abstraktné
Rozvíjajúce sa štúdie ukázali, že microRNA sa podieľajú na rozvoji a progresiu rakoviny. Tu sme zistili, že mier-202-3p bolo často down-regulované v žalúdočných rakovinových tkanív. Zvýšená expresia Mir-202-3p v nádorových bunkách žalúdočnej MKN-28 a BGC-823, výrazne potlačenú proliferáciu buniek a indukovanú apoptózu obaja in vitro stroje a in vivo Citácia :. Zhao Y, Li C, Wang M, L Su, Qu Y, Li J, et al. (2013) Zníženie MIR-202-3p Expression, román nádorového supresor, v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10,1371 /journal.pone.0069756 Editor: William C. S. Cho, nemocnice Queen Elizabeth, Hong Kong Prijaté: 28. februára 2013; Prijaté: 11.06.2013; Uverejnené: 25.července 2013 Copyright: © 2013 Zhao et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané Financovanie :. Táto štúdia bol podporený dotáciou zo národné prírodné Science Foundation Číny (č. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 a 81272749), vedy a techniky komisie magistrátu Šanghaja (č. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 a 12PJ1406300), kľúčové projekty v National Science and Technology piliere Programu Číny (č 2011BA203191), Výskumný fond doktorandské štúdium vysokého školstva v Číne (č 20110073110071), Key Projekt výboru pre vzdelávanie Šanghaj (č. 12ZZ102, 12ZZ105) a nadácie pre inovácie PhD Absolventi Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú Úvod rakovina žalúdka (GC) je jedným z najčastejších zhubných nádorov a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu súvisiace s celosvetovo [1]. Aj keď pokroky v liečbe, miera prežitia pacientov s GC je sklamaním, je to hlavne kvôli nedostatku špecifických terapeutických cieľov. Preto je veľmi dôležité na identifikáciu molekulárnych mechanizmov, na ktorých je vývoj rakoviny žalúdka. mikroRNA (miRNA) sú skupinou malých (18-25 nukleotidov), nekódujúca, jednovláknových endogénnych RNA. Potláčajú expresiu proteínu pôsobením s dokonalými alebo nedokonalým komplementárnu sekvencie nachádzajúce sa v oblasti (3'untranslated 3'UTRs) cieľových génov. Štúdií v posledných rokoch ukázali, že ich poškodeniu miRNA zohrávajú dôležitú úlohu v rôznych druhov rakoviny [1] - [4], a GC [5] - [13]. Údaje zo štúdie o miRNA a ich cieľové gény môžu poskytnúť zaujímavé terapeutické možnosti [3]. V poslednom čase sme identifikovali niekoľko miRNA deregulované v GC, napríklad downregulace MIR-126 [14], MIR-409-3p [15], MIR-625 [16] a zosilnenie Mir-21 [17], MIR-301a [18]. Hoci mnoho miRNA boli identifikované združovať sa s GC mechanizmus týchto miRNA v žalúdku vzniku nádorov je ešte potrebné vyšetriť. V našej predchádzajúcej práci, boli identifikované početné domnelej miRNA, ktoré vykazovali diferenciálnej expresie medzi GC tkanív a ich okolitom normálnom tkanív z 28 pacientov [19]. Medzi nimi, mier-202-3p bol jeden z najviac výrazne znížila miRNA. Avšak role Mir-202-3p v GC je zriedka skúmaná. Mir-202-3p, predchádzajúce pomenovaný HSA-MIR-202, ktorý sa nachádza vo vnútri krehké mieste chromozomálne v 10q26. Výmaz krehké miesta bola spojená s maternicovej sliznice [20], nádory na mozgu [21], [22]. MIR-202 bolo popísané, že deregulované v karcinómu prsníka [23], [24], krčnej dlaždicových buniek [25], kolorektálneho karcinómu [26] a folikulárna lymfóm [27]. Petrocca et al. zistené, že mier-202 sa down-regulované v chronickej gastritídy [28]. MIR-202 bolo preukázané, že je down-regulovaná 4-hydroxynoneal (HNE) v HL-60 leukemických buniek [29]. Nedávna štúdia tiež ukázala, že mier-202 sa priamo zameriava na preto-onkogén MYCN, čo vedie k inhibícii proliferácie buniek neuroblastómu [30]. Tu ukazujeme všeobecný pokles MIR-202-3p úrovne expresie v 150 GC tkaniva v porovnaní s non-nádorovom tkanive a zistíte, že mir-202-3p hladiny sú spojené s veľkosti nádoru a pacienti veku. Okrem toho sme zistili, prvýkrát, že mier-202-3p môže