PLOS ONE: Diminuição de Expressão miR-202-3p, um supressor tumoral Novel, em Câncer Gástrico

Sumário

estudos emergentes indicaram que microRNAs estão envolvidos no desenvolvimento e progressão do câncer. Aqui descobrimos que miR-202-3p foi frequentemente regulada para baixo em tecidos com câncer gástrico. Superexpressão de miR-202-3p em células gástricas cancerosas MKN-28 e BGC-823, a proliferação de células marcadamente suprimida e apoptose celular induzida ambos in vitro
e in vivo
. Além disso, a expressão Gli1 era frequentemente positiva em tecidos de câncer gástrico e inversamente correlacionada com a expressão de miR-133b. Nós demonstramos que o factor de transcrição Gli1 era um alvo de miR-202-3p e desempenha um papel crucial como mediador dos efeitos biológicos de miR-202-3p em cancro gástrico. MiR-202-3p também inibiu a expressão de γ-catenina e Bcl-2. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que miR-202-3p pode funcionar como um romance supressor de tumor no câncer gástrico e a sua actividade anti-tumoral pode atribuir a segmentação direta e inibição da Gli1

Citation:. Zhao Y, Li C, Wang H, Su L, Qu Y, Li J., et al. (2013) Redução de expressão de miR-202-3p, um supressor tumoral Novel, no câncer gástrico. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10.1371 /journal.pone.0069756

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 28 de fevereiro, 2013; Aceito: 11 de junho de 2013; Publicação: 25 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Natural Science Foundation da China (Nos. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 e 81272749), Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (Nos. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 e 12PJ1406300), Principais Projetos no Programa Pillar Nacional de Ciência e Tecnologia da China (No. 2011BA203191), Fundo de Investigação para o Programa de Doutorado de Educação Superior da China (No. 20110073110071), Projeto chave da Comissão de Educação Xangai (nos. 12ZZ102, 12ZZ105) e Fundação para a Inovação doutorados de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é uma das neoplasias mais comuns e as segundas causas mais comuns de morte relacionada com câncer em todo o mundo [1]. Apesar dos avanços no tratamento, a taxa de sobrevivência de pacientes com GC é decepcionante, isso se deve principalmente à escassez de alvos terapêuticos específicos. Portanto, é crucial identificar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento de câncer gástrico.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos (18-25 nucleotídeos), não-codificante, RNAs endógenos de cadeia simples. Eles suprimir a expressão de proteínas por interacção com as sequências complementares perfeita ou imperfeita localizados nas regiões 3'untranslated (3'UTRs) de genes alvo. Estudos ao longo dos últimos anos têm demonstrado que miARNs desreguladas desempenham papéis importantes em vários cancros [1] - [4], incluindo GC [5] - [13]. Os dados do estudo sobre miRNAs e seus genes alvo pode proporcionar excitantes oportunidades terapêuticas [3].

Temos recentemente identificados vários miRNAs desregulados em GC, como a regulação baixa de miR-126 [14], miR-409-3p [15], o miR-625 [16], e a regulação positiva de miR-21 [17], o miR-301A [18]. Embora muitos miARNs foram identificados associando com GC, o mecanismo destes miARNs na tumorigénese gástrica ainda a ser investigada. No nosso trabalho anterior, numerosos miARNs putativos que mostraram expressão diferencial entre os tecidos GC e os seus tecidos não tumorais adjacentes a partir de 28 doentes foram identificados [19]. Entre eles, o miR-202-3p foi um dos mais miARNs significativamente diminuída. No entanto, o papel do miR-202-3p em GC raramente é investigada.

MIR-202-3p, anterior chamado HSA-miR-202, localizado dentro de um sítio frágil cromossômico em 10q26. A deleção do sítio frágil tem sido associada com endométrio [20], tumores cerebrais [21], [22]. MiR-202 tem sido relatado para ser desregulado no cancro da mama [23], [24], de células escamosas do colo do útero [25], cancro colorrectal [26] e linfoma folicular [27]. Petrocca et ai. encontrado que o miR-202 foi regulada para baixo em gastrite crónica [28]. MiR-202 foi mostrada para ser sub-regulada por 4-hydroxynoneal (HNE) em células HL-60 de leucemia [29]. Um estudo recente mostrou também que o miR-202 tem como alvo directamente MYCN proto-oncogene, resultando na inibição da proliferação de células de neuroblastoma [30].

