PLoS ONE: Afname van miR-202-3p Expression, een nieuwe tumor suppressor, in Maag Cancer

Abstract

Opkomende studies hebben aangetoond dat microRNAs zijn betrokken bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Hier vonden we dat miR-202-3p werd vaak down-gereguleerd bij maagkanker weefsels. Overexpressie van miR-202-3p bij maagkanker cellen MKN-28 en BGC-823, sterk onderdrukt celproliferatie en geïnduceerde apoptose zowel In vitro Kopen en In vivo
. Bovendien Gli1 uitdrukking was vaak positief bij maagkanker weefsels en omgekeerd gecorreleerd met miR-133b expressie. We tonen aan dat de transcriptie factor Gli1 was een doelwit van miR-202-3p en speelt een essentiële rol als mediator van de biologische effecten van miR-202-3p bij maagkanker. MiR-202-3p remde ook de expressie van γ-catenine en BCL-2. Samengenomen suggereren deze bevindingen dat miR-202-3p kan functioneren als een nieuw tumor suppressor bij maagkanker en de antitumoractiviteit kan direct targeting en remming van Gli1 attribuut

Citation:. Zhao Y, Li C, Wang M, Su L, Qu Y, Li J, et al. (2013) Afname van miR-202-3p Expression, een nieuwe tumor suppressor, bij maagkanker. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10.1371 /journal.pone.0069756

Uitgever: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

Ontvangen: 28 februari 2013; Aanvaard: 11 juni 2013; Gepubliceerd: 25 juli 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 en 81272749), Wetenschap en Technologie Commissie van Shanghai gemeente (nrs. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 en 12PJ1406300), Key Projects in de National Science and Technology Pillar Program van China (nr 2011BA203191), Fonds voor onderzoek de Doctoral Programma van Hoger Onderwijs van China (No. 20110073110071), Key Project van Shanghai Education Committee (nrs. 12ZZ102, 12ZZ105) en de Stichting Innovatie voor PhD Afgestudeerden van Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Hoewel de vooruitgang in de behandeling, de overlevingskans van patiënten met GC is teleurstellend, dit is vooral te wijten aan het gebrek aan specifieke therapeutische targets. Daarom is het cruciaal om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van maagkanker te identificeren.

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van kleine (18-25 nucleotiden), niet-coderende, enkelstrengs endogene RNA's. Zij onderdrukken eiwitexpressie door interactie met perfecte of imperfecte complementaire sequenties in het 3 'onvertaalde gebieden (3'UTRs) van doelgenen. Studies in de afgelopen jaren is gebleken dat ontregelde miRNAs spelen een belangrijke rol in diverse vormen van kanker [1] - [4], met inbegrip van GC [5] - [13]. Gegevens uit onderzoek naar miRNAs en hun target genen kunnen spannende therapeutische mogelijkheden bieden [3].

We hebben onlangs geïdentificeerd verschillende miRNAs gedereguleerd in GC, zoals de neerwaartse regulatie van miR-126 [14], miR-409-3p [15], miR-625 [16], en de opregulatie van miR-21 [17], miR-301a [18]. Hoewel veel miRNAs geïdentificeerd associëren met GC, het mechanisme van deze miRNAs in de maag ontstaan ​​van tumoren moet nog worden onderzocht. In onze vorige werk, tal van vermeende miRNAs die differentiële expressie tussen GC weefsels en hun naburige niet-tumor weefsel van 28 patiënten vertoonden werden geïdentificeerd [19]. Onder hen, miR-202-3p was één van de meest aanzienlijk gedaald miRNAs. Maar de rol van miR-202-3p in GC wordt zelden onderzocht.

MiR-202-3p, vorige naam HSA-miR-202, gelegen in een chromosomale fragiele site in 10q26. Deletie van het fragiele site is geassocieerd met endometriale [20], hersentumoren [21], [22]. MiR-202 is gerapporteerd dat gedereguleerd bij borstkanker [23], [24], plaveiselcelcarcinoma [25], colorectale kanker [26] en folliculair lymfoom [27]. Petrocca et al. vond dat miR-202 werd down-gereguleerd bij chronische gastritis [28]. MiR-202 is aangetoond dat down-gereguleerd door 4-hydroxynoneal (HNE) in HL-60 leukemiecellen [29]. Een recente studie toonde ook aan dat miR-202 direct gericht proto-oncogen MYCN, toonde een vermindering van neuroblastoom celproliferatie [30].

