PLoS ONE: Снижение микроРНК-202-3p экспрессии, роман опухолевого супрессора, в желудочном Cancer

Абстрактный
<р> вытекая исследования показали, что микроРНК участвуют в развитии и прогрессировании рака. Здесь мы обнаружили, что микроРНК-202-3p часто понижающей регуляции в желудочном раковых тканей. Сверхэкспрессия MIR-202-3p в раковых клетках желудка MKN-28 и КУП-823, заметно подавленной пролиферации клеток и индуцированного апоптоза клеток и в пробирке
и В естественных условиях
. Кроме того, выражение Gli1 часто был положительным в желудочном раковых тканях и обратно коррелирует с микроРНК-133B выражения. Показано, что транскрипционный фактор Gli1 был мишенью MIR-202-3p и играет существенную роль в качестве посредника биологических эффектов MIR-202-3p при раке желудка. MIR-202-3p также ингибирует экспрессию гамма-катенина и Bcl-2. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК-202-3p может функционировать в качестве нового опухолевого супрессора при раке желудка и его противоопухолевой активностью могут приписать прямое адресно и ингибирование Gli1
<р> Citation:. Чжао Y, Li C, Ван М, Су L, Цюй Y, Li J, и др. (2013) Снижение микроРНК-202-3p экспрессии, роман опухолевого супрессора, в рака желудка. PLoS ONE 8 (7): e69756. DOI: 10.1371 /journal.pone.0069756
<р> Редактор: Уильям К. С. Чо, больницы королевы Елизаветы, Гонконг
<р> Поступило: 28 февраля 2013; Принято: 11 июня 2013 года; Опубликовано: 25 июля 2013
<р> Copyright: © 2013 Чжао и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование была поддержана грантами от Национального фонда естественных наук Китая (пп. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 и 81272749), науке и технике комиссии Шанхайского муниципалитета (пп. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 и 12PJ1406300) Ключевые проекты в Колонном Национальной программы по науке и технике Китая (№ 2011BA203191), Научно-исследовательский фонд докторской программы высшего образования Китая (№ 20110073110071), ключевой проект Комитета по образованию Шанхай (№. 12ZZ102, 12ZZ105) и Фонд инноваций для PhD Выпускники Shanghai Jiao Tong University школы медицины (BXJ201213). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных злокачественных опухолей и второй наиболее распространенной причиной рака, связанных смерти во всем мире [1]. Несмотря на успехи в лечении, выживаемость больных с GC вызывает разочарование, это в основном из-за скудности конкретных терапевтических целей. Поэтому крайне важно, чтобы определить молекулярные механизмы, лежащие в основе развития рака желудка.
<Р> MicroRNAs (миРНК) представляют собой класс небольших (18-25 нуклеотидов), некодирующей одноцепьевые эндогенных РНК. Они подавляют экспрессию белка, взаимодействуя с совершенными или несовершенных комплементарных последовательностей, расположенных в районах 3'untranslated (3'UTRs) генов-мишеней. Исследования в течение последних нескольких лет показали, что микроРНК Нарушение регуляции играют важную роль в различных онкологических заболеваний [1] - [4], в том числе GC [5] - [13]. Данные исследования по микроРНК и их гены-мишени могут обеспечить интересные терапевтические возможности [3].
<Р> Недавно мы определили несколько микроРНК дерегулируемых в GC, такие как понижающей СИК-126 [14], микроРНК-409-3p [15], микроРНК-625 [16], и повышающая регуляция микроРНК-21 [17], микроРНК-301а [18]. Хотя многие микроРНК были определены общение с GC, механизм этих микроРНК в желудочном онкогенеза еще необходимо исследовать. В нашей предыдущей работе, были выявлены многочисленные предполагаемые микроРНК, которые показали дифференциальную экспрессию между ГЦ тканей и прилегающих к ним неопухолевых тканей из 28 пациентов [19]. Среди них, микроРНК-202-3p был одним из наиболее значительно снизилась микроРНК. Однако роль микроРНК-202-3p в GC редко исследуется.
<Р> MIR-202-3p, предыдущий названный HSA-микроРНК-202, расположенный в хромосомной хрупком месте в 10q26. Удаление хрупкого сайта было связано с эндометрия [20], опухолей головного мозга [21], [22]. MIR-202 было сообщено быть дерегулированы при раке молочной железы [23], [24], рак шейки плоскоклеточный [25], колоректальный рак [26] и фолликулярная лимфома [27]. Petrocca и др. обнаружили, что микроРНК-202 был вниз регулируется при хроническом гастрите [28]. MIR-202 было показано, что подавлялась при 4-hydroxynoneal (HNE) в HL-60 лейкозных клеток [29]. Недавнее исследование также показало, что микроРНК-202 непосредственно нацелен на прото-онкогенов MYCN, что приводит к торможению пролиферации клеток нейробластомы [30].
<Р> Здесь мы демонстрируем общее снижение микроРНК-202-3p уровня экспрессии в 150 ГК ткани по сравнению с тканями неопухолевых и обнаружили, что микроРНК-202-3p уровни связаны с размером опухоли и возраста пациентов. Кроме того, мы обнаружили, впервые, что микроРНК-202-3p может ингибировать рост и индуцирует апоптоз клеток GC и в пробирке
и В естественных условиях Ру по непосредственно нацеливание фактор транскрипции Gli1 и ингибировать экспрессию генов-мишеней Gli1 γ-катенина и BCL-2.