Aqui, demonstramos uma redução geral do nível de expressão de miR-202-3p em 150 GC tecidos em comparação com os tecidos não tumorais e descobrimos que os níveis de miR-202-3p estão associados com o tamanho do tumor e a idade do paciente. Além disso, descobrimos, pela primeira vez, que o miR-202-3p poderia inibir o crescimento e induzir a apoptose de células GC tanto in vitro
e in vivo
, visando diretamente o fator de transcrição Gli1 e expressão da inibição de genes alvo GLI1 γ-catenina e BCL-2.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

O consentimento informado foi obtido de todos os participantes. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Ruijin Hospital, Faculdade de Medicina da Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), a Comissão de Animais de Laboratório Ética de Ruijin Hospital (GCEA 11-062). procedimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) em Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China.

Cultura celular

linhas celulares GC Humano SGC -7901 e BGC-823 foram comprados de Xangai Institutos de Ciências Biológicas, da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). linhas celulares MKN-45 e MKN-28 foram obtidos a partir da Japanese Cancer Research Resources Bank (Tóquio, Japão). NCI-N87, AGS, KATO III e SNU-1 linhas celulares foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). linha embrionárias humanas de células de rim 293T (HEK-293T) foi preservada em nosso instituto. As células foram armazenadas, recuperado a partir de criopreservação em azoto líquido e usada nas primeiras passagens. Todas as células foram mantidas em meio RPMI-1640 mais 10% de soro fetal de bovino (FBS) e cultivadas em 5% de CO2 atmosfera humidificada. Exponencialmente células em crescimento foram utilizados para experimentos.

tecidos de pacientes

tecidos GC primários e tecidos não tumorais combinados foram obtidas de 150 pacientes submetidos a gastrectomia GC radical no Departamento de Cirurgia, Ruijin Hospital, Escola de Medicina da Shanghai Jiao Tong University. As amostras foram snap-congelados imediatamente após a cirurgia. Todas as amostras foram confirmadas por exame patológico independente. Nenhum dos doentes recebeu tratamento pré-operatório. Para todos os pacientes, informações clínico-patológico estava disponível. classificação de tumores de acordo com a International Union Against Câncer (2009).

Isolamento de ARN e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído a partir de linhas celulares e amostras de tecido, utilizando Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações e pureza das amostras de ARN foram medidos por electroforese e métodos espectrofotométricos. Os níveis de miR-202-3p e U6 ARN nuclear pequeno (RNU6B) de expressão foram testadas em triplicado pelo método de haste-laçada de RT-PCR utilizando o Hairpin-IT ™ miARNs qPCR Quantificação Kit (GenePharma, Xangai, China) com iniciadores específicos formiR-202-3p e U6 RNA nuclear pequeno (RNU6B). miARN expressão relativa de miR-202-3p foi normalizado contra o controlo endógeno, U6, usando o método DDCT. Os níveis de ARNm de Gli1 e GAPDH foram medidos em triplicado usando o SYBR Green PCR em tempo real (Applied Biosystems, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A quantificação foi feita usando o método de quantificação relativa DDCT com GAPDH humano como um controlo interno. Foram utilizados os seguintes iniciadores: Gli1 (sentido: 5'-GGA AGT CAT GCC ACT CAC TCG A-3 '; anti-sentido: 5'-TGA TGC CAT AGG CTT TAC TGC A-3') [31], e GAPDH (sentido: 5'-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3 '; antisense: 5'-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3'.)

Transient transfecção de miRNA Mimics

MiR- 202-3p imita (oligonucleotídeos dsRNA) e mimics1 de controlo negativo (NC) (sentido: 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ', antisense: 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3') foram comprados de GenePharma (Xangai, China). As células foram semeadas em placas de 6 poços um dia antes da transfecção para assegurar a confluência celular de 40% no momento da transfecção. A transfecção de imita miARN em células foi realizada com Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o procedimento do fabricante. Os imitadores de miARN foram utilizados a uma concentração final de 100 nM.