Hier tonen we een algemene daling van miR-202-3p expressieniveau in 150 GC weefsels in vergelijking met de niet-tumorweefsels en vinden dat de miR-202-3p niveaus hebben betrekking tumorgrootte en patiënten boven. Trouwens, ontdekten we, voor de eerste keer, dat miR-202-3p de groei kan remmen en apoptose van GC cellen zowel In vitro Kopen en In vivo
door rechtstreeks te richten op de transcriptiefactor Gli1 en het remmen van de expressie van Gli1 doelwitgenen γ-catenine en BCL-2.

Materialen en methoden

Verklaring Ethiek

schriftelijke toestemming is verkregen van alle deelnemers. Het onderzoek werd goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee van Ruijin Ziekenhuis, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), het Laboratory Animal Ethics Committee van Ruijin Hospital (LAEC 11-062). Dierlijke procedures werden volgens een protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China goedgekeurd uitgevoerd.

Cell Culture

Human GC cellijnen SGC -7901 en BGC-823 werden aangekocht van Shanghai Institutes voor Biologische Wetenschappen, de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). MKN-45 en MKN-28 cellijnen werden verkregen uit de Japanse Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan). NCI-N87, AGS, KATO III en SNU-1 cellijnen werden oorspronkelijk verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Humane embryonale niercellijn 293T (HEK-293T) werd bewaard in ons instituut. De cellen werden opgeslagen, hersteld van cryopreservatie in vloeibare stikstof en gebruikt de vroege passages. Alle cellen werden in RPMI-1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en gekweekt in 5% CO2 bevochtigde atmosfeer. Exponentieel groeiende cellen werden gebruikt voor experimenten.

Patient Tissues

Primary GC weefsels en aangepaste niet-tumorweefsels werden verkregen van 150 GC patiënten die een radicale gastrectomie op de afdeling Chirurgie, Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University. Monsters waren snap-ingevroren direct na de operatie. Alle monsters werden bevestigd door onafhankelijke pathologisch onderzoek. Geen van de patiënten preoperatieve behandeling. Voor alle patiënten, clinicopathologische informatie beschikbaar was. Tumor classificatie volgens de International Union Against Cancer (2009).

RNA isolatie en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellijnen en weefselmonsters met behulp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Concentratie en zuiverheid van het RNA-monsters werden gemeten door elektroforese en spectrofotometrische methoden. De expressie van miR-202-3p en U6 kleine nucleaire RNA (RNU6B) werden in drievoud getest door de steel-loop RT-PCR-methode met behulp van de Hairpin-it ™ miRNAs qPCR Kwantificering Kit (GenePharma, Shanghai, China) met specifieke primers formiR-202-3p en U6 kleine nucleaire RNA (RNU6B). Relatieve miRNA expressie van miR-202-3p werd genormaliseerd tegen de endogene controle, U6, met behulp van de DDCT methode. De mRNA-niveaus van Gli1 en GAPDH werden gemeten in triplo middels de SYBR Green real time PCR (Applied Biosystems, USA) volgens instructies van de fabrikant. Kwantificering werd uitgevoerd met de DDCT relatieve kwantificatie methode met menselijke GAPDH als een interne controle. De volgende primers werden gebruikt: Gli1 (sense: 5'-GGA AGT CAT ACT CAC GCC TCG A-3 '; antisense: 5'-CAT TGA TGC AGG CTT TAC TGC A-3') [31] en GAPDH (sense: 5'-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3 '; antisense: 5'-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3'.)

Transient Transfectie van miRNA Mimics

buitenspiegels 202-3p imiteert (dsRNA oligonucleotiden) en negatieve controle mimics1 (NC) (sense: 5'- UCC GAA UUC CGU GUC UTT ACG-3 ', antisens: 5'-ACG CAC UGA GUU CGG AGA ATT-3') werden gekocht van GenePharma (Shanghai, China). Cellen werden gezaaid in platen met 6 putjes de dag voor transfectie om ervoor te zorgen 40% celconfluentie op het moment van transfectie. Transfectie van miRNA nabootst in cellen werd uitgevoerd met Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de procedure van de fabrikant uitgevoerd. De miRNA bootst werden gebruikt bij een eindconcentratie van 100 nM.