Материалы и методы

Этика Заявление
<р> Письменное информированное согласие было получено от всех участников. Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований человеческого из Жуйцзинь больницы, школы медицины, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), Комитета по этике лабораторных животных из Жуйцзинь больницы (LAEC 11-062) путем. Процедуры на животных были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным по уходу и использованию комитета Institutional Animal (IACUC) по крайней Shanghai Jiao Tong University, Шанхай, Китай.

Культура клеток

Человеческие GC клеточные линии СГК -7901 и КУП-823 были приобретены из Шанхая институтом биологических наук, китайской академии наук (Шанхай, Китай). клеточные линии MKN-45 и MKN-28 были получены из японской Cancer Research Resources банка (Токио, Япония). NCI-N87, АГС, КАТО III и СНУ-1 клеточные линии были первоначально приобретены из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, USA). Человеческой эмбриональной почки линия клеток 293Т (НЕК-293Т) сохранилась в нашем институте. Клетки хранили, восстановленные из криоконсервации в жидком азоте и использовали на ранних пассажах. Все клетки поддерживали в среде RPMI-1640, плюс 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и культивировали в 5% CO2 увлажненной атмосфере. Экспоненциально растущие клетки были использованы для экспериментов.

Тканей пациентов
<р> Первичные ткани GC и совпадающая ткани неопухолевой были получены от 150 пациентов, перенесших радикальную GC гастрэктомию в отделении хирургии, Жуйцзинь больница, школа медицины, Shanghai Jiao Tong University. Образцы были быстро замораживали непосредственно после операции. Все образцы были подтверждены независимой гистологического исследования. Ни один из пациентов не получали предоперационное лечение. Для всех пациентов, клинико-патологическими информация была доступна. Опухоль классификации в соответствии с Международным союзом против рака (2009).

Выделение РНК и количественный ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)
<р> Суммарную РНК экстрагировали из клеточных линий и образцов тканей с использованием Trizol реагента (Invitrogen, Carlsbad, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрации и чистоту образцов РНК определяли с помощью электрофореза и спектрофотометрическим методами. Уровни экспрессии микроРНК-202-3p и U6 малой ядерной РНК (RNU6B) анализировали в трех повторностях методом стволовых петля RT-PCR с использованием Шпилька-она ™ микроРНК КПЦР количественного определения Kit (GenePharma, Шанхай, Китай) со специфическими праймерами formiR-202-3p и U6 небольших ядерных РНК (RNU6B). Относительное выражение микроРНК из MIR-202-3p нормализовалось против эндогенного контроля, U6, используя метод DDCT. Уровни мРНК Gli1 и GAPDH были измерены в трех повторах с использованием SYBR Green ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, США), следуя инструкции производителя. Количественное было сделано с использованием относительного метода количественного определения DDCT с человеческой GAPDH в качестве внутреннего контроля. Были использованы следующие праймеры: Gli1 (смысл: 5'-GGA АГТ САТ ACT CAC НКУ TCG А-3 'антисмысловой: 5'-CAT ТГК ТГА AGG СТТ ТАС ТГК А-3') [31] и GAPDH (смысл: 5'-GGA GAC CCT CTG CCG TCT AG-3 'антисмысловой: 5'-GTA GCC CAG GAT GCC СТТ GA-3'.)