Ensaio de Proliferação Celular

às 24 h pós-transfecção imita com miARN, as células (2 x 10 ^{3 células /poço ) foram semeadas em placas de 96 poços e incubou-se durante 72 horas. A proliferação celular foi avaliada em triplicado por sal de tetrazólio solúvel em água de ensaio (WST) utilizando o Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) e medido seguindo as instruções do fabricante.}

Formação agar mole Colony Ensaio

imita miARN células transf ectadas foram ressuspensas com 0,3% de agarose mole (A9045, de baixa temperatura de gelificação, Sigma-Aldrich, EUA) em meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% e em camadas sobre 0,4% solidificado de agar em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS em placas de 6 poços (1 × 10 ^{3 células /cavidade) às 24 h pós-transfecção. As placas foram incubadas durante 2 semanas. As colónias que contêm pelo menos 50 células foram contadas.}

Análise de Apoptose

Um dia antes da transfecção com imita miARN, 1 × 10 ^{6 as células foram semeadas em placas de 6 poços. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram colhidas e coradas com AnnexinV /PI kit de dupla marcação (BD Biosciences, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células apoptóticas foram avaliadas em triplicado e repetidas três vezes, independentemente, por citometria de fluxo num FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, EUA).}

A transfecção retroviral para linhas celulares estáveis ​​

região genómica que incluiu o transcrito primário de miR-202-3p foi clonado no sítio EcoRI-XhoI do vector retroviral pMSCV-GW-RFA-PGK-EGFP modificado. Os vectores de controlo negativo teve nenhuma inserção. células HEK 293T (1 × 10 ^{6 /po) foram semeadas em placas de 6 poços um dia antes da transfecção. Dez ug de construção retroviral contendo quer o miR-202-3p ou sem inserto, 2 ug de gag /pol e 2 ug de VSVG foram co-transfectadas em células HEK 293T usando Lipofectamine ™ 2000 e reagente de Opti-MEM I meio de soro reduzido em cada prato. Os vírus foram colhidos às 48 h e 72 h pós-transfecção por meio de recolha viral (meio RPMI-1640 com 10% de FBS inactivado por calor a 1% + glutamina Hepes 20 mM). Infecções de células MKN-28 foram levadas a cabo na presença de 8 ug /mL de polibreno em cada poço de uma placa de 6 poços. As células foram infectadas de centrifugação a 1500 rpm durante 30 min a temperatura ambiente. sobrenadante contendo o vírus foi removido após 2 h. As células positivas foram seleccionadas para a expressão GFP por FACS-ordenação e nomeado RV-miR-202-3p e RV-miR-controle, respectivamente. expressão de miR-202-3p foi confirmada por qRT-PCR.}

crescimento de tumores em ratos pelados

Homem BALB /c nu camundongos /nu, em idade de seis semanas (Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências), foram alojados em um ambiente específico isento de agentes patogénicos na Unidade de Laboratório animal, Faculdade de Medicina da Shanghai Jiao Tong University, na China. Os ratos receberam cuidados e os protocolos de estudo foram realizadas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) em Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China. As células (100 ml, 2 × 10 ^{6 células) das linhas transfectadas estáveis ​​RV-miR-202-3p ou RV-miR-controle foram coletadas e inoculadas por via subcutânea em ratos. Seis ratos foram usados ​​para cada grupo. Os ratos foram testados semanalmente, e nódulos tumorais foram medidos com um paquímetro. O volume do tumor (V) foi estimada por meio da equação V = 4 /3π × G /2 × (W /2) 2, onde L é o comprimento do meio-eixo, e W é o meio-eixo width.The As células de tumor foram deixadas a 5-semanas de crescimento e curvas de crescimento do tumor e as taxas de inibição foram calculados. Depois os ratinhos foram sacrificados, todos os enxertos de tumores foram excisados, pesados, colhidas, fixas, e incorporado. Cada experimento foi realizado duas vezes.}