Cell Proliferation Assay

Op 24 uur na transfectie met miRNA bootst cellen (2 x 10 ^{3 cellen /putje ) werden gezaaid in 96-well platen en gedurende 72 uur. Cel proliferatie werd in drievoud beoordeeld door in water oplosbare tetrazoliumzout (WST) test met behulp van de Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan) en gemeten na instructies van de fabrikant.}

Soft Agar Colony Formation Assay

miRNA bootst getransfecteerde cellen werden opnieuw gesuspendeerd met 0,3% zachte agar (A9045, lage geleringstemperatuur, Sigma-Aldrich, USA) in RPMI 1640 dat 10% FBS en gelaagd op 0,4% gestolde agar in RPMI 1640 dat 10% FBS in 6-putjes (1 x 10 ^{3 cellen /putje) en 24 uur na transfectie. De platen werden gedurende 2 weken. Kolonies bevattende ten minste 50 cellen geteld.}

Apoptose analyse

Eén dag voor transfectie met miRNA nabootst, 1 x 10 ^{6 cellen werden uitgezaaid in 6-well platen. Achtenveertig uur na transfectie werden de cellen geoogst en gekleurd met AnnexinV /PI dubbele kleuring kit (BD Biosciences, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Apoptotische cellen werden bepaald in drievoud en herhaalde driemaal onafhankelijk met stroomcytometrie op een FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).}

Retrovirale transfectie van stabiele cellijnen

genoomgebied dat inbegrepen het primaire transcript van miR-202-3p werd gekloneerd in de EcoRI-XhoI-plaats van de gemodificeerde pMSCV-GW-Rf-PGK-EGFP retrovirale vector. Negatieve controlevectoren had geen insert. HEK 293T cellen (1 x 10 ^{6 /putje) werden geënt in platen met 6 putjes de dag voor transfectie. Tien ug retroviraal construct dat ofwel miR-202-3p of geen insert, 2 ug gag /pol en 2 ug VSVG werden tezamen getransfecteerd in HEK 293T cellen met behulp van Lipofectamine ™ 2000 reagens en Opti-MEM I gereduceerd serum medium in elk bord. Virussen werden geoogst op 48 uur en 72 uur na transfectie met virale verzamelingsmedium (RPMI-1640 met 10% hitte-geïnactiveerd FBS + 1% glutamine 20 mM Hepes). Infecties van MKN-28 cellen werden in aanwezigheid van 8 ug /ml polybreen in elk putje van een 6-wells plaat uitgevoerd. Cellen werden geïnfecteerd bij draaien 1500 rpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. -Virus supernatant werd na 2 uur. Positieve cellen werden geselecteerd voor GFP expressie door FACS-sortering en noemde RV-miR-202-3p en RV-miR-control resp. MiR-202-3p expressie werd bevestigd door qRT-PCR.}

tumorgroei in Naakt Muizen

Man BALB /c nu /nu muizen, op de leeftijd van zes weken (Institute of Zoology Chinese Academy van Wetenschappen), werden ondergebracht op een specifieke pathogeen-vrije omgeving in de Animal Laboratory Unit, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, China. Muizen kregen humane zorg en het onderzoek protocollen zijn volgens een protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China goedgekeurd uitgevoerd. Cellen (100 ui, 2 × 10 ^{6 cellen) van stabiel getransfecteerde lijnen RV-miR-202-3p of RV-miR-controle werden verzameld en subcutaan geënt in muizen. Zes muizen werden voor elke groep. De muizen werden wekelijks gecontroleerd en tumoren werden gemeten met een schuifmaat. Tumor volume (V) werd geschat met de formule V = 4 /3π x L /2 x (W /2) 2, waarbij L de lengte hartlijn, en W de hartlijn width.The tumorcellen mochten groei 5 weken en tumorgroei curven en remming werden berekend. Nadat de muizen opgeofferd werden alle tumor transplantaten uitgesneden, gewogen, geoogst, gefixeerd en ingebed. Elk experiment werd tweemaal uitgevoerd.}