Переходный Трансфекция микроРНК мимики
<р> зер- 202-3p подражает (дцРНК олигонуклеотиды) и отрицательные mimics1 управления (NC) (смысл: 5'-UUC UCC GAA ГЕ GUC ACG УТТ-3 ', антисмысловой: 5'-ACG УЗА CAC ГУУ CGG AGA ATT-3') были приобретены от GenePharma (Шанхай, Китай). Клетки высевают в 6-луночные планшеты за день до трансфекции, чтобы обеспечить 40% сплошности клеток в момент трансфекции. Трансфекция микроРНК мимика в клетки проводили с Липофектамином 2000 ™ (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии методикой производителя. Мимика микроРНК использовали при конечной концентрации 100 нМ.

пролиферации клеток Анализ
<р> Через 24 ч после трансфекции с микроРНК мимике, клеток (2 × 10 3 клеток /лунку ) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 72 часов. пролиферации клеток оценивали в трех повторах водорастворимыми соли тетразолия (WST) анализа с использованием клеточной счетная Kit-8 (Dojindo, Кумамото, Япония) и измеряли в соответствии инструкцией изготовителя.

мягком агаре колонии Формирование пробирного

микроРНК подражает трансфецированные клетки ресуспендировали с 0,3% мягкой агарозы (A9045, низкая температура желатинизации, Sigma-Aldrich, США) в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS и наслаивали на 0,4% затвердевших агар в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS в 6-луночные планшеты (1 × 10 ^{3 клеток /лунку) при 24 ч после трансфекции. Планшеты инкубировали в течение 2-х недель. Колонии, содержащие по крайней мере, 50 клеток подсчитывали.}

Апоптоз Анализ
<р> За один день до трансфекции миРНК мимике, 1 × 10 6 клеток высевали в 6-луночные планшеты. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки собирали и окрашивали AnnexinV /PI двойной комплект Окрашивание (BD Biosciences, США) в соответствии с протоколом производителя. Апоптотических клеток оценивали в трех повторах и повторяли три раза независимо друг от друга с помощью проточной цитометрии на FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, США).

Ретровирусное Трансфекция для стабильных клеточных линий
<р> геномная область, которая включала первичный транскрипт MIR-202-3p клонировали в сайт EcoRI-XhoI-модифицированного ретровирусного вектора pMSCV-GW-РФА-ПГК-EGFP. Отрицательные управляющие векторы не имели вставки. НЕК 293T-клетки (1 × 10 6 /лунку) засевали в 6-луночные планшеты за день до трансфекции. Десять мкг ретровирусной конструкции, содержащей либо микроРНК-202-3p или отсутствие вставки, 2 мкг ГАГ /Pol и 2 мкг VSVG котрансфицируют в НЕК 293T клетки с использованием Липофектамин ™ 2000 реагента и OPTI-MEM I уменьшенный сыворотки среды в каждой пластина. Вирусы собирали через 48 ч и 72 ч после трансфекции вирусными сбора среды (RPMI-1640 с добавлением 10% прогретой инактивированной FBS + 1% глютамина + 20 мМ Hepes). Инфекции клеток MKN-28 были проведены в присутствии 8 мкг /мл полибрена в каждую лунку 6-луночного планшета. Клетки спин инфицированных при 1500 оборотах в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре. Вирус-содержащий супернатант удаляли через 2 ч. Положительные клетки были выбраны для экспрессии GFP с помощью FACS-сортировкой и назвали RV-MIR-202-3p и RV-MIR-контроль, соответственно. MIR-202-3p выражение было подтверждено QRT-PCR.

роста опухоли в голых мышах

Мужчина BALB /с ню /ню мышей в возрасте шести недель (Институт зоологии Китайской академии наук), были размещены в определенном патогена среде в лаборатории группы животных, школа медицины, Shanghai Jiao Tong University, Китай. Мыши получали гуманного ухода и протоколы исследования были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным Institutional Animal Care и использование комитета (IACUC) по крайней Shanghai Jiao Tong University, Шанхай, Китай. Клетки (100 мкл, 2 × 10 ^{6 клеток) из устойчивых трансфицированных линий были собраны и привитых подкожно в мышей RV-микроРНК-202-3p или RV-микроРНК-контроль. Шесть мышей использовали для каждой группы. Мыши были проверены еженедельно, и опухолевые узелки были измерены с суппортом. Объем опухоли (V) была оценена с помощью уравнения V = 4 /3π × L /2 × (W /2) 2, где L есть длина средней оси, и W является средней оси width.The опухолевые клетки позволили ростовых 5-недельных и кривые роста опухоли и рассчитывали, ингибирующие ставки. После того, как мыши были пожертвованы, все опухолевые трансплантаты вырезают, взвешивают, собирали, фиксированный и заливали. Каждый эксперимент проводили дважды.}