Análise TUNEL

O ensaio de rotulagem terminal de nucleótidos mediada-transferase final nick (TUNEL) foi realizada seguindo as instruções do fabricante do kit deadend ™ colorimétrico TUNEL sistema (Promega, EUA). Os tecidos foram fixados em formalina a 10% neutralizado e embebidos em blocos de parafina. Secções (4 uM) foram então preparadas para exame. Após desparafinização, as secções foram tratadas com 20 g /ml de proteinase K, durante 10 min, com 0,3% H _{2O 2 em metanol durante 10 min e 0,1% de Triton X-100 de citrato de sódio em 0,1% durante 2 min no gelo. Em seguida, as secções foram incubadas com a mistura reaccional de TÚNEL durante 60 min a 37 ° C. Além disso incubação com anticorpo conjugado com peroxidase foi realizada durante 30 min a 37 ° C. As secções foram coradas com uma solução de diaminobenzidina durante 10 min à temperatura ambiente e depois contra-coradas com hematoxilina.}

A imuno-histoquímica

secções (6 mm de espessura) de, tumores embebidos em parafina e fixado em formalina specimenswere desparafinizadas em xileno e re-hidratadas em álcool graduado. A peroxidase endógena foi bloqueada utilizando 3% H _{2O 2 durante 10 min. Após recuperação de antigénio em tampão de citrato (pH 6,0), as secções de tecido foram incubadas com soro de cabra normal para bloquear a ligação não específica de anticorpo (20 minutos à temperatura ambiente). As secções foram então incubadas com anticorpos (1:50 GLI1, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) a 37 ° C em humidchambers durante 2 h. Após lavagem três vezes com PBS, as secções foram incubadas com anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram enxaguadas com PBS e incubadas durante 5 minutos com substrato DAB para menos de 30 min. Hematoxilina foi usado para contracoloração.}

Construção de plasmídeos e luciferase Ensaio de Actividade

A comprimento total de 203 pb do tipo selvagem (WT) Gli1-3'UTR ou mutante Gli1-3 ' UTR (mut) contendo o sítio de ligação putativo do miR-202-3p foi sintetizado (Sangon, Xangai, China). Após a digestão por Spel e Hindi II, os fragmentos de tipo selvagem e mutante foram Gli1-3'UTR clonado nos locais SpeI e HindIII de PMIR-Reportar vector de luciferase (Applied Biosystems) e com o nome PMIR /Gli1 e PMIR /Gli1 /mut, respectivamente. A sequenciação de ADN foi utilizado para verificar as construções.

células HEK-293T foram semeadas em placas de 24 poços 24 h antes do desempenho do ensaio. Em cada poço, 100 ng PMIR /Gli1 ou PMIR /Gli1 /mut, 2 ng contendo luciferase de Renilla pRL-TK (Promega, Madison, WI, EUA) e 100 imita nM miARN foram co-transfectadas utilizando Lipofectamine ™ reagente de 2000 e Opti-memi reduzida meio de soro. a actividade de luciferase relativa foi calculada após 48 h de co-transf ecção usando o ensaio de luciferase Dual-Glo (Promega, EUA) de acordo com o procedimento do fabricante. atividade luciferase Firefly foi normalizada para a actividade da luciferase Renilla.

Western Blot Analysis

As células e tumor foram lisadas utilizando reagentes M-PER e Halt Inibidor de Protease kits de cocktail (Pierce, EUA). A concentração de proteínas dos lisados ​​celulares foi quantificado utilizando um Kit BCA Protein Assay (Pierce, EUA). A proteína foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida SDS e transferidas para membranas de 0,22 mícrons de difluoreto de polivinilideno (Millipore, MA, EUA). Foram utilizados os seguintes anticorpos específicos: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-catenina (1:2000, BD Biosciences, EUA), a BCL-2 (1:2000, EPITMICS, EUA), e GAPDH (1: 20000, Abcam, Reino Unido). Os níveis de proteína foram normalizados para GAPDH total de

Construção de Gli1 Expressão plasmídeo e transfecção

Ao amplificar cDNA de MKN-28 utilizando os seguintes iniciadores:. sentido (5'-AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 ') e anti-sentido (5'-ATG CGG CCG CTT CAC AGG TA-3'), de comprimento total foi obtido Gli1, digerido por EcoR V e Not I e clonado no vector pcDNA3.1 (Invitrogen) e denominado pcDNA3 .1-Gli1. A sequenciação de ADN foi utilizado para verificar as construções.

