PLoS ONE: sumažėjimas Pasaulis-202-3p išraiška, romano auglio slopinamojo, skrandžio vėžio

Abstract

Nauji tyrimai parodė, kad mikro RNR dalyvauja kuriant ir progresavimo vėžio. Čia mes nustatėme, kad Pasaulis-202-3p buvo dažnai žemyn reguliuoja skrandžio vėžio audiniuose. Padidėjusi miR-202-3p skrandžio vėžio ląstelių MKN-28 ir BGC-823, labai slopino ląstelių proliferaciją ir sukeliama ląstelių apoptozę ir in vitro, parsisiųsti ir vivo
. Be to, Gli1 išraiška buvo dažnai teigiama skrandžio vėžio audiniuose ir atvirkščiai koreliuoja su Pasaulis-133B išraiška. Mes įrodyti, kad transkripcijos faktorius Gli1 buvo miR-202-3p taikinys ir vaidina svarbų vaidmenį kaip biologinio poveikio PPN-202-3p skrandžio vėžio tarpininku. MIR-202-3p taip pat slopino gama kateninai ir BCL-2 išraišką. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad Pasaulis-202-3p gali veikti kaip naują naviko slopintuvas skrandžio vėžio ir jo priešnavikinis poveikis gali priskirti tiesioginį taikymą ir slopina Gli1 pervežimas

Citation:. Zhao Y, Li C, Wang, M, S L, Qu Y, Li J, ir kt., (2013) sumažėjimas Pasaulis-202-3p išraiška, romano auglio slopinamojo, skrandžio vėžio. PLoS ONE 8 (7): e69756. Doi: 10,1371 /journal.pone.0069756

redaktorius: Williamas C. S. Cho Karalienė Elžbieta ligoninė, Honkongas

Įstojo: vasario 28, 2013; Priėmė: Gegužės 11, 2013 m Paskelbta: Lie 25, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Zhao et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijos iš nacionalinių Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 ir 81272749), mokslo ir technologijų komisijos Šanchajaus savivaldybės (Nr. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 ir 12PJ1406300), pagrindiniai projektai Nacionalinėje mokslo ir technologijų ramsčio programa Kinijoje (Nr 2011BA203191), mokslinių tyrimų fondas doktorantūros programa aukštojo mokslo Kinijos (Nr 20110073110071), pagrindiniai projekto Šanchajaus švietimo komiteto (12ZZ102 Nr., 12ZZ105) ir inovacijų fondas doktorantūros absolventai Šanchajaus Jiao Tong universiteto medicinos mokyklos (BXJ201213). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų ir antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [1]. Nors pažanga gydymo, išgyvenamumas pacientų su GC apmaudu, tai yra daugiausia dėl konkrečių terapinių tikslų trūkumo. Todėl svarbu nustatyti molekulinius mechanizmus, sukeliančius skrandžio vėžio vystymąsi.

mikro RNR (miRNAs) yra mažų (18-25 nukleotidų), nekoduojamame, viengrandds endogeninių RNR klasė. Jie slopina baltymų ekspresiją bendrauja su tobula ar netobulų papildomų sekų esančių 3'untranslated regionuose (3'UTRs) tikslinių genų. Tyrimai Per pastaruosius kelerius metus parodė, kad dysregulated miRNAs vaidina svarbų vaidmenį įvairiose vėžio [1] - [4], įskaitant GC [5] - [13]. Duomenys iš tyrimo dėl miRNAs ir jų tikslinės genai gali suteikti įdomių terapines galimybes [3].

Mes neseniai nustatė keletą miRNAs nereguliuojamos GC, pavyzdžiui, downregulation PPN-126 [14], PPN-409-3p [15], PPN-625 [16] ir ląstelę Pasaulis-21 [17], PPN-301A [18]. Nors daugelis miRNAs buvo nustatyti susiejant su GC, šių miRNAs skrandžio Tumorigenesis mechanizmas dar reikia ištirti. Mūsų ankstesniame darbe buvo nustatyta daugybė spėjamas miRNAs kurie parodė diferencialinę išraišką tarp GC audinių ir jų gretimų ne navikų audiniuose iš 28 pacientų [19]. Tarp jų, PPN-202-3p buvo vienas iš labiausiai gerokai sumažėjo miRNAs. Tačiau retai tiriama miR-202-3p vaidmuo GC.

MIR-202-3p ankstesni pavadintas HSA-Pasaulis-202, esančių chromosomų trapi svetainėje 10q26. Išbraukta iš trapios svetainėje buvo susijęs su gimdos gleivinės [20], smegenų auglių [21], [22]. MIR-202 buvo pranešta, kad nereguliuojama krūties vėžio [23], [24], gimdos kaklelio suragėjusių ląstelių [25], kolorektalinio vėžio [26] ir folikulinė limfoma [27]. Petrocca ir kt. nustatė, kad Pasaulis-202 buvo žemyn reguliuojama lėtiniu gastritu [28]. MIR-202 buvo įrodyta, kad būti žemyn reguliuojama 4-hydroxynoneal (HNE) HL-60 ląstelių leukemijos [29]. Neseniai atliktas tyrimas taip pat parodė, kad Pasaulis-202 tiesiogiai skirta Proto-onkogeno MYCN, todėl į neuroblastoma ląstelių proliferaciją [30] slopinimo.