TUNEL analyse

De terminale nucleotidyl-transferase nick end labeling assay (TUNEL) werd uitgevoerd volgens instructies van de fabrikant van de doodlopende ™ Colorimetrische TUNEL System kit (Promega, VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). Weefsels werden gefixeerd in 10% geneutraliseerd formaline en ingebed in paraffine blokken. Secties (4 micrometer) werden vervolgens bereid voor onderzoek. Na deparaffineren werden de coupes behandeld met 20 g /ml proteinase K gedurende 10 minuten, met 0,3% H _{2O 2 in methanol gedurende 10 min en 0,1% Triton X-100 in 0,1% natriumcitraat gedurende 2 min op ijs. Vervolgens werden de secties geïncubeerd met TUNEL reactiemengsel gedurende 60 minuten bij 37 ° C. Verdere incubatie met peroxidase-geconjugeerd antilichaam werd gedurende 30 minuten bij 37 ° C. De secties werden gekleurd met diaminobenzidine oplossing 10 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens tegengekleurd met hematoxyline.}

Immunohistochemie

Secties (6 mm dik) van formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde tumor specimenswere paraffine ontdaan in xyleen en gehydrateerd in gesorteerde alcohol. Endogeen peroxidase werd geblokkeerd met 3% H _{2O 2 gedurende 10 minuten. Na antigeenterugtrekking in citraatbuffer (pH 6,0), werden de weefselcoupes geïncubeerd met normaal geitenserum om niet-specifieke antilichaambinding (20 min bij kamertemperatuur) blokkeren. De coupes werden vervolgens geïncubeerd met antilichamen Gli1 (01:50, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) bij 37 ° C in humidchambers 2 uur. Na wassen met PBS driemaal, werden de coupes geïncubeerd met peroxidase-geconjugeerd anti-konijn IgG gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Vervolgens werden de glaasjes gespoeld met PBS en gedurende 5 min met DAB substraat gedurende minder dan 30 minuten. Hematoxyline werd gebruikt voor tegenkleuring.}

Constructie van plasmiden en Luciferase Activity Assay

Een 203-bp volledige lengte van het wildtype (WT) of mutant Gli1-3'UTR Gli1-3 ' UTR (mut) met de vermeende miR-202-3p bindingsplaats werd gesynthetiseerd (Sangon, Shanghai, China). Na digestie met Spel en HindIII, werden de fragmenten van wildtype en mutante Gli1-3'UTR gekloneerd in de Spel en HindIII-plaatsen van PMIR rapporten Luciferase vector (Applied Biosystems) en genoemd PMIR /Gli1 en PMIR /Gli1 /mut, respectievelijk. DNA sequentiebepaling werd gebruikt om de constructen te verifiëren.

HEK-293T-cellen werden gezaaid in 24-well platen 24 uur voor assayprestaties. In elk putje, 100 ng PMIR /Gli1 of PMIR /Gli1 /mut, 2 ng pRL-TK (Promega, Madison, WI, USA) met Renilla luciferase en 100 nM miRNA bootst werden gecotransfecteerd met behulp van Lipofectamine ™ 2000 reagens en Opti-Memi verminderd serummedium. Relatieve luciferaseactiviteit werd berekend 48 uur na cotransfectie Dual-Glo Luciferase assay (Promega, USA) volgens de procedure van de fabrikant. Vuurvlieg luciferase activiteit werd genormaliseerd tot Renilla luciferaseactiviteit.

Western blotanalyse

De cellen werden gelyseerd en tumor met M-PER reagens en Halt Protease Inhibitor Cocktail kits (Pierce, USA). De eiwitconcentratie van de cellysaten werd gekwantificeerd onder toepassing van een BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). Eiwit werden gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese en geblot op 0,22 urn polyvinylideen difluoride membranen (Millipore, MA, USA). De volgende specifieke antilichamen werden gebruikt: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-catenine (1:2000, BD Biosciences, USA), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, USA), en GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). Eiwitniveaus werden genormaliseerd aan totale GAPDH

Constructie van expressieplasmide Gli1 en transfectie

Op amplificeren van cDNA MKN-28 met de volgende primers:. Sense (5'-TGA ACA AGT TGG GAT ATC AT-3 ') en antisense (5'- ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3'), full-length Gli1 werd verkregen, gedigereerd met EcoRV en Notl en gekloneerd in pcDNA3.1 vector (Invitrogen) en genoemd pcDNA3 0,1-Gli1. DNA sequentiebepaling werd gebruikt om de constructen te verifiëren.