As células foram semeadas em placas de 6 poços um dia antes da transfecção de células para garantir confluência de 80-90% no momento da transfecção. Em cada poço, as células foram transfectadas com 250 pmol de imita o miR-202-3p ou de controlo, juntamente com 4 ug de pcDNA3.1-Gli1 ou o vector vazio pcDNA3.1, utilizando Lipofectamine 2000. ensaio WST foi realizada a 24 h pós-transfecção, enquanto a análise da apoptose foi realizada às 48 h pós-transfecção.

análise estatística

as variáveis ​​contínuas foram comparadas usando t
teste de Student para variáveis ​​de distribuição normal e teste de soma de postos de Wilcoxon para variáveis ​​nonnormally distribuídos. A relação entre os níveis de expressão de miR-202-3p e parâmetros clínico-patológicas foi analisada utilizando o teste de Pearson Chi-quadrado. Todos os valores são apresentados como médias ± SDs. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o PASW Statistics 18.0 software (IBM, EUA). Um valor de duas caudas de P
. ≪ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A expressão de miR-202-3p é diminuído em GC e se correlaciona com Correlação parâmetros

Expressões de miR-202-3p foram examinadas por qRT-PCR em tecidos tumorais e os tecidos não tumorais correspondentes em 150 pacientes GC (Fig. 1A). Os resultados mostram que a expressão de miR-202-3p foi significativamente regulada negativamente nos tecidos tumorais em comparação com tecidos emparelhados não tumorais em 68% (102/150) dos pacientes GC. (P < 0,001; Fig. 1A, B)

Para elucidar ainda mais a correlação entre o nível de fatores de miR-202-3p e clínico-patológicas em GC humana expressão, os 150 casos foram analisados ​​ainda mais (Tabela 1). Com base na expressão de miR-202-3p relativa, os 150 casos foram estratificados em 3 grupos: miR-202-3p baixa expressão (tumor relação A /não-tumor < 0,66, n = 85), expressão moderada miR-202-3p (tumoral /rácio 0,66-1,5 não tumoral, n = 34) e a alta expressão de miR-202-3p (rácio tumor /não tumor > 1,5, N = 31). Os níveis de expressão de miR-202-3p foram negativamente correlacionados com o tamanho do tumor e positivamente correlacionada com a idade nesses pacientes, com o grupo de baixa expressão de miR-202-3p exibiu o tamanho do tumor significativamente maior (p = 0,013) e idade mais velha comparação com moderada ou grupos de expressão elevadas (p = 0,028). No entanto, os níveis de expressão de miR-202-3p não mostrou qualquer relação com o sexo, a diferenciação, localização do tumor, invasão tumoral local, metástases em linfonodos ou estágio TNM.

A superexpressão de miR-202-3p Inibe GC Proliferação Celular

Dado que o miR-202-3p é significativamente diminuída em GC, pode funcionar como um supressor do tumor. Por isso, nós examinamos se a sobre-expressão de miR-202-3p GC em células afectadas crescimento celular. linhas MKN-28 BGC-823 e celulares, cuja expressão de miR-202-3p eram os mais baixos em oito linhas celulares testadas de GC (Fig. 1C), foram escolhidos para as expreiments subsequentes. imita miR-202-3p sintéticos e de controle negativo moléculas imitar (NC) foram transfectados em células MKN-28 e BGC-823, respectivamente. A expressão ectópica de miR-202-3p em células foi confirmada por qRT-PCR.

O ensaio de crescimento celular WST mostraram inibição de crescimento celular significativa em MKN-28 as células transfectadas com o miR-202-3p (Fig. 2.A). Resultados semelhantes foram observados em células BGC-823 (Fig. 2.B). Para caracterizar ainda mais o efeito de miR-202-3p no crescimento celular, foi realizado ensaio de formação de colónia em agar mole As células transfectadas. Verificou-se que o número de colónias a partir de células MKN-28 transfectadas com os imitadores de miR-202-3p era quase metade daquela do grupo de controlo e parental (Fig. 2C). Resultados semelhantes foram observados em células BGC-823 (Fig. 2.D). Estes resultados demonstram que miR-202-3p pode suprimir a proliferação celular de células GC in vitro
.