Čia mes parodyti bendrą sumažėjimą Pasaulis-202-3p ekspresiją 150 GC audiniai, palyginti su ne navikų audiniuose, ir rasti, kad mir-202-3p lygiai yra susiję su naviko dydžio ir pacientų amžiaus. Be to, mes atrado, pirmą kartą, kad Pasaulis-202-3p gali slopinti augimą ir sukelti apoptozę GC ląstelių ir in vitro parsisiųsti ir vivo
tiesiogiai nukreipta į transkripcijos faktorius Gli1 ir slopina išraiška Gli1 tikslinių genų γ-kateninai ir BCL-2.

medžiagos ir metodai

etika pareiškimas

Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš visų dalyvių. Tyrimas buvo patvirtintas Žmogiškųjų tyrimų etikos komiteto Ruijin ligoninė, medicinos mokyklos, Šanchajaus Jiao Tong universiteto (HREC 08-028), laboratorija gyvūnų etikos komiteto Ruijin ligoninė (LAEC 11-062). Gyvūnų procedūros buvo atliktos pagal protokolą pagal institucinius gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto (IACUC) patvirtintą Šanchajaus Jiao Tong universiteto Šanchajuje, Kinijoje.

Mobilusis Kultūra

Žmogaus GC ląstelių linijos SGC -7901 ir BGC-823 buvo įsigytas iš Shanghai institutai biologijos mokslų, Kinijos mokslų akademijos (Šanchajus, Kinija). MKN-45 ir MKN-28 ląstelių linijos buvo gauti iš Japonijos vėžio tyrimų išteklių banko (Tokijas, Japonija). NVI-N87, AGS, KATO III ir SNU-1 ląstelių linijų iš pradžių buvo įsigytas iš Amerikos tipas Kultūros kolekcijos (Manassas, VA, USA). Žmogaus embriono inkstų ląstelių linija 293T (HEK-293T) buvo išsaugota mūsų institute. Ląstelės buvo saugomi, atsigavo nuo kriokonservavimas skystame azote ir naudojami pradžioje ištraukas. Visos ląstelės buvo prižiūrimi RPMI-1640 terpė plius 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS) ir kultūringas 5% CO2 drėkinamame atmosferą. Eksponentiškai augančių ląstelių buvo naudojami eksperimentams.

Ligonių audiniai

Pirminiai GC audiniai ir suderinti ne navikų audiniuose, buvo gauti iš 150 GC pacientams, kuriems atliekama radikali pašalintas skrandis tuo Chirurgijos departamento Ruijin ligoninės, mokyklos medicinos Šanchajaus Jiao Tong universiteto. Mėginiai buvo Snap-šaldyta tiesiogiai po operacijos. Visi mėginiai buvo patvirtinta nepriklausomo patologinį tyrimą. Nė vienas iš pacientų gautos priešoperacinė gydymą. Visiems pacientams, klinikos informacijos. Naviko klasifikacija pagal Tarptautinės Sąjunga su vėžiu (2009).

RNR išskyrimas ir kiekybinė Realaus laiko PGR (KRL-PGR)

Viso RNR buvo išskirta iš ląstelių linijų ir audinių mėginių, naudojant Trizol reagentas (Invitrogen, Carlsbad, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Koncentracijos ir švarumo RNR mėginių buvo matuojamas elektroforezės ir spektrofotometriniu metodais. Sąvoka lygiai PPN-202-3p ir U6 mažą branduolinės RNR (RNU6B) buvo tiriami trimis egzemplioriais pagal kamieninių kilpa AT-PGR metodu, naudojant tą segtukas-ji ™ miRNAs qPCR kiekybinio Kit (GenePharma, Šanchajus, Kinija) su konkrečių gruntams formiR-202-3p ir U6 mažas branduolinis RNR (RNU6B). Santykinis Mirna išraiška miR-202-3p normalizavosi prieš endogeninio kontrolės, U6, naudojant DDCt metodą. MRNR lygiai Gli1 ir GAPDH buvo matuojamas trimis egzemplioriais naudojant SYBR Žalioji realaus laiko PGR (Applied BIOSYSTEMS, JAV) pagal gamintojo nurodymus. Kiekybinis buvo padaryta naudojant DDCt santykinį kiekybinio nustatymo metodo žmogaus GAPDH kaip vidaus kontrolė. buvo naudojami šie gruntai: Gli1 (jausmas: 5'-GGA AGT CAT AKTAS ŠMC Persijos TCG A-3 "; Priešprasminis: 5'-CAT TGC TGA AGG CTT BLSK TGC A-3") [31] ir GAPDH (jausmas: 5'-GGA BMT GAA KTG CCG TCT AG-3 "; Priešprasminis: 5'-GTA Persijos PVG GAT Persijos CTT GA-3").