blokovať rast a indukuje apoptózu GC buniek ako in vitro stroje a in vivo materiáloch a metódach Ethics Prehlásenie písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých účastníkov. Štúdia bola schválená etickou komisiou Human pre výskum Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), etickou komisiou laboratórnych zvierat z Ruijin nemocnice (LAEC 11-062). postupy na zvieratách sa vykonávali podľa protokolu schváleného používanie a ošetrovanie výboru Institutional Animal (IACUC) Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Čína. bunkovej kultúre Human GC bunkové línie SGC -7901 a BGC-823 boli zakúpené od Shanghai inštitútov pre biologických vied, čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína). bunkové línie MKN-45 a MKN-28 boli získané z japonského Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japonsko). NCI-N87, AGS, KATO III a SNU-1 bunkové línie boli pôvodne získané od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ľudská obličkové bunkové línie embryonálnych 293T (HEK-293T) bola zachovaná v našom ústave. Bunky boli uskladnené, získané z kryoprezerváciu v tekutom dusíku a použité v skorých pasážach. Všetky bunky boli udržiavané v médiu RPMI-1640 plus 10% fetálne hovädzie sérum (FBS) a kultivované v 5% CO 2 vlhkom prostredí. Exponenciálne rastúce bunky boli použité pre experimenty. Primárne GC tkaniva a prispôsobené non-nádorového tkaniva boli získané od 150 pacientov, ktorí podstúpili radikálnu GC gastrektómii na oddelení chirurgie, Ruijin nemocnice, školy of Medicine, Shanghai Jiao Tong University. Vzorky boli snap-mrazený bezprostredne po operácii. Všetky vzorky boli potvrdené nezávislým patologickým vyšetrením. Žiadny z pacientov bola predoperačné liečbu. U všetkých pacientov, klinicko informácie k dispozícii. Klasifikácia tumor podľa Medzinárodnej únie proti rakovine (2009). Celková RNA bola extrahovaná z bunkových línií a vzorkách tkanív s využitím TRIzolu činidlo (Invitrogen, Carlsbad, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Koncentrácia a čistota vzoriek RNA sa merali pomocou elektroforézy a spektrofotometrické metódy. Hladiny expresie Mir-202-3p a U6 malé jadrové RNA (RNU6B) boli testované v troch vyhotoveniach metódou kmeňových-loop RT-PCR s použitím Vlásenka-it ™ miRNA qPCR Kit (kvantifikačný GenePharma, Shanghai, Čína) so špecifickými primermi formiR-202-3p a U6 malé jadrové RNA (RNU6B). Relatívna miRNA expresie MIR-202-3p bola normalizovaná voči endogénnej kontrole, U6, metódou DDCt. Hladiny mRNA Gli1 a GAPDH boli merané v troch vyhotoveniach s použitím SYBR Green PCR v reálnom čase (Applied Biosystems, USA) nasledujúce inštrukcií výrobcu. Kvantifikácia bola vykonaná pomocou DDCt relatívna metóda kvantifikácie s ľudskou GAPDH ako vnútorná kontrola. Boli použité nasledujúce primery: (Gli1 zmysel: 5'-GGA AGT CAC CAT GCC ACT TCG A-3 'antisencie: 5'-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3'), [31] a GAPDH (sense: 5'-GGA SCS GAC CTG CCG TCT AG-3 'antisencie: 5'-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3'.) Prechodné transfekcia miRNA napodobňuje spätných 202-3p napodobňuje (dsRNA oligonukleotidy) a negatívna kontrola (NC) mimics1 (sense: 5'-GAA UUC UCC CGU GUC ACG UTT-3 'antisencie: 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3') boli zakúpené od GenePharma (Shanghai, Čína). Bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek v deň pred transfekcia pre zaistenie 40% zhlukovania buniek v okamihu transfekcia. Transfekcia miRNA napodobňuje do buniek bola vykonaná pomocou Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa postupu výrobcu. Mierny napodobňuje boli použité pri konečnej koncentrácii 100 nM. /jamku ) boli schovať do 96-jamkové doštičky a inkubované po dobu 72 hodín. Bunková proliferácia bola hodnotená v troch vyhotoveniach podľa vode rozpustný tetrazoliové soli (WST) testu