De cellen werden gezaaid in platen met 6 putjes de dag voor transfectie om ervoor te zorgen 80-90% celconfluentie op het moment van transfectie. In elk putje werden de cellen getransfecteerd met 250 pmol van miR-202-3p nabootst of controle, evenals 4 ug pcDNA3.1-Gli1 of pcDNA3.1 lege vector, met gebruik van Lipofectamine 2000 WST assay werd uitgevoerd bij 24 uur na transfectie, terwijl apoptose analyse uit op 48 uur na transfectie werd uitgevoerd.

Statistische analyse

Continue variabelen werden vergeleken met behulp van t Electronics Test van de Student voor normaal verdeelde variabelen en Wilcoxon rank-sum test voor nonnormally verdeelde variabelen. De relatie tussen de miR-202-3p expressie niveaus en clinicopathologic parameters werd geanalyseerd met behulp van de Pearson Chi-square test. Alle waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± SD's. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 18.0 software Statistics (IBM, USA). Een tweezijdige waarde van P
. ≪ 0,05 werd beschouwd als statistisch significant

Resultaten

De expressie van miR-202-3p is verminderd bij GC en correleert met Clinicopathologische parameters

Uitdrukkingen van miR-202-3p werden onderzocht door qRT-PCR in tumorweefsels en de bijbehorende non-tumor weefsel van 150 GC patiënten (Fig. 1A). De resultaten tonen dat expressie van miR-202-3p aanzienlijk tumorweefsels werd downgereguleerd vergeleken met matchende niet-tumorweefsels in 68% (102/150) van de patiënten GC. (P < 0,001; fig. 1A, B)

Om de correlatie tussen de expressie van miR-202-3p en Clinicopathologische factoren in menselijke GC verder te ontrafelen, werden de 150 gevallen verder geanalyseerd (tabel 1). Op basis van de relatieve miR-202-3p expressie, werden 150 gevallen gestratificeerd in 3 groepen: miR-202-3p lage expressie (tumor /niet-tumor verhouding < 0,66, n = 85), miR-202-3p matige expressie (tumor /non-tumor verhouding 0,66-1,5, n = 34) en miR-202-3p hoge expressie (tumor /niet-tumor verhouding > 1,5, n = 31). Het miR-202-3p expressieniveaus werden negatief gecorreleerd aan tumorgrootte en positieve correlatie met leeftijd bij deze patiënten met de miR-202-3p lage expressie groepen vertoonden significant groter tumorgrootte (p = 0,013) en oudere leeftijd vergeleken met matige hoge expressie groepen (p = 0,028). Echter, miR-202-3p expressie niveaus geen relatie met geslacht, differentiatie, tumor locatie, tumor lokale invasie, lymfekliermetastasen of TNM stadium te laten zien.

overexpressie van miR-202-3p Remt GC Cell Proliferation

Gezien het feit dat miR-202-3p aanzienlijk is verminderd bij GC, kan het functioneren als een tumor suppressor. Daarom hebben we onderzocht of overexpressie van miR-202-3p in GC cellen aangetast celgroei. MKN-28 en BGC-823 cellijnen, waarvan de expressie van miR-202-3p waren de laagste van de acht geteste GC cellijnen (Fig. 1C), werden gekozen voor de daaropvolgende expreiments. Synthetische miR-202-3p bootst en negatieve controle mimic moleculen (NC) werden respectievelijk getransfecteerd in MKN-28 en BGC-823 cellen. De ectopische expressie van miR-202-3p in cellen werd bevestigd door qRT-PCR.

De WST cel-groei assay toonde significante celgroei remmingen in MKN-28-cellen die met miR-202-3p (Fig. 2.A). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in BGC-823 cellen (Fig. 2 B). Om verder te karakteriseren het effect miR-202-3p op celgroei, voerden we zachte agar kolonievorming assay in getransfecteerde cellen. We vonden dat het aantal kolonies van MKN-28 cellen getransfecteerd met de miR-202-3p bootst was bijna de helft van die van de controle en ouderlijke groep (fig. 2C). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in BGC-823 cellen (Fig. 2.D). Deze resultaten tonen aan dat miR-202-3p de celproliferatie van GC cellen kunnen onderdrukken In vitro
.