Laikina transfekciją Mirna imituoja

MiR- 202-3p imituoja (dsRNR oligonukleotidai) ir neigiamus kontrolinius mimics1 (NC) (jausmas: 5'-UUC UCC GAA PGV GUC ACG UTT-3 ", Priešprasminis: 5'-ACG UGA ŠMC GUU CGG AGA PGS-3") buvo įsigytos nuo GenePharma (Šanchajus, Kinija). Ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse dieną prieš transfekciją, siekiant užtikrinti 40% ląstelių santakoje, transfekciją metu. Transfekciją Mirna imituoja į ląsteles buvo atliktas su Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo procedūrą. Į Mirna imituoja buvo naudojami ne galutinė koncentracija 100 nm.

ląstelių proliferaciją Analizės

24-h po transfekciją su Mirna imituoja ląstelės (2 × 10 ^{3 ląstelių /gerai ) buvo pasėjamos į 96-duobučių lėkštelėse ir inkubuojami 72 valandas. Ląstelių proliferacija buvo vertinama trimis egzemplioriais pagal vandenyje tirpaus tetrazolio druska (WST) Analizės naudojant Mobilusis Skaičiavimo KIT-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonija) ir matuojamas pagal gamintojo nurodymus.}

Minkštas Agaras kolonija formavimas Analizės

Mirna imituoja Transfekuoti ląstelės buvo sumaišymo su 0,3% minkšta agarozės (A9045, žemos gelį sudarančio temperatūros, Sigma-Aldrich, JAV) RPMI 1640, kurių sudėtyje yra 10% FBS ir sluoksniuotos ant 0,4% įtvirtino agaro RPMI 1640 sudėtyje turintys 10% FBS į 6-duobučių lėkšteles (1 × 10 ^{3 ląstelių /gerai), esant 24 h po transfekciją. Plokštelės buvo inkubuojami 2 savaites. Kolonijos, kurių sudėtyje yra ne mažiau kaip 50 ląstelių buvo skaičiuojami.}

Apoptozę analizė

Vieną dieną prieš transfekciją su Mirna imituoja, 1 × 10 ^{6 ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, ląstelės buvo surinktos ir nudažytos AnnexinV /PI dvigubo dažymo Kit (BD biologijos mokslų, JAV) pagal gamintojo protokolą. Apoptozinės ląstelės buvo vertinami trimis egzemplioriais ir pakartojo tris kartus nepriklausomai tėkmės citometrijos FACScan (Bekmano instrumentų, Fullerton, CA, JAV).}

imunodeficito transfekcijq stabilios ląstelių linijų

Genomo regionas, įtrauktas pagrindinis stenograma miR-202-3p buvo klonuotas į EcoRI-Xhol svetainėje modifikuoto pMSCV-GW-RDA-PGK-EGFP retrovirusų vektorių. Neigiama kontrolė vektoriai neturėjo įdėklą. HEK 293T ląstelės (1 × 10 ^{6 /gerai), buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse dieną prieš transfekciją. Dešimt UG ir retrovirusų konstruktas, kuriame nei Pasaulis-202-3p ar ne įterpti, 2 UG ir gag /pol ir 2 ug iš VSVG buvo bendrai perkeltų į HEK 293T ląstelių naudojant Lipofectamine ™ 2000 reagentą ir Opti-Mem I sumažinti serumo terpę kiekvienoje plokštelė. Virusai buvo surinktos 48 h ir 72 h po transfekciją virusinės kolekcija Medium (RPMI-1640 su 10% šilumos-inaktyvuota FBS + 1% Glutaminas 20 mM Hepes). Infekcijos MKN-28 ląstelių buvo atlikti 8 g /ml polibrenui buvimo kiekvienoje 6 šulinėlių plokštelės šulinėlį. Ląstelės buvo nugaros užsikrėtęs 1500 apsisukimų per minutę 30 min, esant kambario temperatūrai. Virusas, kurių sudėtyje yra supernatantas buvo pašalintas po 2 val. Teigiami ląstelės buvo pasirinktas GFP išraiškos FACS rūšiavimo ir pavadino RV-mir-202-3p ir RV-mir-Control atitinkamai. MIR-202-3p išraiška buvo patvirtinta KRL-PGR.}

naviko augimą nuogas Pelės

Vyras BALB /c nu /nu Pelės, esant amžiaus šešias savaites (instituto Zoologijos Kinijos mokslų akademijos mokslų), buvo laikomi tam tikru patogeno aplinkos gyvūnų laboratorijos padalinys, medicinos mokyklos, Šanchajaus Jiao Tong universiteto, Kinija. Pelės gavo humaniškai ir studijų protokolai buvo atliekamas pagal protokolą pagal institucinius gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto (IACUC) patvirtintą Šanchajaus Jiao Tong universiteto Šanchajuje, Kinijoje. Ląstelės (100 ml, 2 × 10 ^{6 ląstelių) iš stabilių perkeltų eilutes RV-Pasaulis-202-3p ar RV-Pasaulis-kontrolė buvo surinkti ir oda pasėtų į pelių. Šešis pelių buvo naudojami kiekvienai grupei. Pelės buvo tikrinamas kas savaitę, ir naviko mazgeliai buvo matuojamas slankmačiu. Naviko tūris (V) buvo įvertintas lygtimi V = 4 /3π × L /2 × (W /2) 2, kurioje L yra vidurio ašies, ir W yra vidurio ašis width.The auglio ląstelės buvo leista augimo 5-savaites, ir naviko augimo kreivių ir slopinantys normos buvo apskaičiuojamas. Po pelėms buvo paaukotas, visi naviko skiepai buvo pašalintų, pasverti, surenkamos, fiksuotas, ir įterptais. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas du kartus.}