A superexpressão de miR-202-3p células GC induz a apoptose

Desde a inibição do crescimento pode devido à progressão do ciclo celular ou apoptose aumentada bloqueada, o próximo ensaio pré-formado ciclo de divisão celular e a apoptose por citometria de fluxo. Os nossos dados indicam que as taxas de apoptose de ambas as células MKN-28 e BGC-823 transfectadas com imita o miR-202-3p foram significativamente sobre-regulada (Fig. 3A, B). No entanto, não houve diferença significativa no ciclo celular diferente entre os grupos tratados (dados não mostram). Estes resultados indicaram que a sobre-expressão de miR-202-3p induz a apoptose em células de GC pode contribui para as propriedades inibidoras de crescimento de miR-202-3p.

A sobre-expressão de miR-202-3p Inibe a tumorigenicidade e aumenta a apoptose in vivo

Dado que miR-202-3p inibe o crescimento de células de GC e induz a apoptose in vitro
, nós próxima examinou se miR-202-3p podem suprimir o crescimento do tumor e induzir apoptose in vivo
. Células de MKN-28, RV-miR-202-3p (MKN-28 células com uma expressão estável de miR-202-3p mediada por retrovírus) ou RV-miR-(controlo MKN-28 células com o vector vazio) foram obtidos como descrito em material e Métodos. As células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. a formação de tumores foi monitorizado. O tempo de latência do tumor mostrou uma diferença significativa entre os camundongos injetados com células RV-miR-NC e células RV-miR-202-3p (Fig. 4a). É de considerável interesse que os tumores derivados das células de RV-miR-202-3p cresceu substancialmente mais lentamente do que o grupo de controlo-miR-RV todo o crescimento do tumor (Fig. 4B). O peso médio dos tumores resultantes da RV-miR-202-3p foi significativamente menos do que os tumores derivados de RV-miR-controle (Fig. 4C, D).

Além disso, os ensaios de TUNEL de tecidos tumorais foram realizadas. Como mostrado na Fig. 5E, as células RV-miR-202-3p mostrou uma coloração positiva de células de tumor mais e um índice apoptótico significativamente mais elevada do que as células-miR-controlo RV ( P
< 0,01). Estes resultados sugerem que a inibição de miR-202-3p de tumorigenicidade é atribuída ao aumento da apoptose in vivo
.

Mir-202-3p Diretamente alvo Gli1

Para entender o mecanismo subjacente às propriedades de inibição de tumor de miR-202-3p no GC, temos procurado por seus genes-alvo putativos com potenciais funções pró-oncogênicos usando on-line ferramentas de pesquisa (algoritmos RNAhybrid e Miranda), e os genes previstos por ambas as ferramentas de bioinformática foram escolhido como os genes alvo candidato de miR-202-3p. Entre as centenas de genes candidatos previsto, o activador de transcrição Gli1 é de particular interesse (Figura S1). A estrutura secundária putativa de híbrido ARN de miR-202-3p humana e Gli1 é mostrado na Figura S2. Gli1 foi avaliado altamente expressa em GC [32], [33]. É sugerido que a expressão decrescente de Gli1 resultou na inibição do crescimento de células de linhas de GC e a apoptose [33].

Uma outra sugestão sobre o papel potencial de miR-202-3p na regulação da expressão Gli1 veio a partir da análise de oito linhas celulares de cancro gástrico diferentes (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, Kato III, BGC-823 e MKN-28). A análise estatística mostrou uma expressão padrões invertida significativa entre miR-202-3p e Gli1 ((r = -0,345, P Art <.. 0.001, Fig 5A)

Para avaliar a relevância clínica destes resultados, examinamos a correlação entre as expressões de Gli1 com expressão de miR-202-3p em tecidos GC. Descobrimos que Gli1 e miR-202-3p exposição inversa padrão de expressão em tecidos GC (Tabela 2). estes resultados suportam a premissa de que a regulação baixa de miR-202-3p aumenta o nível de gene Gli1 no câncer gástrico.