overexpressie van miR-202-3p induceert GC Cells apoptose

Sinds groeiremming kan door verstopte celcyclus progressie of verhoogde apoptose, we vervolgens voorgevormde celdelingscyclus assay en apoptose door flowcytometrie. Onze gegevens blijkt dat de apoptotische tarieven van zowel MKN-28 en BGC-823 cellen die met miR-202-3p bootst significant werden opgereguleerd (Fig. 3A, B). Er was echter geen significant verschil in celcyclus tussen verschillend behandelde groepen (data niet weergegeven). Deze resultaten gaven aan dat overexpressie van miR-202-3p induceert apoptose in GC cellen bijdraagt ​​aan de groei-remmende eigenschappen van miR-202-3p.

overexpressie van miR-202-3p Remt tumorgeniciteit en verhoogt apoptose in vivo

Gezien het feit dat miR-202-3p remt GC cellen groei en apoptose in vitro
, we vervolgens onderzocht of miR-202-3p tumorgroei kunnen onderdrukken en veroorzaken apoptose in vivo
. Cellen van MKN-28 RV-miR-202-3p (MKN-28 cellen met-retrovirus gemedieerde miR-202-3p stabiele expressie) of RV-miR-control (MKN-28 cellen met de lege vector) werden verkregen zoals beschreven in Materiaal en methoden. Cellen werden subcutaan geïnjecteerd in naakt muizen. Tumorvorming werd gevolgd. De tumor latency toonde een significant verschil tussen de muizen geïnjecteerd met RV-miR-NC cellen en RV-miR-202-3p cellen (Fig. 4A). Het is van groot belang dat tumoren afgeleid van RV-miR-202-3p cellen groeiden aanzienlijk langzamer dan de RV-miR-controlegroep gedurende de tumorgroei (Fig. 4B). Het gemiddelde gewicht van tumoren gevolg van RV-miR-202-3p was aanzienlijk minder dan tumoren afgeleid van RV-miR-controle (Fig. 4C, D).

Daarnaast TUNEL testen van tumorweefsels uitgevoerd. Zoals getoond in Fig. 5E, de RV-miR-202-3p cellen vertoonden een tumorcel positieve kleuring en een significant hogere apoptotische index dan de RV-miR-controle cellen ( P Restaurant < 0,01). Deze resultaten suggereren dat miR-202-3p remming van tumorvorming wordt toegeschreven aan de toegenomen apoptose In vivo
.

MiR-202-3p Direct Target Gli1

Om te begrijpen van het mechanisme grondslag liggen aan de tumor remmende eigenschappen van miR-202-3p in GC, wij zochten naar haar vermeende doel genen met potentiële pro-oncogene functies met behulp van online zoekfuncties (RNAhybrid en Miranda algoritmen), en de genen voorspeld door zowel van de bioinformatica instrumenten waren gekozen als de kandidaat-target genen van miR-202-3p. Onder de honderden kandidaatgenen voorspeld, de transcriptie activator Gli1 van bijzonder belang is (Figuur S1). De vermoedelijke secundaire structuur van RNA hybride menselijke miR-202-3p en Gli1 wordt getoond in figuur S2. Gli1 gerapporteerd hoog tot expressie in GC [32], [33]. Gesuggereerd dat het verlagen van de expressie van Gli1 resulteerde in GC cellijnen groeiremming en apoptose [33].

Een andere hint over de mogelijke rol van miR-202-3p in de regulatie van Gli1 uitdrukking kwam uit de analyse van de acht verschillende maagkanker cellijnen (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, KATO III, BGC-823 en MKN-28). Statistische analyse toonde een significante omgekeerde patronen expressie tussen miR-202-3p en Gli1 ((r = -0,345, P Restaurant <.. 0.001, Fig 5A)

Om de klinische relevantie deze bevindingen, onderzochten we het verband tussen de uitingen van Gli1 met miR-202-3p expressie in weefsels GC. we vonden dat Gli1 en miR-202-3p vertonen inverse expressiepatroon in GC weefsels (Tabel 2). deze resultaten ondersteunen de veronderstelling dat downregulatie van miR-202-3p verhoogt het Gli1 gen bij maagkanker.