TUNEL analizė

terminalo nucleotidyl transferazės tarpininkaujant Nikas pabaiga ženklinimo analizė (TUNEL) buvo atliktas pagal gamintojo nurodymus akligatvio ™ Kolorimetrinis TUNEL System Kit (PROMEGA, JAV). Audiniai buvo nustatytas 10% neutralizuotas formalinu ir įdėta į parafino blokus. (4 mkm) Sekcijos tada buvo parengtas tyrimas. Po to, kai deparaffinization, sekcijos buvo gydomi 20 g /ml proteinazės K 10 min, su 0,3% O _{2O 2 metanolyje 10 min ir 0,1% Triton X-100 į 0,1% natrio citrato, 2 minutes ant ledo. Tada dalys buvo inkubuotos su TUNEL reakcijos mišinio 60 min 37 ° C temperatūroje. Toliau inkubacijos su peroksidaze konjuguotų antikūno buvo atliktas 30 min 37 ° C temperatūroje. Skyriai buvo tamsintas su diaminobenzidinas tirpalą 10 min kambario temperatūroje ir tada counterstained hematoksilinu.}

imunohistocheminis

Profiliai (6 mm storio) formalinu fiksuotos, parafiną įdėta naviko specimenswere deparaffinized į ksilenas ir rehidratuoti rūšiavo alkoholio. Endogeninė peroksidazės buvo užblokuotas naudojant 3% H _{2O 2 10 min. Po antigeno paieškos citrato buferio (pH 6,0), audinių dalys buvo inkubuojami su normaliu ožkų kraujo serume blokuoti nespecifinį antikūno jungimosi (20 min kambario temperatūroje). Tuomet skyriai buvo inkubuojami su Gli1 antikūnų (1:50, SC-20.687, Santa Cruz Biotechnologijos Inc, Santa Krusas, Kalifornija) 37 ° C humidchambers 2 val. Po plovimo su PBS tris kartus, sekcijos buvo inkubuojamos su peroksidaze konjuguoto anti-triušio IgG 1 valandą, o esant kambario temperatūrai. Kitą, skaidres buvo praplautos PBS ir inkubuojami 5 min su DAB substrato mažiau nei 30 min. Hematoksilinu buvo naudojamas counterstaining.}

Statybinės plazmidžių ir liuciferazės Aktyvumas Analizės

203-BP pilnas ilgis laukinio tipo (WT), Gli1-3'UTR arba mutantas Gli1-3 " UTR (Mut), kuriame yra spėjamą Pasaulis-202-3p prijungimo vietą buvo susintetintas (Sangon, Šanchajus, Kinija). Po virškinimo SpeI ir HindIII, iš laukinio tipo ir mutantas Gli1-3'UTR fragmentai buvo klonuoti į SpeI ir Hind III vietų pMIR-ataskaita liuciferazės vektoriaus (Applied Biosystems) ir pavadino pMIR /Gli1 ir pMIR /Gli1 /Mut, atitinkamai. DNR sekos buvo naudojamas patikrinti konstrukcijas.

HEK-293T ląstelės buvo pasėjamos į 24-duobučių lėkštelėse 24 valandų prieš skiriant kaip atlikti. Kiekvienoje gerai, 100 ng pMIR /Gli1 ar pMIR /Gli1 /Mut, 2 ng PRL-TK (PROMEGA, Madison, WI, JAV), kurioje Renilla liuciferazės ir 100 Nm Mirna imituoja buvo cotransfected naudojant Lipofectamine ™ 2000 reagentą ir Opti-Memi sumažintas serumo terpėje. Santykinis liuciferazė veikla buvo apskaičiuojamas 48 h po kontransfekcijai vartojantiems Dual-Glo liuciferazės tyrimą (PROMEGA, JAV) pagal gamintojo tvarka. "Firefly liuciferazė veikla buvo normalizuotas Renilla liuciferazės veikla.