pomocou mobilného počítanie Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonsko) a stanovovať po návodu výrobcu. miRNA napodobňuje transfekované bunky boli resuspendované s 0,3% mäkkého agarózy (A9045, nízke teploty gelovacího, Sigma-Aldrich, USA), v médiu RPMI 1640 obsahujúcom 10% FBS a navrstvená na 0,4% stuhnutie agaru v médiu RPMI 1640 obsahujúcom 10% FBS v 6-jamkové doštičky (1 x 10 3 buniek /jamku) na 24 hodín po transfekciu. Doštičky boli inkubované po dobu 2 týždňov. Kolónie, ktoré obsahujú aspoň 50 bunky boli spočítané. Jeden deň pred transfekcia sa miRNA napodobenín, 1 x 10 6 bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek. Štyridsať osem hodín po transfekciu boli bunky zozbierané a zafarbené AnnexinV /PI dvojité farbenie kit (BD Biosciences, USA) podľa protokolu výrobcu. Apoptotické bunky boli hodnotené v troch vyhotoveniach a opakuje trikrát nezávisle na sebe pomocou prietokovej cytometrie na FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). genómovej oblasti, ktorá zahŕňala primárny transkript Mir-202-3p sa klonom do miesta ECOR-Xhol upraveného pMSCV-GW-RfA-PGK-EGFP retrovirovým vektorom. Negatívne kontrolné vektory nemal vložku. HEK 293T bunky (1 x 10 6 /jamku) boli nasadené na 6-jamkových doštičkách v deň pred transfekcia. Desať ug retrovirového konštruktu, ktorý obsahuje buď MIR-202-3p alebo bez vložky, 2 ug gag /pol a 2 ug VSVG boli kotransfekovány do HEK 293T buniek s použitím Lipofectamine ™ 2000 činidlá a Opti-MEM I znižuje sérové médium v každom plechu. Vírusy boli zozbierané 48 hodín a 72 hodín po transfekciu vírusovými zber média (RPMI-1640 s 10% tepelne inaktivovaným FBS + 1% glutamínu 20 mM HEPES). Infekcia MKN-28 buniek boli vykonávané v prítomnosti 8 ug /ml polybrenu v každej jamky 6 jamkové doštičky. Bunky boli infikované odstreďovaní pri 1500 otáčkach za minútu po dobu 30 minút pri teplote miestnosti. supernatant obsahujúci vírus bol odstránený po 2 hodinách. Pozitívne bunky boli vybrané pre GFP expresiu FACS roztriedenie a pomenovaný RV-MIR-202-3p a RV-MIR-riadenia, resp. Mir-202-3p expresie bola potvrdená QRT-PCR. Muž Balb /c nu /nu myší vo veku šiestich týždňov (Institute of Zoology čínskej akadémie of Sciences), boli umiestnení v určitom prostého patogénov prostredie v Animal Laboratory jednotka, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University v Číne. Myši dostali humánne starostlivosť a študijné protokoly boli vykonané podľa protokolu schváleného používanie a ošetrovanie výboru Institutional Animal (IACUC) Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Čína. Bunky (100 ul, 2 × 10 6 článkov) zo stabilných transfekciou liniek RV-MIR-202-3p alebo RV-MIR-control boli zhromažďované a naočkovaných podkožne myšiam. Šesť myší bolo použité pre každú skupinu. Myši boli kontrolované raz týždenne, a nádorové uzlíky boli merané posuvným meradlom. Objem nádoru (V) bola stanovená pomocou rovnice V = 4 /3π x L /2 x (W /2) 2, kde L je dĺžka strednej osi, a W je stredná os width.The nádorové bunky sa nechali rásť 5 týždňov a nádorových rastových kriviek a inhibujúce rýchlosť bola vyhodnotená. Potom, čo boli myši usmrtené všetky nádorové štepy boli vyňaté, zvážené, zozbierané, pevné, a vložené. Každý experiment bol vykonaný dvakrát. Terminál nucleotidyl transferázy sprostredkované nick end značenie test (TUNEL) bola vykonaná podľa pokynov výrobcu v kitu končiacich ™ Colorimetric TUNEL System (Promega, USA). Tkanivá boli fixované v 10% formalínu neutralizovaný a vložené do parafínových blokov. Oddiely (4 um) potom boli pripravené na posúdenie. Po Deparafinizace, rezy boli ošetrené 20 ug /ml proteinázy K počas 10 minút, s 0,3% H 2O 2 v metanole po dobu 10 minút a 0,1% Triton X-100 v 0,1% citrátu sodného po dobu 2 minút na ľade. Potom boli rezy inkubované s TUNEL reakčnej zmesi po dobu 60 minút pri teplote 37 ° C. Ďalšie inkubácie s