкологического центра (# NCCNSH 03-024).

Культура клеток и миРНК трансфекциях
<р> Умеренно дифференцированные аденокарциномы желудка клеточных линий человека, AGS, MKN- 28 и СНУ-638 были получены из Кореи клеточной линии банка и поддерживается, как описано ранее [35]. siРНК, используемый в трансфекциях, были предоставлены Invitrogen (Carlsbad, CA). Их последовательности галектин-3 (LGAL3) миРНК; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', ПАР-1 миРНК; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', и ММР-1 миРНК; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Трансфекция проводились с использованием Липофектамин RNAiMAX реагента (Invitrogen), следуя инструкциям изготовителя. Индукция переходных галектин-3 сверхэкспрессии в клетках СНУ-638 была достигнута с помощью pcDNA3.1 /NT-галектин-3 с pcDNA3.1 /NT-GFP. Для контроля лечения нормализация, желудочные линии раковых клеток обрабатывали 1 мкг по LTX реагентами (Invitrogen).

Выделение РНК и RT-PCR анализ
<р> Общую РНК выделяли из клеток рака желудка человека и образцы пациентов ткани с использованием TRIzol реагента (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Обратный транскриптазы ПЦР проводили с использованием системы обратного транскрипции (Promega Corp. USA), следуя инструкциям изготовителя. были использованы праймеры: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(смысловой) и 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (антисмысловой) для человеческого LGAL3 (галектин-3) гена; 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(смысловой) и 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3' (антисмысловой) для человеческого F2R гена (PAR-1); 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(смысловой) и 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (антисмысловой) для человеческого гена ММР-1; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(смысловой) и 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (антисмысловой) для человеческого гена ММР-9; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(смысловой) и 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (антисмысловой) для бета-актина гена человека; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(смысловой) и 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (антисмысловой) для человеческого глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). ПЦР проводили в объеме 20 мкл с использованием Taq Ex (Takara). Цикл амплификации (денатурация 95 ° С в течение 1 мин, отжига 60 ° С в течение 1 мин и удлинительной стадии при 72 ° С в течение 2 мин) повторяли 32 раз с последующим конечным удлинением в течение 10 мин при 72 ° С.

Строительство Galectin-3 выражения Ленти-вирусный вектор и инфекции
<р> полнометражный человек галектин-3 экспрессирующих построить пкДНК3.1-NT-GFP-gal3, вектор pcDNA3.1-NT-GFP и Ленти-вирусный вектор для сверхэкспрессии LacZ, галектин-3 (1-250) в pLL3.7 были описаны ранее [2]. F2R человек был клонирован в pLECE3 в сайтах рестрикции BamH1 фермента и not1, создавая pLECE3-F2R (PAR-1) построить. Полноразмерные кДНК F2R, ММР-1, а также контроль MRFP были использованы для ПЦР-амплификации, вместе с праймерами, перечисленными в данных S1, и полученный ПЦР-фрагменты были клонированы в вектор pLECE3 использованием РАС1 и Hpa1 рестрикционные сайты, создавая pLECE3 -ПММ-1 конструкция. Кроме того, сайт MRFP из pGEM-T-Easy вектор был переведен в pLL3.7 вектор, заменяющей область GFP с помощью Age1 и EcoR1 рестрикционные сайты, чтобы сделать pLL3.7-MRFP. Ленти-вирусный вектор производство было описано ранее [2]

Вестерн-блот-анализ
<р> клеточных лизатов экстракций получали с RIPA буфере (1% NP-40;. 0,1% додецилсульфата натрия; 0,5 % дезоксихолат; 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис, рН 7,5) и протеазы inhibiter коктейль. 20 мкг общего белка каждого лизата был решен в 8-12% SDS-PAGE гелей и электрогидравлический переносили на PVDF мембрану, а затем блокировали в 5% обезжиренном молоке в 0,05% твин-20 с 1 × PBS (PBST). Поликлональные первичные антитела, анти-Галектин-3, анти-ThrombinR (PAR-1), анти-с-Jun, анти-фра-1 и анти-β-актина (Santa Cruz), анти-ММР1 (Калбиохем), анти- паксиллина и анти-фосфо паксиллина (pY181) (Epitomics) инкубировали с блоттинга при 1:1000 разведении в минимальных объемах 5% БСА (бычий сывороточный альбумин) в буфере PBST в течение 1 ч комнатной температуре или в течение ночи в 4 ° с. Анти-мышь или анти-кроличий козьи конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные антитела (GE Healthcare UK Limited), инкубировали при 1:5000 разведении 5% БСА в буфере PBST в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Белки интерес были обнаружены усиленной хемилюминесценции (ECL) (Amersham Corp, Арлингтон-Хайтс, Иллинойс, США).