Vakarų dėmė analizė

elementų ir navikas buvo lizuoti naudojant" M-PER reagentus bei sustabdyti proteazės inhibitorius kokteilis rinkiniai (Pierce, JAV). Baltymo koncentracija ląstelių lizato buvo skaičiais, naudojant BCA Baltymų Analizės rinkinys (Pierce, JAV). Baltymų buvo atskirti SDS poliakrilamido gelyje ir Lik ant 0,22-mikrometrai polivinilideno difluoridą membranų (Millipore, MA, JAV). buvo naudojami šie specifiniai antikūnai: Gli1 (1:1000, Mobilusis Signalizacijos technologijos), γ-kateninai (1:2000 BD biomokslai, JAV), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, JAV) ir GAPDH (1: 20000, Abcam, Jungtinė Karalystė). Baltymų koncentracija buvo standartizuoti viso GAPDH

Statybos Gli1 išraiška PLAZMID ir transfekcijq

stiprintuvo kDNR iš MKN-28 naudojant šiuos pradmenis. Prasme (5'-AGT TGA PPK TGG GAT, ATC AT-3) ir Priešprasminis (5'-ATG CGG CCG CTT AGG ŠMC TA-3 "), pilnametražis Gli1 buvo gautas, suardomas EcoR V ir ne tik aš ir klonuotas į pcDNA3.1 vektoriaus (Invitrogen) ir pavadino pcDNA3 0,1-Gli1. DNR sekos buvo naudojamas patikrinti konstrukcijas.

Ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse dieną prieš transfekciją, siekiant užtikrinti 80-90% ląstelių santakoje, transfekciją metu. Kiekvienoje gerai, ląstelės buvo pernešta 250 pmol PPN-202-3p imituoja ar kontrolės, kartu su 4 UG ir pcDNA3.1-Gli1 arba pcDNA3.1 tuščias vektorių, naudojant Lipofectamine 2000 WST tyrimą buvo atlikta 24 h po transfekcija, o apoptozė analizė buvo atliekama 48 h po transfekciją.

Statistinė analizė

Nuolatiniai kintamieji buvo palyginti naudojant Stjudento t
testas paprastai platinami kintamųjų ir Vilkoksono rango suma testas nonnormally platinami kintamųjų. Tarp Mir-202-3p ekspresijos lygį ir clinicopathologic parametrų santykiai buvo analizuojami naudojant Pearson chi-square testą. Visos reikšmės pateikiamos kaip reiškia ± SDS. Visi statistinės analizės buvo atliekamos naudojant PASW Statistics 18.0 programinę įrangą (IBM, JAV). Dviejų-tailed vertė P
. ≪ 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

Apie miR-202-3p išraiška sumažėjo GC ir koreliuoja su Clinicopathologic parametrai

išraiškos PPN-202-3p išnagrinėjo KRL-PGR naviko audinių ir suderintų ne navikų audiniuose iš 150 GC pacientų (pav. 1A). Rezultatai rodo, kad išraiška miR-202-3p buvo žymiai downregulated naviko audiniuose palyginti su suderintų ne navikų audiniuose, 68% (102/150) GC pacientams. (P < 0,001; pav. 1A, B),

Jei dar išsiaiškinti ryšį tarp ekspresijos lygio PPN-202-3p ir clinicopathologic veiksnių žmogaus GC atitiktį, 150 atvejų buvo nagrinėjamas toliau (1 lentelė). Remiantis santykinio Pasaulis-202-3p išraiškos, 150 atvejų buvo suskirstyti į 3 grupes: Pasaulis-202-3p mažas išraiška (navikas /ne auglys santykis < 0,66, n = 85), PPN-202-3p vidutinio išraiška (naviko /ne-navikas santykis 0,66-1,5, n = 34) ir miR-202-3p aukštos išraiška (naviko /ne-navikas santykis > 1,5, n = 31). Mir-202-3p ekspresijos lygis neigiamai koreliuoja su naviko dydžio ir teigiamai koreliuoja su amžiumi šiems pacientams su Mir-202-3p žemos raiškos grupės eksponavo žymiai didesnis navikas dydis (p = 0,013) ir vyresniojo amžiaus palyginti su vidutinio sunkumo ar ekspresijos grupių (p = 0,028). Tačiau, PPN-202-3p ekspresijos lygis neparodė jokio ryšio su pacientų lytimi, diferenciacija, naviko vietą, naviko vietos invazijos, limfmazgių metastazių ar TNM etape.

Padidėjusi miR-202-3p Slopina GC ląstelių proliferacija

kadangi Pasaulis-202-3p žymiai sumažėjo GC, ji gali veikti kaip naviko slopintuvas. Todėl mes išnagrinėti, ar raiškos miR-202-3p GC ląstelių įtakos ląstelių augimą. MKN-28 ir BGC-823 ląstelių linijas, kurių išraiška miR-202-3p buvo mažiausias per aštuonerius išbandytų GC ląstelių linijas (. 1C pav), buvo pasirinktas vėlesnių expreiments. Sintetiniai Pasaulis-202-3p imituoja ir neigiamus kontrolinius mimikos molekulės (NC) buvo pernešta į MKN-28 ir BGC-823 ląstelių atitinkamai. Negimdinis išraiška miR-202-3p ląstelėse buvo patvirtinta KRL-PGR.