peroxidáze konjugovanou protilátkou bola vykonávaná po dobu 30 minút pri teplote 37 ° C. Rezy boli zafarbené Diaminobenzidine roztoku po dobu 10 minút pri teplote miestnosti a potom kontrastne zafarbené hematoxylínom. rezy (s hrúbkou 6 mm), z, zaliatych v parafínu nádoru formalínom fixované specimenswere zbavené parafínu v xylénu a rehydratované v odstupňované alkohole. Endogénne peroxidáza bola blokovaná s použitím 3% H 2O 2 po dobu 10 minút. Po získaní antigénu v citrátovom pufri (pH 6,0), tkanivové rezy boli inkubované s normálnym kozím sérom pre blokovanie nešpecifickej väzby protilátky (20 min pri izbovej teplote). Rezy boli potom inkubované s protilátkami Gli1 (1:50, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) pri teplote 37 ° C v humidchambers počas 2 hodín. Po premytí PBS sa trikrát, boli rezy inkubované s peroxidázou konjugovanou anti-králičie IgG po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Ďalej bola sklíčka opláchnutá PBS a inkubované po dobu 5 minút sa DAB substrát za menej ako 30 minút. Hematoxylin bol použitý pre kontrastným. A 203-bp plnej dĺžke z divokého typu (WT) alebo mutantný Gli1-3'UTR Gli1-3 ' UTR (mut) obsahujúci predpokladaný MIR-202-3p väzobné miesto bol syntetizovaný (Sangon, Shanghai, Čína). Po štiepenie pomocou spei a HindlII, fragmenty divokého typu a mutantný Gli1-3'UTR boli klonované do miest spei a HindIII pMIR-Report Luciferase vektora (Applied Biosystems) a pomenovaný pMIR /Gli1 a pMIR /Gli1 /mut, resp. Sekvenovania DNA bola použitá na overenie konštrukcie. HEK-293T bunky boli schovať na 24-jamkové doštičky 24 hodín pred testom výkonu. V každej jamky 100 ng pMIR /Gli1 alebo pMIR /Gli1 /Mut, 2 ng prl-TK (Promega, Madison, WI, USA) obsahujúci Renilla luciferázy a 100 nM miRNA napodobňuje boli kotransfekovány s použitím Lipofectamine ™ 2000 činidlo a Opti-Memi znížená sérum médium. Relatívna aktivita luciferázy bola vypočítaná 48 hodín po transfekciu pomocou Dual-Glo Luciferase Assay (Promega, USA), podľa postupu výrobcu. Luciferázy svetlušiek aktivita bola normalizovala na Renilla luciferázové aktivity. Bunky a nádor sa lyžovalo za použitie M-per činidiel a Halt Protease Inhibitor Cocktail výstroje (Pierce, USA). Koncentrácia proteínov z bunkových lyzátov bola kvantifikovaná za použitia BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). Proteín boli oddelené na SDS polyakrylamidovom gélu a prenesené na 0,22 um polyvinylidendifluoridovou membránu (Millipore, MA, USA). Boli použité nasledujúce špecifické protilátky: Gli1 (1: 1000, Cell Signaling Technology), γ-katenin (1: 2000, BD Biosciences, USA), BCL-2 (1: 2000, EPITMICS, USA), a GAPDH (1: 20000, abca, UK). Úrovne proteínovej boli normalizované k GAPDH celkovej Konštrukcia expresného plazmidu a Gli1 transfekcia amplifikáciou cDNA z MKN-28 s použitím nasledujúcich primerov :. zmysle (5'-AGT ACA TGA TGG ATC GAT AT-3 ') a antisencie (5'-ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3'), full-length Gli1 bol získaný, stráviteľné ECOR v a Not i a klonovaný do pcDNA3.1 vektora (Invitrogen) a pomenovaný pcDNA3 0,1-Gli1. Sekvenovania DNA bola použitá na overenie konštrukcie. Bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek v deň pred transfekcia zabezpečiť, 80-90% zhlukovania buniek v okamihu transfekcia. V každej jamke, bunky boli transfekovány 250 pmol MIR-202-3p napodobenín alebo kontroly, spolu s 4 ug pcDNA3.1-Gli1 alebo pcDNA3.1 prázdnym vektorom, za použitia lipofektaminu 2000. WST test bol vykonávaný na 24 hodín po transfekciu, zatiaľ čo analýza apoptózy sa uskutočňuje pri teplote 48 hodín po transfekciu. Štatistická analýza Spojité premenné boli porovnané za použitia t Výsledky Expresia Mir-202-3p sa znižuje u GC a koreluje s patologickým parametre Prejavy mir-202-3p boli skúmané QRT-PCR v nádorových tkanivách a spárovaných nenádorových tkanív 150 GC pacientov (obr. 