Luciferase reporter assays werden uitgevoerd om een ​​directe interactie tussen miR-202-3p en het 3'UTR van Gli1 controleren. Luciferase reporters werden geconstrueerd die ofwel een wildtype Gli1 3'UTR sequentie waaronder de miR-202-3p bindingsplaats (PMIR /Gli1), of een gemuteerd Gli1 3'UTR (PMIR /Gli1 /mut) (Fig. 5B). de PMIR /Gli1 en PMIR /Gli1 /mut luciferase reporter constructen werden getransfecteerd in HEK-293T cellen samen met miR-202-3p of NC nabootst. de relatieve luciferaseactiviteit van de PMIR /Gli1 reporter werd duidelijk onderdrukt vergeleken met die van PMIR /Gli1 /mut in een miR-202-3p-afhankelijke manier (Fig. 5C). Dit resultaat sterk geeft aan dat 3'UTR van Gli1 draagt ​​de directe binding plaatsen van miR-202-3p.

Om te bepalen op mRNA-niveau of eiwit niveau miR-202-3p down-gereguleerd Gli1, ontdekt we Gli1 expressie door qRT-PCR en Western blot. Zoals getoond in Fig. 5E, de Gli1 eiwitgehalte werd afgenomen in miR-202-3p bootst getransfecteerde MKN-28 cellen in vergelijking met NC bootst-getransfecteerde en ouderlijke MKN-28 cellen. Ondertussen, was er geen enkel effect van miR-202-3p op het Gli1 mRNA-niveau (Fig. 5D). Deze resultaten suggereren sterk dat miR-202-3p negatief reguleert Gli1 uitdrukking op het translationele niveau.

Onder de genen gerapporteerd aan de apoptose van GC remmen, γ-catenine (plakoglobine) en BCL-2 zijn directe transcriptionele doelwitten van Gli1 [34], [35]. Zoals getoond in Fig. 5E, de eiwitniveaus van γ-catenine en BCL-2 waren aanzienlijk verlaagd MKN-28 cellen getransfecteerd met miR-202-3p nabootst.

Verder onderzochten wij de expressie van het eiwit in Gli1 subcutane tumoren dragen verkregen van RV-miR-controle en RV-miR-202-3p in naakt muizen door western blot analyse. De Gli1 eiwitgehalte in tumoren van RV-miR-202-3p aangetoond downregulatie in vergelijking met die in RV-miR-control (fig. 5F). Deze resultaten suggereren sterk dat miR-202-3p negatief reguleert Gli1 uitdrukking post-transcriptie.

Overexpressie van Gli1 Reddingen Effect van miR-202-3p in GC Cells

Sinds miR-202-3p downregulated Gli1 om celproliferatie te remmen en apoptose, wordt geredeneerd dat overexpressie van Gli1 kan dit fenomeen op zijn minst te keren voor een deel. Inderdaad, wanneer Gli1 overexpressie plasmide (pcDNA3.1-Gli1) werd in MKN-28 of BGC-823-cellen die transiënt getransfecteerd met miR-202-3p nabootst, werd het remmende effect van miR-202-3p op celgroei gedeeltelijk teruggedraaid, die werd waargenomen door WST celgroei assay (fig. 6A, B). Bovendien progressie in de richting van apoptose werd ook belemmerd wanneer Gli1 werd overexpressie in MKN-28 of BGC-823 cellen die tijdelijk met miR-202-3p bootst (Fig. 6C, D) .Deze gegevens leveren het bewijs dat de remming van de groei en de cel apoptose geïnduceerd door miR-202-3p ten minste gedeeltelijk verband met zijn effect op expressie Gli1.

Discussie

Accumulerende bewijzen hebben aangetoond ontregeling van specifieke miRNA in GC [4], [13], [36 ]. MiR-202-3p, in 10q26, is naar verluidt ontregelde bij borstkanker [23], [24], colorectale kanker [26] en folliculair lymfoom [27]. Petrocca et al. vond dat miR-202 werd down-gereguleerd bij chronische gastritis [28]. De rol van miR-202-3p GC ontwikkeling en progressie is nog steeds onbekend. In deze studie zien we dat miR-202-3p expressie van 68% maagcarcinoom monsters was significant lager dan die van overeenkomende normale weefsels, hetgeen suggereert dat verminderde miR-202-3p expressie is een frequente gebeurtenis in GC. Belangrijk is, zijn miR-202-3p niveaus negatief gecorreleerd met de grootte van de tumor van GC bij patiënten. Deze resultaten suggereren dat de remmende rol van miR-202-3p in de ontwikkeling en progressie van GC.