TUNEL анализ
<р> Терминал nucleotidyl трансферазы опосредованной ник конец этикетирование анализа (TUNEL) выполняли в соответствии с инструкциями изготовителя из комплекта Тупик колометрической TUNEL System ™ (Promega, США). Ткани фиксировали в 10% формалине нейтрализованного и заливали в парафиновые блоки. Разделы (4 мкм) были затем подготовиться к экзамену. После депарафинизации срезы обрабатывали 20 мкг /мл протеиназы К в течение 10 мин, с 0,3% Н <суб> 2O <суб> 2 в метаноле в течение 10 мин и 0,1% Тритон Х-100 в 0,1% цитрата натрия в течение 2 мин на льду. Затем срезы инкубировали с TUNEL реакционной смеси в течение 60 мин при 37 ° С. Далее инкубацию с конъюгированным с пероксидазой антителом проводили в течение 30 мин при 37 ° С. Срезы окрашивали диаминобензидина раствор в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем контрастно гематоксилином.

Иммуногистохимия
<р> Разделы (толщиной 6 мм) из фиксированных формалином, парафин опухоли specimenswere депарафинировали в ксилол и регидратации в градуированном спирте. Эндогенный пероксидазы блокировали с использованием 3% H <суб> 2O <суб> 2 в течение 10 мин. После извлечения антигена в цитратном буфере (рН 6,0), срезы ткани инкубировали с нормальной козьей сыворотки, чтобы блокировать неспецифическую связывания антитела (20 мин при комнатной температуре). Затем срезы инкубировали с антителами Gli1 (1:50, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), при 37 ° C в humidchambers в течение 2 часов. После промывания PBS три раза, срезы инкубировали с конъюгированным с пероксидазой анти-кроличьего IgG в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем предметные стекла промывали PBS и инкубировали в течение 5 мин с ДАБ в течение менее чем 30 мин. Гематоксилином был использован для counterstaining

Конструирование плазмид и люциферазы Анализ активности
<р> а 203 п.н. полная длина дикого типа (WT) Gli1-3'UTR или мутант Gli1-3 '. УТР (мут), содержащий предполагаемую микроРНК-202-3p сайт связывания синтезировали (Sangon, Шанхай, Китай). После переваривания SpeI и HindIII, фрагменты дикого типа и мутантных Gli1-3'UTR были клонированы в сайты SpeI и HindIII из pMIR-Отчет люциферазы вектора (Applied Biosystems), и названный pMIR /Gli1 и pMIR /Gli1 /Mut, соответственно. Секвенирование ДНК использовали для проверки конструкции.
<Р> Клетки НЕК-293Т, высевали в 24-луночные планшеты за 24 ч до проведения анализа. В каждую лунку 100 нг pMIR /Gli1 или pMIR /Gli1 /Мут, 2 нг ПРЛ-TK (Promega, Madison, WI, USA), содержащей Renilla люциферазы и 100 нМ микроРНК мимика были котрансфицируют использованием Липофектамин ™ 2000 реагента и Opti-Memi снижается сыворотки среда. Относительная активность люциферазы была рассчитана через 48 ч после котрансфекции с использованием Dual-Glo люциферазы (Promega, США) в соответствии с методикой производителя. активность люциферазы Firefly нормализовалось к активности люциферазы Renilla.

Вестерн-блот анализ
<р> Клетки и опухоли подвергали лизису с помощью M-PER реагентов и Halt ингибиторов протеаз Коктейльные наборы (Pierce, США). Концентрацию белка в клеточных лизатах определяли количественно с использованием BCA Protein Assay Kit (Pierce, США). Белки разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и блоттинга на 0,22 мкм поливинилидендифторидную мембраны (Millipore, MA, USA). Были использованы следующие специфические антитела: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-катенина (1:2000, BD Biosciences, США), Bcl-2 (1:2000, EPITMICS, США), и GAPDH (1: 20000, Abcam, Великобритания). уровни белка были нормированы к полному GAPDH

Построение Gli1 плазмиды экспрессии и трансфекции
<р> Усиливая кДНК MKN-28 с использованием следующих праймеров:. смысле (5'- AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 ') и антисмысловой (5'- ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3'), полнометражный Gli1 был получен, усваиваются EcoR V и Not I и клонировали в pcDNA3.1 вектор (Invitrogen) и назван pcDNA3 0,1-Gli1. Секвенирование ДНК использовали для проверки конструкции.