1a). Výsledky ukazujú, že expresia MIR-202-3p výrazne downregulated v nádorových tkanivách v porovnaní s spárovaných nenádorových tkanív v 68% (102/150) pacientov GC. (P 0,001, obr. 1A, B) Pre ďalšie objasnenie koreláciu medzi úrovňou expresie Mir-202-3p a patologickým faktorov v ľudských GC so 150 prípadmi boli ďalej analyzované (tabuľka 1). Na relatívnom MIR-202-3p prejavu báze uvádza 150 prípadov boli rozdelení do 3 skupín: Mir-202-3p nízka expresia (tumor /non-tumor pomer < 0,66, n = 85), mier-202-3p mierny výraz (nádor /pomer bez nádoru 0,66-1,5, n = 34) a mier-202-3p vysoká expresia (tumor /non-tumor pomer gt; 1,5, n = 31). Mir-202-3p expresné hladiny boli negatívne koreluje s veľkosťou nádoru a pozitívne korelované s vekom u týchto pacientov s Mir-202-3p nízka expresia skupiny vystavená podstatne väčšiu veľkosť nádoru (p = 0,013) a staršieho veku v porovnaní so strednou alebo vysoká expresia skupiny (p = 0,028). Avšak, mier-202-3p expresné hladiny nepreukázali žiadny vzťah k pohlavia, diferenciácie, umiestnenie nádoru, nádorové miestnej invázie, lymfatických uzlín alebo TNM štádiu. Vzhľadom na to, že mier-202-3p je významne znížená GC, môže fungovať ako nádorový supresor. Preto sme skúmali, či zvýšená expresia Mir-202-3p v GC buniek ovplyvnený rast buniek. MKN-28 a BGC-823 bunkové línie, ktorých expresia MIR-202-3p boli najnižšie v ôsmich testovaných GC bunkových línií (Obr. 1C), boli vybrané pre nasledujúce expreiments. Syntetické MIR-202-3p napodobňuje a negatívne kontrolné mimické molekuly (NC) boli transfekovány do MKN-28 a BGC-823 buniek, resp. Mimomaternicové expresie Mir-202-3p v bunkách bola potvrdená QRT-PCR. Test bunkového rastu WST ukázala výrazné bunkový rast zábrany v MKN-28 bunkách transfekciou MIR-202-3p (Obr. 2.A). Podobné výsledky boli pozorované v BGC-823 buniek (obr. 2.B). Pre ďalšie charakterizáciu účinku Mir-202-3p na rast buniek, sme vykonali mäkkom agare testu tvorby kolónií v transfekciou bunkách. Zistili sme, že počet kolónií z MKN-28 bunkách transfekciou MIR-202-3p napodobňuje bola takmer polovica z toho z ovládacieho prvku a rodičovskej skupiny (obr. 2C). Podobné výsledky boli pozorované v BGC-823 buniek (obr. 2.D). Tieto výsledky ukazujú, že mier-202-3p môže potlačiť proliferáciu buniek GC buniek in vitro Vzhľadom k tomu, inhibícia rastu môže v dôsledku zablokovaného progresie bunkového cyklu alebo zvýšené apoptóze, sme ďalšie vopred testu cyklu delenia buniek a apoptózu pomocou prietokovej cytometrie. Naše údaje naznačujú, že apoptotické miera oboch MKN-28 a BGC-823 buniek transfektovaných s Mir-202-3p napodobňuje boli významne up-regulované (obr. 3A, B). Avšak, neexistuje žiadny významný rozdiel v bunkovom cykle medzi rôzne liečených skupín (údaje nie sú zobraziť). Tieto výsledky ukazujú, že zvýšená expresia MIR-202-3p indukuje apoptózu v GC buniek môžu prispieva k inhibičné vlastnosti rastom MIR-202-3p. Vzhľadom na to, že mier-202-3p inhibuje rast GC buniek a indukuje apoptózu in vitro Ďalej boli robené testy tunel z nádorových tkanív. Ako je znázornené na Obr. 5E, RV-MIR-202-3p bunky vykazovali viac nádorových buniek pozitívne farbenie a výrazne vyššia proapoptotický index než RV-MIR-kontrolných buniek ( P Hotel &0,01). Tieto výsledky naznačujú, že mier-202-3p inhibícia nádorového bujnenia je pripočítaný zvýšenej apoptóze in vivo Ak chcete porozumieť mechanizmu základné vlastnosti nádorovo inhibičný mir-202-3p v GC, sme hľadali pre svoje domnelých cieľových génov s potenciálnymi pre-onkogénnych funkcií pomocou on-line nástroje pre vyhľadávanie (RNAhybrid a Miranda algoritmy), a gény predpovedá obe bioinformatických nástrojov boli vybrané ako kandidát cieľových génov MIR-202-3p. Medzi stovkami kandidátnych génov predvídať, transkripčný aktivátor Gli1 je zvlášť zaujímavé (obr S1). Predpokladaný Sekundárne štruktúra RNA hybridy na ľudskú Mir-202-3p a Gli1 je znázornené na obrázku S2. Gli1 bola hlásená veľmi vyjadrená v GC [32], [33]. Navrhla, že zníženie expresie Gli1 za následok GC inhibíciu rastu bunkové línie a apoptózy [33]. Ďalšie náznak o možnej úlohe Mir-202-3p v regulácii expresie Gli1 prišiel z analýzy osem rôznych žalúdočné rakovina bunkové línie (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, KATO III, BGC-823 a MKN-28). Štatistická analýza ukázala výrazný obráteného vzory expresie medzi Mir-202-3p a Gli1 ((r = -0,345, P Hotel < .. 