ensaios de repórter de luciferase foram realizados para verificar a interação direta entre miR-202-3p e 3'UTR de Gli1. luciferase repórteres foram construídos contendo uma sequência de tipo selvagem Gli1 3'UTR incluindo o sítio de ligação de miR-202-3p (PMIR /Gli1), ou um mutante Gli1 3'UTR (PMIR /Gli1 /mut) (Fig. 5B). o PMIR /Gli1 e PMIR /Gli1 /luciferase mut construções repórter foram transfectadas em células HEK-293T, juntamente com imita miR-202-3p ou NC. a actividade de luciferase relativa do repórter PMIR /Gli1 foi marcadamente suprimida em comparação com a de PMIR /Gli1 /mut de uma forma de miR-202-3p-dependente (Fig. 5C). Este resultado indica fortemente que 3'UTR de Gli1 transporta os sítios de ligação directa de miR-202-3p.

Para determinar a nível mRNA ou nível de proteína miR-202-3p regulada Gli1, detectamos expressão Gli1 por qRT-PCR e transferência de Western. Como mostrado na Fig. 5E, o nível de proteína Gli1 foi diminuída em miR-202-3p MKN-28 imita as células transfectadas em comparação com NC imita-transfectadas e células MKN-28 parentais. Entretanto, não houve qualquer efeito de miR-202-3p no nível mRNA Gli1 (Fig. 5D). Estes resultados sugerem fortemente que o miR-202-3p regula negativamente a expressão Gli1 ao nível da tradução.

Entre os genes referidos como inibindo a apoptose de GC, γ-catenina (placoglobina) e BCL-2 são alvos transcricionais directos de Gli1 [34], [35]. Como mostrado na Fig. 5E, os níveis de proteína de γ-catenina e Bcl-2 foram marcadamente reduzidos em MKN-28 imita as células transfectadas com o miR-202-3p.

Além disso, examinámos a expressão da proteína Gli1 em tumores subcutâneos derivados de RV-miR-controle e RV-miR-202-3p em ratinhos nus por análise de western blot. O nível de proteína Gli1 em tumores de RV-miR-202-3p demonstrado regulação baixa comparada com a RV-miR-controle (Fig. 5F). Estes resultados sugerem fortemente que o miR-202-3p regula negativamente a expressão Gli1 pós-transcricional.

A superexpressão de Gli1 salvamentos Efeito do miR-202-3p em células GC

Desde miR-202-3p downregulated Gli1 para inibir a proliferação celular e induzem a apoptose, que é fundamentado que a sobre-expressão de Gli1 poderia inverter este fenómeno, pelo menos em parte. Com efeito, quando Gli1 superexpressando plasmídeo (pcDNA3.1-Gli1) foi introduzido em células MKN-28 BGC-823 ou transientemente transfectadas com imita o miR-202-3p, o efeito inibidor de miR-202-3p sobre o crescimento celular foi parcialmente invertida, que foi observada pelo ensaio de crescimento celular WST (Fig. 6A, B). Além disso, a progressão para a apoptose também foi dificultada quando Gli1 foi sobre-expresso em MKN-28 BGC-823 ou células transientemente transf ectadas com imita o miR-202-3p (Fig. 6C e D) .Estes dados fornecem evidência de que a inibição do crescimento e apoptose celular induzida pela miR-202-3p é pelo menos parcialmente relacionada com o seu efeito na expressão Gli1

Discussão

evidências Acumulando demonstraram desregulação do miRNA específico em GC [4], [13], [36. ]. MiR-202-3p, localizado em 10q26, tem sido relatada a ser desregulado no cancro da mama [23], [24], cancro colorrectal [26] e linfoma folicular [27]. Petrocca et ai. encontrado que o miR-202 foi regulada para baixo em gastrite crónica [28]. No entanto, o papel de miR-202-3p no desenvolvimento de GC e progressão ainda é desconhecida. Neste estudo, descobrimos que a expressão de miR-202-3p de amostras de carcinoma gástrico 68% foi significativamente menor do que a dos tecidos normais correspondentes, o que sugere que a redução da expressão de miR-202-3p é um acontecimento frequente em GC. Importante, os níveis de miR-202-3p estão negativamente correlacionados com o tamanho do tumor de GC em pacientes. Estes resultados sugerem o papel inibitório de miR-202-3p no desenvolvimento e progressão de GC.