WST ląstelių augimo tyrimas parodė didelius ląstelių augimą draudimų ir MKN-28 ląstelių transfektuotose Pasaulis-202-3p (pav. 2.A). Panašūs rezultatai buvo pastebėtas BGC-823 ląstelių (pav. 2.b). Norėdami papildomai apibūdinti poveikio MIR-202-3p ląstelių augimui, mes atliekame minkštą agar kolonija formavimo ištirtas perkeltų ląstelių. Mes nustatėme, kad kolonijų skaičius iš MKN-28 ląstelių transfektuotose Mir-202-3p imituoja buvo beveik pusė, kad iš kontrolės ir tėvų grupės (pav. 2C). Panašūs rezultatai buvo pastebėtas BGC-823 ląstelių (pav. 2.D). Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-202-3p gali slopinti ląstelių proliferaciją GC ląstelių in vitro
.

Padidėjusi Pasaulis-202-3p Skatina GC Cells Apoptozę

Nuo augimo slopinimas gali ė l užblokuotas ląstelių ciklo progresavimo arba padidėjęs apoptozės, kitą kartą iš anksto suformuoti ląstelių dalijimąsi ciklo testą ir apoptozę tėkmės citometrijos. Mūsų duomenys rodo, kad apoptozės normos abiejų MKN-28 ir BGC-823 ląstelių transfektuotose Pasaulis-202-3p imituoja buvo žymiai aktyvinama (. 3A pav, B). Tačiau nebuvo reikšmingo skirtumo ląstelės ciklo tarp skirtingai gydomų grupių (duomenys nerodo). Šie rezultatai parodė, kad padidėjusi miR-202-3p indukuoja apoptozę GC ląstelių gali prisideda prie augimo slopinimas savybių PPN-202-3p.

Padidėjusi miR-202-3p Slopina tumorogeniš- ir padidina apoptozę in vivo

Kadangi Pasaulis-202-3p slopina GC ląstelių augimą ir indukuoja apoptozę in vitro
, kitą kartą išnagrinėti, ar Pasaulis-202-3p gali slopinti auglio augimą ir sukelti apoptozė vivo
. buvo gautos ląstelės MKN-28, RV-miR-202-3p (MKN-28 ląstelių retrovirusų tarpininkaujant Pasaulis-202-3p stabili išraiška) arba RV-Pasaulis-Control (MKN-28 ląstelių su tuščiu vektorių), kaip aprašyta medžiagų ir metodų. Ląstelės buvo švirkščiamas į poodį į nuogas pelių. Naviko formavimasis buvo stebimi. Navikas latentinis laikas parodė didelį skirtumą tarp pelių švirkščiamas su RV-Pasaulis-NC ląstelių ir RV-Pasaulis-202-3p ląstelių (pav. 4a). Ji yra labai įdomus, kad navikai, gautos iš RV-miR-202-3p ląstelių išaugo iš esmės lėčiau, palyginti su RV-miR-kontrolinės grupės visoje naviko augimui (4B pav.). Vidutinis svoris navikų, atsiradusių iš RV-miR-202-3p buvo gerokai mažesnis nei auglių, gautų iš RV-miR-kontrolė (Pav. 4C, D).

Be to, buvo atliktas Tünel tyrimai naviko audiniuose. Kaip parodyta Fig. 5E, RV-Pasaulis-202-3p ląstelės parodė daugiau naviko ląstelių teigiamą dažymo ir žymiai didesnis Apoptozė indeksą nei RV-Pasaulis-kontrolinių ląstelių ( P
< 0,01). Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-202-3p slopinimas tumorogeniš- priskiriama prie didesnio apoptozės in vivo
.

MIR-202-3p Tiesiogiai Tikslinė Gli1

Norėdami suprasti šio mechanizmo grindžiantis auglio slopinančiomis savybėmis PPN-202-3p GC, mes ieškoma jos tariamų tikslinių genų su potencialiais PRO-onkogeniniam funkcijų naudojant internetines paieškos įrankius (RNAhybrid ir Miranda algoritmai) ir genai prognozavo abi bioinformatikos priemonių buvo pasirinkta kaip kandidatas tikslinių genų miR-202-3p. Tarp kandidačių genų šimtai prognozuojama, transkripcijos aktyvatorius Gli1 yra ypač svarbus (S1 paveiksle). Spėjamą antrinė struktūra RNR hibridas žmogaus miR-202-3p ir Gli1 rodomas S2 pav. Gli1 buvo pranešta labai išreikštas GC [32], [33]. Tai rodo, kad mažėja išraiška Gli1 lėmė GC ląstelių linijos augimo slopinimo ir apoptozės [33].