0.001, Fig 5A) Aby bolo možné posúdiť klinický význam týchto zistení sme skúmali súvislosť medzi prejavmi Gli1 s Mir-202-3p expresie v GC tkanivách. Zistili sme, že Gli1 a mier-202-3p vykazujú inverzný expresný vzor GC tkanivách (tabuľka 2). Tieto výsledky podporujú predpoklad, že zníženie expresie MIR-202-3p zvyšuje hladinu Gli1 génu v rakovine žalúdka. luciferázy reportéri testy boli vykonávané za účelom overenia priamu interakciu medzi Mir-202-3p a 3 'UTR Gli1. Luciferase reportérov boli konštruované, obsahujúce buď divokého typu Gli1 3 'UTR sekvencie vrátane MIR-202-3p väzbového miesta (pMIR /Gli1), alebo mutovaný Gli1 3' UTR (pMIR /Gli1 /mut) (obr. 5B) Text. pMIR /Gli1 a pMIR /Gli1 /mut luciferázy reportéri konštrukty boli transfekovány do buniek HEK-293T, spolu s Mir-202-3p alebo NC napodobňuje. relatívna aktivita luciferázy z pMIR /Gli1 reportér sa výrazne potlačená v porovnaní so situáciou pMIR /Gli1 /mut v MIR-202-3p-závislým spôsobom (Obr. 5C). Tento výsledok silne naznačuje, že 3'UTR z Gli1 nesie priame väzobné miesta Mir-202-3p. Ak chcete zistiť, na úrovni mRNA alebo proteínové úrovni MIR-202-3p down-regulované Gli1 sme zistili Gli1 výraz podľa QRT-PCR a Western blot. Ako je znázornené na Obr. 5E, hladina Gli1 proteín bol znížený v Mir-202-3p napodobňuje transfekciou MKN-28 buniek v porovnaní s NC napodobňuje-transfekovány a rodičovskej MKN-28 bunkách. Medzitým, tam nebol žiadny účinok Mir-202-3p na úrovni Gli1 mRNA (Obr. 5D). Tieto výsledky silne naznačujú, že mier-202-3p negatívne reguluje Gli1 expresie na úrovni translácie. Medzi gény pozorovaných inhibovať apoptózu GC, γ-katenin (Plakoglobin) a BCL-2 sú priame transkripčný ciele z Gli1 [34], [35]. Ako je znázornené na Obr. 5E, hladiny proteínu v y-kateninu a BCL-2 boli významne znížené v MKN-28 bunkách transfekciou s Mir-202-3p napodobňuje. Ďalej sme skúmali expresiu proteínu Gli1 v podkožných nádorov odvodených z RV-MIR-kontroly a RV-MIR-202-3p u nahých myší analýzou western blot. Hladina Gli1 proteín u nádorov od RV-MIR-202-3p preukázané, down-reguláciu v porovnaní s údajmi v RV-MIR-kontroly (obr. 5F). Tieto výsledky silne naznačujú, že mier-202-3p negatívne reguluje Gli1 výraz post-transkripčné. Vzhľadom k tomu, Mir-202-3p downregulated Gli1 inhibovať bunkovú proliferáciu a indukovať apoptózu, je odôvodnené, že nadmerná expresia Gli1 by mohla zvrátiť tento jav aspoň čiastočne. V skutočnosti, keď Gli1 nadmernou expresiou plazmidu (pcDNA3.1-Gli1) bol zavedený do MKN-28 alebo BGC-823 bunkách prechodne transfekciou s Mir-202-3p napodobňuje, inhibičný efekt Mir-202-3p na bunkový rast bol čiastočne obrátený, ktorý bol pozorovaný rast buniek WST (obr. 6A, B). Okrem toho, progresie k apoptózy bolo tiež bránené, keď sa Gli1 zvýšene exprimovaný v MKN-28 alebo BGC-823 bunkách prechodne transfekciou s Mir-202-3p napodobňuje (obr. 6C, D) .Tieto údaje poskytujú dôkaz, že inhibícia rastu a apoptózu indukovanú mier-202-3p je aspoň čiastočne súvisí s jeho účinku na expresiu Gli1. Diskusia Kumulatívne dôkazy ukázali, porucha regulácie špecifickej miRNA v GC [4], [13], [36 ]. Mir-202-3p, ktorý sa nachádza v 10q26, bol hlásený byť disregulated pri karcinóme prsníka [23], [24], kolorektálny karcinóm [26] a folikulárna lymfóm [27]. Petrocca et al. zistené, že mier-202 sa down-regulované v chronickej gastritídy [28]. Avšak role MIR-202-3p