Клетки высевают в 6-луночные планшеты за день до трансфекции, чтобы обеспечить 80-90% сплошности клеток в момент трансфекции. В каждую лунку, клетки трансфицировали 250 пмоль микроРНК-202-3p мимике или контролем, вместе с 4 мкг pcDNA3.1-Gli1 или pcDNA3.1 пустым вектором, с использованием Липофектамин 2000. WST анализ проводили через 24 ч после трансфекции, в то время как анализ апоптоза проводили при 48 ч после трансфекции.

Статистический анализ
<р> Непрерывные переменные сравнивались с использованием Стьюдента т
тест для нормально распределенных переменных и Уилкоксона тест суммы рангов для распределенных переменных nonnormally. Взаимосвязь между уровнями микроРНК-202-3p экспрессии и клиникопатологическими параметров анализировали с помощью хи-квадрат Пирсона тест. Все значения представлены в виде средних значений ± ДСН. Все статистические анализы были проведены с использованием PASW Statistics 18.0 программного обеспечения (IBM, США). Два хвостами значение P
&л;. 0,05 считалось статистически значимым

Результаты

Выражение MIR-202-3p уменьшается в GC и соотносит с клиникопатологическими Параметры изображения <р> Выражения MIR-202-3p были рассмотрены QRT-ПЦР в опухолевых тканях и соответствующего неопухолевых тканей от 150 GC больных (рис. 1А). Результаты показывают, что экспрессия микроРНК-202-3p была значительно подавлена ​​в опухолевых тканях по сравнению с согласованными тканей неопухолевых у 68% (102/150) пациентов ГХ. (Р &ЛТ; 0,001; рис. 1а, б)

Для дальнейшего выяснения корреляции между уровнем экспрессии микроРНК-202-3p и клиникопатологическими факторов в человеческом GC, в 150 случаях были дополнительно проанализированы (таблица 1). На основе относительной микроРНК-202-3p выражении, в 150 случаях были разделены на 3 группы: микроРНК-202-3p низкая экспрессия (/отношение опухоли неопухолевой < 0,66, п = 85), микроРНК-202-3p умеренное выражение (опухоли /неопухолевой отношение 0.66-1.5, п = 34) и микроРНК-202-3p высокий уровень экспрессии (/отношение неопухолевой опухоли > 1,5, п = 31). Мирский-202-3p уровни экспрессии отрицательно коррелировали с размером опухоли и положительно коррелирует с возрастом у этих пациентов с микроРНК-202-3p низкой экспрессией группы показали значительно больший размер опухоли (р = 0,013) и старшего возраста по сравнению с умеренной или высокие группы экспрессии (р = 0,028). Тем не менее, микроРНК-202-3p уровни экспрессии не показали каких-либо отношений с пола, дифференциации, локализации опухоли, опухоли местного вторжения, метастазов в лимфатических узлах или стадии TNM.

Гиперэкспрессия MIR-202-3p Угнетает GC пролиферации клеток
<р> Учитывая, что микроРНК-202-3p значительно уменьшается в GC, она может функционировать как опухолевый супрессор. Таким образом, мы исследовали оверэкспрессия MIR-202-3p в GC клетках, влияет ли рост клеток. клеточные линии MKN-28 и КУП-823, у которых экспрессия микроРНК-202-3p были самыми низкими в восьми протестированных GC клеточных линий (рис. 1в), были выбраны для последующих expreiments. Синтетические микроРНК-202-3p подражает и отрицательного контроля мимических молекулы (NC) трансфицировали в MKN-28 и КУП-823 клеток соответственно. Эктопическая экспрессия микроРНК-202-3p в клетках было подтверждено QRT-PCR.
<Р> Анализ клеточного роста WST показали значительное инертность роста клеток в MKN-28 клеток, трансфицированных микроРНК-202-3p (рис. 2.А). Аналогичные результаты наблюдались в КУП-823 клеток (рис. 2б). Для дальнейшей характеристики эффекта MIR-202-3p на рост клеток, мы провели мягкий агар анализ образования колоний в трансфицированных клетках. Мы обнаружили, что число колоний от MKN-28 клеток, трансфицированных микроРНК-202-3p мимике было почти половина, что из-под контроля и родительской группы (рис. 2в). Аналогичные результаты наблюдались в КУП-823 клеток (рис. 2.d). Эти результаты показывают, что микроРНК-202-3p может подавлять пролиферацию клеток GC клеток в пробирке
.