Dar vienas patarimas apie galimą vaidmenį PPN-202-3p atsižvelgiant į Gli1 raiškos reguliavimo atėjo iš analizės aštuonių skirtingų skrandžio vėžio ląstelių linijas (MKN-45, SGC-7901, AGS, NVI-N87, SNU-1, KATO III, BGC-823 ir MKN-28). Statistinė analizė parodė reikšmingą apverstą modelius išraišką tarp Pasaulis-202-3p ir Gli1 ((r = -0,345 P
. ≪. 0.001 pav 5A)

Jei įvertinti klinikinė reikšmė šių išvadų, mes išnagrinėjo tarp Gli1 išraiškos su Pasaulis-202-3p raiškos sąsajas GC audiniuose. mes nustatėme, kad Gli1 ir Pasaulis-202-3p eksponatas atvirkštinė išraiška modelis GC audinių (2 lentelė). Šie rezultatai patvirtina prielaida, kad downregulation miR-202-3p padidina Gli1 geno skrandžio vėžio lygį.

buvo atliekama liuciferazės Reporter tyrimai patikrinti tiesioginę sąveiką Pasaulis-202-3p ir Gli1 3'UTR srities. liuciferazės Žurnalistai buvo pastatyti, kurių sudėtyje yra arba laukinio tipo Gli1 3'UTR seką, įskaitant mir-202-3p privalomą svetainėje (pMIR /Gli1), ar mutavo Gli1 3'UTR (pMIR /Gli1 /Mut) (5b pav.). pMIR /Gli1 ir pMIR /Gli1 /Mut liuciferazė Reporter konstruktai buvo pernešta į HEK-293T ląstelių kartu su MIR-202-3p arba NC imituoja. santykinis liuciferazė veikla pMIR /Gli1 reporteris buvo žymiai slopinamas palyginti su pMIR /Gli1 /Mut į Pasaulis-202-3p priklausomu būdu (pav. 5C). Šis rezultatas rodo, kad stipriai 3'UTR iš Gli1 vykdo tiesiogines privalomus svetainių PPN-202-3p.

Jei nustato, iRNR lygio ar baltymo lygio miR-202-3p žemyn reguliuojama Gli1, mes nustatėme, Gli1 išraiška atliekant KRL-PGR ir Vakarų dėmė. Kaip parodyta Fig. 5E, The Gli1 baltymų lygis sumažėjo Pasaulis-202-3p imituoja-Transfekuoti MKN-28 ląstelių, lyginant su NC imituoja-perkeltų ir tėvų MKN-28 ląstelių. Tuo tarpu, nebuvo bet kurį iš miR-202-3p poveikis Gli1 iRNR lygiu (pav. 5D). Šie rezultatai aiškiai rodo, kad Pasaulis-202-3p neigiamai reguliuoja Gli1 išraiška transliacijos lygio.

Tarp genų pranešta slopina GC apoptozę, γ-kateninai (Plakoglobin) ir BCL-2 yra tiesioginiai transkripcijos tikslai iš Gli1 [34], [35]. Kaip parodyta Fig. 5E, baltyminiai lygiai gama kateninai ir BCL-2 buvo ženkliai sumažintas MKN-28 ląstelių transfektuotose Pasaulis-202-3p imituoja.

Be to, mes išnagrinėjo išraiška Gli1 baltymų poodinio navikų gautų iš RV-miR-kontrolė ir RV-miR-202-3p nuogas pelių Vakarų dėmė analizė. Gli1 baltymų lygis navikų iš RV-miR-202-3p parodė downregulation palyginti su, kad RV-miR-kontrolės (5F pav.). Šie rezultatai aiškiai rodo, kad Pasaulis-202-3p neigiamai reguliuoja Gli1 išraišką po transkripciškai.

Padidėjusi Gli1 gelbsti Effect PPN-202-3p GC Ląstelės

Nuo miR-202-3p downregulated Gli1 slopina ląstelių proliferaciją ir indukuoja apoptozę, ji yra pagrįstas, kad iš Gli1 raiškos galėtų pakeisti šį reiškinį bent jau iš dalies. Iš tiesų, kai Gli1 ekspresija plazmidės (pcDNA3.1-Gli1) buvo įtraukta į MKN-28 arba BGC-823 ląstelių laikinai perkeltų su Pasaulis-202-3p imituoja, slopinantis poveikis miR-202-3p ląstelių augimui buvo iš dalies panaikintas, kuris buvo stebimas wst ląstelių augimo tyrime (. 6A pav B). Be to, ligos progresavimo į apoptozės taip pat trukdė kai Gli1 buvo ekspresija į MKN-28 arba bgc-823 ląstelių laikinai transfekuota Pasaulis-202-3p imituoja (pav. 6C, D) .Šios duomenys pateikti įrodymų, kad augimo slopinimas ir ląstelių apoptozė sukeltas ir miR-202-3p yra bent iš dalies susijusios su jos poveikį Gli1 išraiška.

Aptarimas

kaupiamosios įrodymai parodė, disreguliacija konkretaus mirna į GC [4], [13], [36 ]. MIR-202-3p, įsikūręs 10q26, buvo pranešta, kad disregulated krūties vėžio [23], [24], kolorektalinio vėžio [26] ir folikulinė limfoma [27]. Petrocca ir kt. nustatė, kad Pasaulis-202 buvo žemyn reguliuojama lėtiniu gastritu [28]. Tačiau miR-202-3p vaidmuo GC plėtros ir progresavimo dar Unkown. Šiame tyrime mes pastebėjome, kad Pasaulis-202-3p išraiška 68% skrandžio karcinoma pavyzdžių buvo gerokai mažesnis nei suderintų normaliuose audiniuose, o tai rodo, kad sumažėjo Pasaulis-202-3p išraiška yra dažnas įvykis GC. Svarbu, PPN-202-3p lygiai neigiamai koreliuoja su naviko dydžio GC pacientams. Šie rezultatai rodo, slopinantį vaidmenį PPN-202-3p kuriant ir progresavimo GC.