vo vývoji GC a progresie je stále Neznámeho. V tejto štúdii sme zistili, že mier-202-3p expresie 68% vzoriek karcinómu žalúdka bola významne nižšia ako u spárovaných normálnych tkanív, čo naznačuje, že znížená expresia MIR-202-3p je častým udalosť v GC. Dôležité je, že hladiny MIR-202-3p je v negatívnej korelácii s veľkosťou nádoru GC u pacientov. Tieto výsledky naznačujú, inhibičný úlohu Mir-202-3p v rozvoji a progresii GC. Vzhľadom k tomu, Mir-202 sa down-regulované v žalúdočných rakovinové tkanive sme špekuluje, že nadmerná expresia MIR-202 môže potlačiť malígne fenotypy buniek karcinómu žalúdka. V tejto štúdii sme sa ukázať, že obnova Mir-202-3p v MKN-28 a BGC-823 buniek, výrazne inhibuje bunkovú proliferáciu a indukuje apoptózu aj in vitro stroje a in vivo miRNA môže regulovať génovú expresiu down-regulované preklad cieľovej mRNA, alebo up-regulované degradáciu cieľovej mRNA [3], [37]. Na bioinformatických algoritmov, identifikujeme Gli1 ako možný priamy cieľového génu MIR-202-3p. Gli1, člen rodiny Gli, bol pôvodne identifikovaný ako amplifikovaného génu v malígnym gliómom [38]. Ide o silne pozitívny aktivátor nadväzujúcich cieľových génov a je sama o sebe transkripčný cieľ Psst signalizácie [39], a to môže byť tiež stimulovaná RAS /PKC [40], TGF [41] a PI3K signalizácie [42], a downregulated od PKA [42] a p53 signalizáciou [43]. Gli1 expresie v epitelové bunky môžu indukovať bunkovú transformáciu charakterizované zvýšenou proliferácie a ukotvenie nezávislý proliferáciu [35], [44]. Rastúci počet štúdií ukazuje, že Gli1 je nadmerne exprimovaný v rôznych druhov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka [32], [33], [45], a na expresné hladiny Gli1 sú v pozitívnej korelácii s diferenciáciou tumoru [33]. Zníženie expresie Gli1 od cyklopaminu alebo siRNA viedla k GC inhibíciu bunkového rastu a apoptózy [33]. Ďalej overiť Gli1 ako priamy cieľ MIR-202-3p, sme zistili, že mier-202-3p ohraničujúce neúplné komplementarity k Gli1 3 'UTR, a nadmerná expresia Mir-202-3p down-reguluje Gli1 na úrovni proteínu. Okrem toho, štatistická analýza ukázala významné invertovaný vzory expresie medzi Mir-202-3p a Gli1 v GC tkanivách a bunkových líniách. γ-katenin (Plakoglobin) a BCL-2, priame transkripčný ciele Gli1, sa uvádza, že inhibujú apoptózu GC. Expresia Gli1 downstream cieľových génov y-cateninu (Plakoglobin) a [35] BCL-2 [34], sa výrazne zníži, keď sa Mir-202-3p nadmerne vystavený u GC buniek. To naznačuje, že inhibícia rastu GC buniek indukovaných MIR-202-3p môže byť čiastočne súvisí s jeho potlačenie na y-kateninu a BCL-2 expresie, ktoré boli následne prostredníctvom priamej interakcie s Gli1. Dôležité je, že nadmerná expresia Gli1 zachráni bunkovú inhibíciu rastu a apoptózu buniek indukovanú MIR-202-3p, ďalej demonštruje, že Gli1 je priamym cieľom Mir-202-3p a naznačuje základnú úlohu pre Gli1 ako mediátor biologických účinkov Mir-202-3p v GC. v súhrne možno konštatovať, MIR-202-3p je v ľudskej rakoviny žalúdka často znížená. Obnova MIR-202-3p inhibuje proliferáciu GC aspoň čiastočne cez vyvolávajúce apoptózu priamou interakciou s Gli1 (obr. 7). Taká role Mir-202-3p v GC navrhnúť svoj potenciál ako terapeutický mikroRNA pre liečbu rakoviny žalúdka, ktorá stojí za ďalší výskum.
. Okrem toho, Gli1 expresia bola často pozitívna u karcinómu žalúdka tkanivách a negatívne koreluje s Mir-133b expresie. Ukážeme, že transkripčný faktor Gli1 bol terčom Mir-202-3p a hrá zásadnú úlohu ako mediátor biologických účinkov Mir-202-3p v karcinómu žalúdka. MIR-202-3p tiež inhibuje expresiu y-kateninu a Bcl-2. Dohromady tieto nálezy naznačujú, že mier-202-3p môže fungovať ako nový nádorový supresor v žalúdku rakoviny a jej protinádorovú aktivitu môže pripisovať priame zacielenie a inhibícia Gli1
priamo cielia na transkripčný faktor Gli1 a inhibíciu expresie cieľových génov Gli1 γ-cateninu a BCL-2.