Гиперэкспрессия микроРНК-202-3p GC клеток Апоптоз
Индуцирует <р> С торможение роста может из-за прогрессирования заблокированного клеточного цикла или повышенным апоптозом, мы в следующий раз предварительно анализ цикла клеточного деления и апоптоза методом проточной цитометрии. Наши данные свидетельствуют о том, что Апоптические частота как MKN-28 и КУП-823 клеток, трансфицированных микроРНК-202-3p мимике были значительно повышающей регуляции (рис. 3, б). Тем не менее, не было значительной разницы в клеточном цикле между по-разному обработанными группами (данные не показывают). Эти результаты показали, что избыточная экспрессия микроРНК-202-3p индуцирует апоптоз в клетках GC может способствует ингибирующие свойства роста MIR-202-3p.

Гиперэкспрессия MIR-202-3p Угнетает туморогенности и способствует апоптозу в естественных условиях

<р> Учитывая, что микроРНК-202-3p ингибирует рост GC клеток и индуцирует апоптоз в пробирке
, мы затем исследовали, может ли микроРНК-202-3p подавляют рост опухоли и вызвать апоптоз в естественных условиях
. были получены Клетки MKN-28, RV-MIR-202-3p (MKN-28 клеток с ретровирус-опосредованного микроРНК-202-3p стабильной экспрессии) или РВ-микроРНК-регулирования (MKN-28 клеток с пустым вектором), как описано в материалах и методах. Клетки вводили подкожно голым мышам. Образование опухоли контролировали. Время латентность опухоли показал существенное различие между мышей, которым вводили клетки RV-микроРНК-NC и RV-микроРНК-202-3p клеток (рис. 4а). Представляет значительный интерес, что опухоли, полученные из RV-микроРНК-202-3p клетки росли существенно медленнее, чем RV-микроРНК-контрольной группы на протяжении роста опухоли (рис. 4б). Средний вес опухолей в результате RV-MIR-202-3p была значительно меньше, чем опухоли, полученные из RV-MIR-контроля (рис. 4C, D).
<Р> Кроме того, были проведены анализы TUNEL опухолевых тканей. Как показано на рис. 5E, RV-микроРНК-202-3p клетки показали больше опухолевых клеток положительное окрашивание и значительно более высокий, чем апоптический индекс RV-микроРНК-контрольными клетками ( P
&л; 0,01). Эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-202-3p ингибирование туморогенности объясняется повышенным апоптозом В естественных условиях
.