Kadangi Pasaulis-202 buvo žemyn reguliuoja skrandžio vėžio audiniuose, mes spėliojo, kad padidėjusi miR-202, gali slopinti piktybiniai fenotipų skrandžio vėžio ląsteles. Šioje studijoje, mes parodome, kad restauracija miR-202-3p į MKN-28 ir BGC-823 ląstelių žymiai slopina ląstelių proliferaciją ir indukuoja apoptozę ir in vitro, parsisiųsti ir vivo
. Šie rezultatai aiškiai parodė, kad sumažėjo Pasaulis-202-3p išraiška GC turėtų būti veiksnys, kūrimo, o ne paveikti kaip GC pasekmė. Todėl didelis slopinimas navikų audiniuose, nuogas pelių reiškia, kad gydymo strategijas įvedimo MIR-202-3p į vėžinių ląstelių gali būti naudinga sustabdydamas iš Tumorigenesis procesą.

miRNAs gali reguliuoti genų ekspresiją per žemyn reguliuojama vertimo tikslinės mRNR arba viršuje reguliuojamo degradacijos tikslinių mRNAs [3], [37]. Remiantis bioinformatikos algoritmų, mes nustatyti Gli1 kaip įmanoma tiesiogiai taikinio geno PPN-202-3p. Gli1, iš Gli šeimos narys, iš pradžių buvo identifikuojami kaip įgarsintam geno A piktybine glioma [38]. Jis yra stiprus teigiamas aktyvatorius tolesniems tikslinių genų ir pati yra transkripcijos tikslas Ša signalizacijos [39], ir ji taip pat gali būti aktyvinama pagal anksčiau /PKC [40], TGFβ [41] ir PI3K signalizacijos [42], ir downregulated pagal pKa [42] ir p53 signalizacijos [43]. Gli1 išraiška epitelio ląstelių gali sukelti ląstelių transformaciją būdingas padidėjęs proliferaciją ir tvirtinimo nepriklausomas platinimo [35], [44]. Daugėja tyrimų rodo, kad Gli1 ekspresija įvairių vėžio, įskaitant skrandžio vėžio [32], [33], [45], ir ekspresijos lygis Gli1 teigiamai koreliuoja su naviko diferenciacijos [33]. Mažėjančios išraiška Gli1 iki cyclopamine ar siRNA lėmė GC ląstelių augimo slopinimo ir apoptozės [33]. Mes taip pat patvirtinti Gli1 kaip tiesioginis tikslas PPN-202-3p, mes nustatėme, kad Pasaulis-202-3p ribojantis su nepilno papildytų Gli1 3'UTR srities ir raiškos PPN-202-3p žemyn reguliuoja Gli1 tuo baltymų lygį. Be to, statistinė analizė parodė reikšmingą apverstą modelius išraišką tarp miR-202-3p ir Gli1 GC audinių ir ląstelių linijų. γ-kateninai (Plakoglobin) ir BCL-2, tiesioginiai transkripcijos tikslai Gli1, kaip pranešama, slopina GC apoptozę. Iš Gli1 pasroviui tikslinės genų gama kateninai (Plakoglobin) ir BCL-2 [34], [35] išraiška yra gerokai sumažintas, kai Pasaulis-202-3p ekspresija GC ląsteles. Tai rodo, kad augimo slopinimas GC ląstelių sukeltų miR-202-3p gali iš dalies susijusi su jo slopinimas gama kateninai ir BCL-2 raiškos, kuri savo ruožtu buvo per tiesiogine sąveika su Gli1. Svarbu tai, kad padidėjusią Gli1 gelbsti ląstelių augimo slopinimas ir ląstelių apoptozę sukeltas miR-202-3p, taip pat rodo, kad Gli1 yra tiesioginis taikinys miR-202-3p ir rodo kaip biologinio poveikio tarpininko svarbų vaidmenį Gli1 Pasaulis-202-3p GC.

Apibendrinant, PPN-202-3p dažnai sumažėjo žmogaus skrandžio vėžio. Atkūrimas miR-202-3p slopina GC proliferaciją bent iš dalies per skatinant ląstelių apoptozę pagal tiesiogine sąveika su Gli1 (pav. 7). Tokie vaidmenys PPN-202-3p GC rodo savo potencialą kaip terapinio MicroRNA skrandžio vėžio gydymo, kuris yra verta tolesnių tyrimų.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.

• PLoS ONE: prognozinė vertė Survivin pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu: sisteminė apžvalga su Meta-Analysis
• PLoS ONE: sumažėjęs išraiška AZGP1 asocijuojasi su prasta prognoze Pirminis Skrandžio Cancer