иммунопреципитация
<р> экстракты клеточных лизатов получали с IP + буфера (20 мМ Hepes, 1 % Triton X-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 100 мМ NaF, 10 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ ортованадат натри, 0,2 мМ ФМСФ, 10 мкг /мл ингибитора протеазы коктейль) во льду в течение 30 мин. После удаления мусора путем центрифугирования (13200 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 20 мин), супернатанты подвергали стадии preclearing с белком A /G агарозном бисером при температуре 4 ° С в течение 30 мин в ротатора. Супернатанты, полученные после короткого центрифугирования (2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 4 мин), подвергали иммунопреципитации с использованием анти-galectin3 и нормального IgG мыши (отрицательный контроль). Иммуноосадки дважды промывали в буфере (IP-20 мМ Hepes, 1% Triton X-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 100 мМ NaF, 10 мМ пирофосфат натрия). После того, как 30 мкл 2 × ДСН-буфера выборок Кроме того, с последующим кипячением при 95 ° С в течение 5 мин. После того, как супернатанты, полученные после короткого центрифугирования, их уровни экспрессии белка определяли с помощью Вестерн-блот-анализ выполняется.

Immunohistochemistry

Для галектина-3 и PAR-1 иммуногистохимии, депарафинировали желудка срезов ткани больных раком были оставлены в микроволновой печи в течение 15 мин в цитратном буфере (Vector Laboratories), а затем инкубировали с 3% H <суб> 2O <суб> 2 в течение 15 мин, чтобы блокировать эндогенной пероксидазы с последующей инкубацией с 10% нормальной козьей сыворотки (Vector лаборатории) в 1 × PBS в течение 10 мин. Первичные антитела использовали анти-Galectin-3 (1:200) анти-MMP1 (Epitomics) и анти-PAR-1 (1:200) антитела (Santa Cruz), а следующий шаг сделан в соответствии с указаниями Vectastain®ABC комплект (Vector Laboratories). Продукты визуализировали диаминобензидино (DAB) комплекты (Vector Laboratories).

Желатин зимографии
<р> Кондиционированные среды были получены из культур MKN-28 желудка линий раковых клеток и концентрировали с помощью Vivaspin 6 (Сарториус ). Концентрированные супернатанты в 6 × Фос буфере были разделены на 10% SDS геле, содержащем 1 мг /мл желатина. Каждый инкубировали в 100 мл реакционного буфера зимографии и окрашивали Био-безопасной кумасси ™ G-250 (Bio-Rad Laboratories). После того, как Обесцвечивание, острые прозрачные полосы, указывающие на активность разжижающий желатин визуализировали на синем фоне.
Анализы

Transfilter миграции и инвазии
<р> Для миграции transfilter и вторжения анализа, мы использовали MKN-28 и SNU-638 клетки. Клетки трансфицировали киРНК в течение 1 дня, изолированный и добавляют в верхних камерах пор вставляет Transwell с коллагена типа L (BD) биологических наук фильтров, покрытых анализа миграции, и Матригель (BD Bioscience) фильтры с покрытием, к вторжению анализов. Среду RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков (GIBCO) добавляли в нижнюю камеру с последующей инкубацией в течение 20 часов. Перенастройка и вторгшиеся клетки были количественно определены после того, как H &Amp; E окрашивание. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях и данные представлены в виде средних значений.

Хроматиновые иммунопреципитации
<р> иммунопреципитации хроматина (CHIP) анализы проводили с использованием набора ЧИП анализа (Millipore). Образцы наносили на посуде после того, как были проведены галектин-3 лечение миРНК и анализы в соответствии с инструкциями изготовителя. Анти-Galectin-3, анти-с-Jun, анти-Fra-1 и нормальной мыши /кролика IgG были использованы для иммунопреципитации ДНК, содержащие комплексы. Перед ПЦР, праймеры были подготовлены для AP-1 с PAR-1 промотор сайтов связывания -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') и PAR-1 промотор сайт -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). ПЦР проводили с Taq Ex (Takara).