MIR-202-3p нацелены непосредственно на Gli1
<р> Чтобы понять механизм лежащие в основе опухолевые-ингибирующих свойств MIR-202-3p в GC, мы искали его предполагаемых генов-мишеней с потенциальными про-онкогенных функций с помощью онлайн-инструментов поиска (RNAhybrid и Miranda алгоритмы), а также гены, предсказанные оба биоинформатики инструментов были выбран в качестве кандидата целевых генов микроРНК-202-3p. Среди сотен генов-кандидатов и предсказывалось, транскрипционный активатор Gli1 представляет особый интерес (рис S1). Предполагаемая вторичная структура РНК гибрид для человеческого MIR-202-3p и Gli1 показан на рисунке S2. Gli1 сообщалось высоко выражена в GC [32], [33]. Он предположил, что уменьшение экспрессии Gli1 привело к ГХ ингибирования роста линии клеток и апоптоз [33].
<Р> Еще один намек о потенциальной роли микроРНК-202-3p в регуляции экспрессии Gli1 пришли из анализа восемь различных желудочных линии клеток рака (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, КАТО III, КУП-823 и MKN-28). Статистический анализ показал значительное перевернутую паттерны экспрессии между микроРНК-202-3p и Gli1 ((г = -0,345, P
&л;.. 0.001, рис 5А)
<р> Для оценки клинической значимости из этих результатов, мы исследовали корреляцию между выражениями Gli1 с микроРНК-202-3p экспрессии в тканях GC. мы обнаружили, что Gli1 и микроРНК-202-3p демонстрируют обратное паттерн экспрессии в тканях GC (таблица 2). Эти результаты подтверждают предпосылка, что подавление MIR-202-3p повышает уровень гена Gli1 при раке желудка.
<р> люциферазы анализы были проведены для проверки прямого взаимодействия между микроРНК-202-3p и в 3'UTR из Gli1. люциферазы репортеры были построены, содержащие либо дикого типа Gli1 3'UTR последовательность в том числе сайта микроРНК-202-3p связывания (pMIR /Gli1) или мутантного Gli1 3'UTR (pMIR /Gli1 /Мут) (рис. 5б). pMIR /Gli1 и pMIR /Gli1 /Mut люциферазы конструкции трансфицировали в клетки НЕК-293Т, наряду с MIR-202-3p или NC мимике. относительную активность люциферазы репортера pMIR /Gli1 было в значительной степени подавлено сравнению с pMIR /Gli1 /Мут в микроРНК-202-3p-зависимым образом (рис. 5С). Этот результат указывает на то, что сильно 3'UTR из Gli1 осуществляет прямые сайты связывания микроРНК-202-3p.
<Р> Для того, чтобы определить, на уровне мРНК или уровня белка MIR-202-3p вниз регулируется Gli1, мы обнаружили выражение Gli1 по QRT-PCR и Вестерн-блоттинга. Как показано на рис. 5E, уровень белка Gli1 был уменьшен в микроРНК-202-3p подражает-трансфицированные MKN-28 клеток по сравнению с NC подражает-трансфицировали и родительские клетки MKN-28. В то же время, не было никакого эффекта MIR-202-3p на уровне Gli1 мРНК (рис. 5D). Эти результаты убедительно показывают, что микроРНК-202-3p негативно регулирует экспрессию Gli1 на трансляционной уровне.
<Р> Среди генов, о которых ингибируют апоптоз GC, γ-катенин (Plakoglobin) и BCL-2 являются прямыми транскрипционные мишени из Gli1 [34], [35]. Как показано на рис. 5E, уровни протеина гамма-катенина и Bcl-2 заметно уменьшено в MKN-28 клеток, трансфицированных микроРНК-202-3p мимике
<р> Кроме того., Мы исследовали экспрессию белка Gli1 в подкожных опухолей, полученных от RV-MIR-контроля и RV-MIR-202-3p у голых мышей с помощью Вестерн-блот-анализа. Уровень белка Gli1 в опухолях из RV-MIR-202-3p продемонстрировали понижающей регуляции по сравнению с таковым в RV-MIR-контроля (рис. 5F). Эти результаты убедительно показывают, что микроРНК-202-3p негативно регулирует экспрессию Gli1 посттранскрипционно.

Гиперэкспрессия Gli1 выручает Влияние MIR-202-3p в GC клетки
<р> Так как MIR-202-3p подавляются Gli1 ингибировать клеточную пролиферацию и индуцирует апоптоз, он рассудил, что избыточная экспрессия Gli1 может реверсировать это явление, по крайней мере частично. Действительно, когда Gli1 гиперэкспрессией плазмиды (pcDNA3.1-Gli1) был введен в MKN-28 или КУП-823 клеток скоротечно, трансфицированных микроРНК-202-3p мимике, тормозящее действие MIR-202-3p на рост клеток был частично восстановлен, которое наблюдалось при анализе роста клеток WST (рис. 6А, В). Кроме того, прогрессирование к апоптозу также сдерживалось, когда Gli1 был избыточно экспрессируется в MKN-28 или BGC-823 клеток трансфицированы с микроРНК-202-3p имитаторов (рис. 6C, D) .Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование роста и апоптоз клеток, индуцированный микроРНК-202-3p, по крайней мере, частично связано с его влиянием на экспрессию Gli1.