Aangezien miR-202 werd down-gereguleerd bij maagkanker weefsels speculeerden wij dat overexpressie van miR-202 kan onderdrukken kwaadaardige fenotypen van maagkanker cellen. In de huidige studie, laten we zien dat het herstel van miR-202-3p in MKN-28 en BGC-823 cellen significant remt cel proliferatie en induceert apoptosis zowel In vitro Kopen en In vivo
. Deze resultaten toonden aan dat de sterk verminderde miR-202-3p expressie in GC een factor die bijdraagt ​​aan de ontwikkeling plaats van aangetast als gevolg van GC moeten zijn. Daarom is de significante remming van de tumor xenotransplantaten in naakt muizen impliceren dat therapeutische strategieën van de invoering van miR-202-3p in kankercellen bruikbaar zijn voor het vertragen van het proces van het ontstaan ​​van tumoren zou kunnen zijn.

MiRNAs kan de genexpressie reguleren door middel van down-gereguleerd translatie van doelwit mRNA of opgereguleerd afbraak van doelwit mRNA [3], [37]. Op basis van de bioinformatica algoritmes identificeren we Gli1 als een mogelijke directe doelwit-gen van miR-202-3p. Gli1, lid van Gli familie, werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een geamplificeerd gen in een kwaadaardige glioma [38]. Het is een sterke positieve activator van downstream doelgenen en zelf een transcriptioneel doel van Shh signalering [39], en het kan ook worden gereguleerd door RAS /PKC [40], TGFp [41] en PI3K signalering [42] en gedownreguleerd PKA [42] en p53 signalering [43]. Gli1 expressie in epitheelcellen kan celtransformatie gekenmerkt door verhoogde proliferatie en verankering onafhankelijke proliferatie [35], [44] induceren. Steeds studies tonen aan dat overexpressie Gli1 bij verschillende kankersoorten zoals maagkanker [32], [33], [45], en de expressieniveaus van Gli1 positief gecorreleerd met tumordifferentiatie [33]. Afnemende expressie van Gli1 door cyclopamine of siRNA geleid GC celgroei remmen en apoptose [33]. We Gli1 verder te valideren als een direct doelwit van miR-202-3p, vonden we dat miR-202-3p begrenzende met onvolledige complementariteit te Gli1 3'UTR, en overexpressie van miR-202-3p down-reguleert Gli1 op eiwitniveau. Bovendien, statistische analyse toonde een significante omgekeerde patronen expressie tussen miR-202-3p en Gli1 in GC weefsels en cellijnen. γ-catenine (plakoglobine) en BCL-2, directe transcriptionele doelwitten van Gli1, worden gemeld aan de apoptose van GC remmen. De expressie van Gli1 downstream doelgenen y-catenine (plakoglobine) en BCL-2 [34], [35] zijn sterk verminderd wanneer miR-202-3p is overexpressie in GC cellen. Dit suggereert dat de groeiremming van GC cellen geïnduceerd door miR-202-3p gedeeltelijk mogelijk gerelateerd aan de onderdrukking op γ-catenine en BCL-2 expressie, dat op zijn beurt door middel van directe interactie met Gli1 waren. Belangrijker overexpressie van Gli1 redt de celgroei remmen en apoptose geïnduceerd door miR-202-3p, hetgeen opnieuw aantoont dat Gli1 een direct doelwit van miR-202-3p en suggereert een belangrijke rol voor Gli1 als een mediator van de biologische effecten van miR-202-3p in GC.

in het kort, is miR-202-3p vaak afgenomen in menselijke maagkanker. Herstel van miR-202-3p GC remt proliferatie ten minste gedeeltelijk door het induceren van apoptose door directe interactie met Gli1 (fig. 7). Een dergelijke rol van miR-202-3p in GC suggereren zijn potentieel als een therapeutische microRNA voor maag behandeling van kanker, die de moeite waard van het verder onderzoek.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.

• PLoS ONE: prognostische waarde van survivine bij patiënten met maagkanker: een systematische review met meta-Analysis
• PLoS ONE: verminderde expressie van AZGP1 wordt geassocieerd met een slechte prognose in het jeugdwerk MaagKanker