PLoS One: Csökkent a miR-202-3p Expression, a Novel tumor szupresszor, a gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

A feltörekvő vizsgálatok azt mutatták, hogy a mikroRNS vesznek részt a kialakulásában és progressziójában rák. Itt azt találtuk, hogy a miR-202-3p gyakran volt lefelé szabályozni a gyomorrák szövetekben. Túlexpressziója miR-202-3p gyomorrákban sejtek MKN-28 és a BGC-823, kifejezetten visszaszorította sejtburjánzást és indukált apoptózis mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Továbbá Gli1 kifejezés gyakran volt pozitív a gyomorrák szövetek és fordítottan arányos a miR-133B kifejezést. Mi bizonyítja, hogy a transzkripciós faktor Gli1 volt a cél, miR-202-3p és fontos szerepet játszik, mint a közvetítő a biológiai hatásainak miR-202-3p gyomorrákban. MiR-202-3p is gátolta a kifejezés a γ-catenin és a Bcl-2. Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-202-3p működhet, mint egy újszerű tumorszuppresszor a gyomorrák és az anti-tumor aktivitás attribútum közvetlen célzási és gátlása Gli1.

bevezető hivatkozás: Zhao Y, Li C, Wang M, Su L, Qu Y, Li J., et al. (2013) Csökkent a miR-202-3p Expression, a Novel tumor szupresszor, gyomorrákban. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10,1371 /journal.pone.0069756 katalógusa

Vágó: William C. S. Cho, a Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong katalógusa

Beérkezett: Február 28, 2013-ra; Elfogadva: június 11, 2013; Megjelent: július 25, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Zhao et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány ben támogatták Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (sz. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 és 81272749), Tudományos és Technológiai Bizottságának Shanghai Önkormányzat (sz. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 és 12PJ1406300), Key projektek a Nemzeti Tudományos és Technológiai pillér Program of China (No. 2011BA203191), Kutatási Alap Doktori Program Felsőoktatási Kína (No. 20110073110071), Key Project Shanghai Oktatási Bizottság (sz. 12ZZ102, 12ZZ105) és az innovációs Alapítvány PhD Pályakezdő Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) az egyik leggyakoribb rosszindulatú, és a második leggyakoribb oka a rák okozta halál világszerte [1]. Bár kezelésében elért, a betegek túlélési arányát GC kiábrándító, ez elsősorban annak köszönhető, hogy a csekély számú specifikus terápiás célokat. Ezért nagyon fontos, hogy azonosítsa a molekuláris mechanizmusok mögöttes fejlődésének gyomorrák.

A mikroRNS (miRNS-ek) egy osztály a kis (18-25 nukleotid), nem kódoló, egyszálú endogén RNS-ek. Elnyomják fehérje expresszióját kölcsönhatásban tökéletes vagy tökéletlen komplementer szekvenciák található 3'untranslated régiókban (3'UTRs) a megcélzott gének. Tanulmányok az elmúlt néhány év megmutatta, hogy szabályozatlan miRNS fontos szerepet játszanak a különböző rákos megbetegedések [1] - [4], beleértve a GC [5] - [13]. Az adatok a tanulmány miRNS és target gének nyújt izgalmas terápiás lehetőséget. [3] katalógusa

A közelmúltban azonosított több miRNS szabályozatlan GC, mint például downregulációját miR-126 [14], a miR-409-3p [15], miR-625 [16], és fokozza a miR-21 [17], miR-301a. [18] Bár sok miRNS azonosítottak tömörítő GC, a mechanizmus ezen miRNS a gyomor tumorogenezisben még meg kell vizsgálni. A mi korábbi munka, számos feltételezett miRNS azt mutatta, differenciális expressziója között GC szövetek és azok szomszédos, nem tumoros szövetben a 28 beteget azonosítottak [19]. Közülük miR-202-3p egyike volt a legnagyobb mértékben csökkent miRNS. Azonban a szerepe a miR-202-3p GC ritkán vizsgálták. Katalógusa

miR-202-3p, korábbi neve hsa-miR-202, található egy kromoszóma törékeny helyszínen 10q26. Törlése a törékeny helyén már társítva endometriális [20], az agydaganatok, [21] [22]. MiR-202 már leírták, hogy szabályozatlan emlőrákban [23], [24], nyaki laphám [25], végbélrák [26] és a follikuláris limfóma [27]. Petrocca et al. megállapította, hogy a miR-202-ben alulszabályozott krónikus gastritis [28]. MiR-202 kimutatták, hogy le-szabályozzák 4-hydroxynoneal (HNE) A HL-60 leukémia sejtek [29]. Egy nemrégiben készült tanulmány is kimutatta, hogy a miR-202 közvetlenül célozza proto-onkogén MYCN, ami gátolja a neuroblastoma sejtek szaporodását [30]. Katalógusa