Tkanivá pacientov
Izolácia RNA a kvantitatívnej PCR v reálnom čase (QRT-PCR)
Cell Test proliferácie
v priebehu 24 hodín po transfekciu s miRNA napodobenín, bunky (2 x 10 3 buniek
Soft Agar Colony Formation Test
Apoptóza Analýza
retrovirusove transfekcia pre stabilné bunkové línie
rast nádoru u holých myší
TUNEL analýza
Imunohistochémia
Konštrukcia plazmidov a Luciferase Assay aktivity
Analýza Western Blot
testu Studentov pre normálne distribuované premenné a Wilcoxonův test rank suma na nonnormally distribuované premenné. Vzťah medzi MIR-202-3p úrovne expresie a patologickým parametre boli analyzované pomocou Pearson Chi-kvadrát testu. Všetky hodnoty sú prezentované ako priemery ± SDS. Všetky štatistické analýzy boli vykonané za použitia softvéru IBM SPSS Statistics 18.0 (IBM, USA). Dvoj-sledoval hodnota P
. ≪ 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú
Zvýšená expresia MIR-202-3p Zabraňuje GC Cell proliferation
.
Zvýšená expresia MIR-202-3p indukuje GC buniek apoptózu
Zvýšená expresia MIR-202-3p Inhibuje tumorigeničnosti a zvyšuje apoptózu in vivo
Ďalej sme skúmali, či MIR-202-3p mohol potlačiť rast nádoru a vyvolávajú apoptóza in vivo
. Bunky MKN-28, RV-MIR-202-3p (MKN-28 bunky retrovírusom sprostredkovanej MIR-202-3p stabilné expresie) alebo RV-MIR-kontroly (MKN-28 buniek s prázdnym vektorom), boli získané, ako je popísané v Materiál a metódy. Bunky boli injikované subkutánne do holých myší. Tvorba nádoru bola monitorovaná. Doba latencie nádor vykázal významný rozdiel medzi myšou injektovaných RV-MIR-NC buniek a RV-MIR-202-3p buniek (obr. 4a). To má značný význam, že nádory odvodené od RV-MIR-202-3p bunky rástli podstatne pomalšie ako RV-MIR-kontrolnej skupiny po celej rastu nádoru (Obr. 4B). Priemerná hmotnosť nádoru vyplývajúcich z RV-MIR-202-3p bola výrazne nižšia, než sú nádory odvodené od RV-MIR-kontroly (Obr. 4C, D).
.
MIR-202-3p zacieliť priamo na Gli1
Nadprodukcie Gli1 zachráni Vplyv Mir-202-3p v GC buniek
. Tieto výsledky jasne ukázali, že znížená expresia Mir-202-3p v GC by mala byť faktorom, ktorý prispieva k rozvoju skôr než aby bola ovplyvnená v dôsledku GC. Preto je významná inhibícia tumorov prenesených u nahých myší naznačujú, že terapeutické stratégie zavedenia MIR-202-3p do nádorových buniek by mohli byť užitočné pre spomalenie procesu vzniku nádorov.
podporné informácie
Obrázok S1.
Črevný bakteriálny profil môže predpovedať poškodenie čreva po rádioterapii
Rastové problémy u predčasne narodených detí spojené so zmenenými črevnými baktériami
Káva pomáha vyvíjať zdravé črevné mikróby a napomáha pohybom čriev
Transplantácia vaginálnej tekutiny by mohla pomôcť pri liečbe opakujúcej sa bakteriálnej vaginózy
Probiotiká môžu ponúkať terapeutické výhody pre biopolárnych pacientov
Otvorenie úzkeho pažeráka
Je sekcia C dobrá pre zdravie detí?
Nedávna štúdia publikovaná Inštitútom ekonomického výskumu VATT naznačuje, že neplánovaný CS bol vykonaný na základe indikácie, ktorej by sa možno dalo vyhnúť, má vzťah k príčine a následku s astmou i
Novoobjavené veľké fágy stierajú hranicu života/neživota
Nová štúdia publikovaná v časopise Príroda ukazuje, že existujú doslova stovky vírusov, ktoré sú dostatočne veľké na to, aby pohltili baktérie, a s vlastnosťami, ktoré sú typické skôr pre živý organ
Infekcia SARS-CoV-2 predlžuje vylučovanie vírusu a stratu lymfocytov u pacientov s rakovinou
Pacienti s rakovinou majú náročnejšie obdobie s infekciami počas liečby-ich zaradenie do kategórie vysokého rizika pre závažné ochorenie COVID-19 a smrť. Avšak, spôsob, akým závažný akútny respiračný