Dado o miR-202 foi regulada para baixo em tecidos de cancro gástrico, especulamos que a sobre-expressão de miR-202 pode suprimir a fenótipos malignas de células de câncer gástrico. No presente estudo, mostramos que a restauração de miR-202-3p em células MKN-28 e BGC-823 inibe significativamente a proliferação celular e induz a apoptose tanto in vitro
e in vivo
. Estes resultados demonstraram fortemente que a expressão de miR-202-3p diminuiu em GC deve ser um fator que contribui para o desenvolvimento, em vez de ser afetado como consequência da GC. Portanto, a inibição significativa de xenoenxertos de tumores em ratinhos nus implica que estratégias terapêuticas de introdução de miR-202-3p em células cancerosas pode ser útil para retardar o processo de tumorogénese.

MiRNAs pode regular a expressão génica através de sub-regulada a tradução de ARNm alvo ou sobre-regulada degradação de mRNAs alvo [3], [37]. Com base em algoritmos de bioinformática, identificamos Gli1 como um possível gene alvo direto de miR-202-3p. Gli1, um membro da família Gli, foi originalmente identificado como um gene amplificado numa glioma maligno [38]. É um forte activador positivo de genes alvo a jusante e é ela própria um alvo transcricional de Shh sinalização [39], e que também pode ser regulada positivamente pelo RAS /PKC [40], TGF [41] e PI3K [42], e regulados negativamente pela PKA [42] e p53 de sinalização [43]. Gli1 expressão em células epiteliais podem induzir a transformação celular, caracterizada pelo aumento da proliferação e independente de ancoragem proliferação [35], [44]. Aumento do número de estudos mostram que Gli1 é sobre-expresso em vários tipos de câncer, incluindo câncer gástrico [32], [33], [45], e os níveis de Gli1 de expressão são positivamente correlacionados com a diferenciação do tumor [33]. expressão decrescente de Gli1 por cyclopamine ou siRNA resultou na inibição do crescimento celular GC e apoptose [33]. Nós validar ainda mais Gli1 como um alvo directo de miR-202-3p, verificou-se que o miR-delimitadora 202-3p com complementaridade incompleta para Gli1 3'UTR, e a sobre-expressão de miR-202-3p sub-regula Gli1 ao nível da proteína. Além disso, a análise estatística mostrou uma expressão padrões invertida significativa entre miR-202-3p e Gli1 em tecidos GC e linhas celulares. γ-catenina (placoglobina) e Bcl-2, os alvos transcricionais directos de Gli1, são referidos como inibindo a apoptose de GC. A expressão de genes alvo a jusante GLI1 y-catenina (placoglobina) e Bcl-2 [34], [35] são marcadamente reduzida quando o miR-202-3p é sobre-expresso em células de GC. Isto sugere que a inibição do crescimento de células induzidas por GC miR-202-3p pode parcialmente relacionado com a sua supressão em γ-catenina e a expressão de BCL-2, que foram por sua vez, através da interacção directa com Gli1. Mais importante, a sobre-expressão de Gli1 resgata a inibição do crescimento celular e apoptose celular induzida por miR-202-3p, ainda demonstrando que Gli1 é um alvo directo de miR-202-3p e sugerindo um papel essencial para Gli1 como um mediador dos efeitos biológicos de miR-202-3p no GC.

em resumo, miR-202-3p é frequentemente diminuída em câncer gástrico humano. Restauração do miR-202-3p inibe a proliferação de GC, pelo menos, em parte através de indução de apoptose celular por interacção directa com Gli1 (Fig. 7). Tais papéis de miR-202-3p em GC sugerem seu potencial como um microRNA terapêutica para o tratamento do câncer gástrico, que vale de mais pesquisas.

Informações de Apoio
Figura S1.

• PLOS ONE: valor prognóstico da Survivina em pacientes com câncer gástrico: Uma revisão sistemática com meta-Analysis
• PLOS ONE: diminuição da expressão de AZGP1 está associado com mau prognóstico na Primária gástrica Cancer