Обсуждение
<р> Накопленные доказательства демонстрируют дисрегуляцию специфической микроРНК в GC [4], [13], [36 ]. MIR-202-3p, расположенный в 10q26, как сообщается, будет disregulated при раке молочной железы [23], [24], колоректальный рак [26] и фолликулярная лимфома [27]. Petrocca и др. обнаружили, что микроРНК-202 был вниз регулируется при хроническом гастрите [28]. Тем не менее, роль микроРНК-202-3p в развитии GC и прогрессии по-прежнему Unkown. В этом исследовании мы обнаружили, что микроРНК-202-3p экспрессия 68% образцов карциномы желудка была значительно ниже, чем у подобранных нормальных тканей, предполагая, что восстановленный микроРНК-202-3p выражение является частым событием в GC. Важно отметить, что уровни микроРНК-202-3p отрицательно коррелирует с размером опухоли GC у пациентов. Эти результаты свидетельствуют о ингибиторной роль микроРНК-202-3p в развитии и прогрессировании ГХ.
<Р> Учитывая микроРНК-202 был понижающей регуляции в желудочном раковых тканей, мы предположили, что избыточная экспрессия микроРНК-202 может подавить злокачественные фенотипа клеток рака желудка. В настоящем исследовании мы показали, что восстановление MIR-202-3p в MKN-28 и КУП-823 клеток значительно ингибирует клеточную пролиферацию и индуцирует апоптоз и в пробирке
и в естественных условиях
. Эти результаты убедительно продемонстрировали, что снижение микроРНК-202-3p выражение в GC должно быть фактором, способствующим развитию, а не пострадавших в результате GC. Таким образом, значительное ингибирование ксенотрансплантатов опухолей у голых мышей предполагают, что терапевтические стратегии внедрения MIR-202-3p в раковые клетки могут быть полезны для замедления процесса онкогенеза.

МикроРНК может регулировать экспрессию генов через понижающей регуляции перевод мРНК-мишени или повышающей регуляции деградации мРНК мишеней [3], [37]. На основе биоинформационных алгоритмов, мы определяем Gli1 в качестве возможного прямого целевого гена MIR-202-3p. Gli1, член семьи Gli, первоначально был идентифицирован как амплифицированного гена в злокачественной глиомы [38]. Это сильный позитивный активатор вниз по течению генов-мишеней и сам по себе является транскрипционный мишенью передачи сигналов Shh [39], а также может быть активируемых RAS /ПКС [40], TGF-beta [41] и PI3K сигнализации [42], и подавляются от ПКА [42] и передачи сигналов p53 [43]. экспрессия Gli1 в эпителиальных клетках может вызывать трансформацию клеток, которые характеризуются повышенной пролиферации и анкерного независимый пролиферации [35], [44]. Увеличение числа исследований показывают, что Gli1 гиперэкспрессируется в различных видов рака, включая рак желудка [32], [33], [45], а также уровни экспрессии Gli1 положительно коррелирует с дифференцировки опухоли [33]. Уменьшение экспрессии Gli1 по cyclopamine или миРНК привело к ГХ ингибирования роста клеток и апоптоз [33]. Мы также проверить Gli1 как прямой мишенью MIR-202-3p, мы обнаружили, что микроРНК-202-3p ограничивающая с неполной комплементарности к Gli1 3'UTR и избыточной экспрессии микроРНК-202-3p вниз регулирует Gli1 на уровне белка. Кроме того, статистический анализ показал значительное перевернутую паттерны экспрессии между MIR-202-3p и Gli1 в GC тканях и клеточных линиях. γ-катенин (Plakoglobin) и BCL-2, прямые транскрипционные мишени Gli1, как сообщается, ингибируют апоптоз GC. Выражение Gli1 вниз по течению генов-мишеней гамма-катенина (Plakoglobin) и Bcl-2 [34], [35] заметно снижается, когда микроРНК-202-3p избыточно экспрессируется в клетках GC. Это наводит на мысль о том, что ингибирование роста клеток GC индуцированных MIR-202-3p может частично связана с его подавлением на гамма-катенина и экспрессии BCL-2, которые в свою очередь за счет прямого взаимодействия с Gli1. Важно отметить, что избыточная экспрессия Gli1 спасает клеточного ингибирования роста и апоптоз клеток, индуцированный MIR-202-3p, еще раз доказало, что Gli1 является прямой мишенью MIR-202-3p и предлагая существенную роль для Gli1 в качестве медиатора биологических эффектов микроРНК-202-3p в GC.
<р> Таким образом, микроРНК-202-3p часто уменьшается в рак желудка человека. Восстановление MIR-202-3p ингибирует пролиферацию GC по меньшей мере, частично за счет индукции апоптоза клеток путем прямого взаимодействия с Gli1 (рис. 7). Такие роли микроРНК-202-3p в GC предложить свой потенциал в качестве терапевтического микроРНК для лечения рака желудка, который стоит дальнейших исследований.

подтверждающей информации, рис S1
.

• PLoS ONE: прогностическая значимость сурвивина у пациентов с раком желудка: систематический обзор с мета-анализ
• PLoS ONE: снижение экспрессии AZGP1 связано с плохим прогнозом в первичной рака желудка