люциферазы анализы
<р> Точка доступа-1 люциферазы репортер плазмиды, полученные от доктора Sung-Pil Yoon Национального онкологического центра в Корее и исследований эффектов галектина-3 на АР-1 транскрипционной активности в LacZ и галектина-3 сверхэкспресирующим клетки были выполнены в соответствии с предыдущим докладом [2]. По истечении 48 часов клетки собирают и активность люциферазы измеряли с использованием системы анализа люциферазы (Promega) в соответствии с инструкциями изготовителя. Каждый эксперимент был проведен в трех экземплярах и данные представлены в виде средних значений

Миграция клеток анализ с использованием модели данио
<р> Трансгенные данио линия Tg (kdrl: EGFP). ^{s843
[24], в котором EGFP специфически экспрессируется в сосудистую сеть, поддерживалась в соответствии с принятыми стандартными операционными процедурами [36] утверждено по уходу и использованию комитета Institutional животных в Национальном онкологическом центре в Корее; номер разрешения: НКК 11-116. Мы получили зебра эмбрионов рыб из национального онкологического центра данио аква-комнате. Трансплантация клеток рака проводили в соответствии с Nicoli и др [37] с небольшими изменениями. Если коротко, то dechorionated эмбрионы анестезировали Tricaine (Sigma), и раковые клетки вводили (от 150 до 200 на эмбрион) в центры эмбриональных желтка мешочков на 48 часов после оплодотворения (часов после оплодотворения) с использованием микроманипулятор (Narishige) и пневматический Picopump (WPI ), снабженном из боросиликатного стекла иглой. Эмбрионы были сохранены после процедуры трансплантации и исследовали на миграцию раковых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Для получения изображений, эмбрионов и личинок обрабатывали N-фенилтиомочевины (Sigma) с 12 часов после оплодотворения, чтобы предотвратить пигментацию и исследовали с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа (Carl Zeiss) под эпифлуоресцентной оптики. Флуоресцентные изображения были захвачены с ПЗС-камерой (Carl Zeiss). Стабильные флуоресцентных желудочные клеточные линии AGS (MRFP) были получены с помощью Ленти-вирусной инфекцией с pLL3.7-MRFP с последующим FACS сортировки.}

микрочипов анализа данных
<р> микрочипов проводили в AGS, рак желудка клеточная линия после глушителей галектина-3, как было описано ранее [6]. Результаты микрочипов были загружены на GEO (GSE29630).

Анализ статистики
<р> Данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение от по меньшей мере 5-10 изображений, полученных из трех независимых экспериментов с использованием микроскопа (× 100, × 200), если не указано иное. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего теста ANOVA с использованием программного обеспечения Prism. Данные считаются существенными, если р
&л;. 0,05

Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Silenced галектин-3 с миРНК в клетки рака желудка привело к изменениям в подвижность клеток, связанных экспрессии генов. А, В числе анализ ДНК микрочипов, мы выбрали подвижность клеток, связанных с ген ММР-1, ММР-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (ИАП-1), и показали, кратное соотношение изменения , В, обнаружение экспрессии мРНК ММР-1, ММР-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (ИАП-1) с помощью с помощью ПЦР. β-актин был использован в качестве контроля нормализации
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF) Рисунок S2
.
Количество эмбрионов данио с перенесенной отношением клеток. Обнаружение клеток желудка чисел AGS (RFP) после того, как пересаженные из AGS (RFP) в данио рыбы эмбриона с лечением специфической миРНК (Galectin-3, ММР-1 и PAR-1) с отрицательной контрольной scRNA (рис 5A-B). Он показал, количество мигрировавших клеток на embyos подсчитывали и показано в процентах
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0025103.s002
(TIF) Рисунок S3
.
ОТ-ПЦР анализ уровня мРНК галектина-3, ММР-1 и PAR-1 в больных раком желудка.

• PLoS ONE: Опухоль-Log Шансы лимфоузлов-Метастазы Staging System, многообещающая новая Клиническая классификация рака жел…
• PLoS ONE: Honokiol Индуцирует кальпаином-опосредованной глюкозо-Регулируется Белково-94 Расщепление и Апоптоз в клет…