Itt azt mutatjuk be, hogy az általános csökkenés a miR-expressziós szintjének 202-3p 150 GC szöveteket összehasonlítva a nem-tumoros szövetek és találják, hogy az miR-202-3p szintek vannak társítva a tumor mérete és a betegek kor. Emellett, felfedeztük, az első alkalommal, hogy a miR-202-3p gátolhatják a növekedést és apoptózist indukál a GC-sejtek egyaránt in vitro
és a in vivo
által közvetlenül megcélzó a transzkripciós faktor Gli1 és kifejeződését gátolják Gli1 célgének γ-katenin és a BCL-2. katalógusa

anyagok és módszerek katalógusa

Etikai nyilatkozat katalógusa

írásos beleegyező nyilatkozatot nyerték minden résztvevő számára. A tanulmány által jóváhagyott Emberi Kutatási Etikai Bizottságának Ruijin Kórház, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), a Laboratory Animal Etikai Bizottsága Ruijin Kórház (LAEC 11-062). Állati eljárást végeztek protokoll szerint jóváhagyta az Institutional Animál Care and Use Committee (IACUC) a Shanghai Jiao Tong Egyetem, Sanghaj, Kína. Katalógusa

Cell Culture katalógusa

Az emberi GC sejtvonalak SGC -7901 és BGC-823 vásároltunk a Shanghai Institutes for Biological Sciences, a kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína). MKN-45 és MKN-28 sejtvonalakat kaptuk a japán Cancer Research Resources Bank (Tokió, Japán). NCI-N87, AGS, KATO III és SNU-1 sejtvonalat eredetileg vásárolt az American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Humán embrionális vese sejtvonal 293T (HEK-293T) megőrződött intézetünkben. A sejteket a tárolt, felépült mélyhűtés folyékony nitrogénben és használt korai részeket. Minden sejteket tartottunk fenn RPMI-1640 közegben, plusz 10% magzati borjúszérummal (FBS), és tenyésztjük, 5% CO2, nedvesített atmoszférában. Az exponenciálisan növekvő sejteket kísérletekben használják. Katalógusa

A beteg szöveteket

Elsődleges GC szövetek és kiegyenlített a nem daganatos szöveteket nyert 150 GC átesett betegek radikális gastrectomián a Sebészeti Osztály, Ruijin Kórház, Iskola Orvostudományi Shanghai Jiao Tong Egyetem. A mintákat lefagyasztottuk közvetlenül a műtét után. Az összes mintát megerősítette független patológiai vizsgálat. Egyik beteg részesült preoperatív kezelést. Minden beteg esetében klinikopatológiai információ állt rendelkezésre. Tumor besorolás szerint a Nemzetközi Rákellenes Unió (2009). Katalógusa

RNS izolálás és kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) hotelben

A teljes RNS-t vontunk ki sejtvonalak és szövetminták Trizol reagens (Invitrogen, Carisbad, USA), a gyártó utasításai szerint. Koncentrációk és tisztasága az RNS mintákat mértük elektroforézissel és spektrofotometriás módszerekkel. Az expressziós szintje miR-202-3p és U6 kisebb nukleáris RNS (RNU6B) vizsgáltuk háromszoros ismétlésben a szár-hurok RT-PCR módszer segítségével a hajtű-it ™ miRNS qPCR mennyiségi Kit (GenePharma, Shanghai, Kína) specifikus primerekkel formiR-202-3p és U6 kisebb nukleáris RNS (RNU6B). Relatív miRNS expressziós miR-202-3p normalizálódott ellen endogén kontroll, U6, a DDCt módszerrel. A mRNS-szintje a Gli1 és GAPDH mértük háromszoros ismétlésben a SYBR Green valós idejű PCR-rel (Applied Biosystems, USA), a gyártó előírásainak megfelelően. Számszerűsítése alkalmazásával végeztük DDCt relatív mennyiségi módszer humán GAPDH belső kontrollként. A következő primereket használtuk: Gli1 (szensz: 5'-GGA AGT CAT ACT CAC GCC TCG A-3 '; antiszensz: 5'-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3') [31] és a GAPDH (ész: 5'-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3 '; antiszensz: 5'-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3').

tranziens transzfekciójával miRNS utánozza

miR 202-3p utánozza (dsRNS oligonukleotidok) és negatív kontroll mimics1 (NC) (szensz: 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ', antiszensz: 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3') vásároltunk re GenePharma (Sanghaj, Kína). Sejteket oltottunk 6 mérőhelyes lemezekre napon a transzfekció előtt, hogy biztosítsa a 40% sejt összefolyás pillanatában transzfekció. Transzfekciója miRNS utánozza sejtekbe végeztük Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a gyártó utasításai szerint eljárást. A miRNS utánozza használtak a végső koncentrációban 100 nm.

Cell Proliferation Assay

24 óra post-transzfekciót miRNS-utánzatok, sejtek (2 × 10 ^{3 sejt /mérőhely ) oltottunk 96 lyukú lemezekre és 72 órán keresztül inkubáltuk. Sejt proliferációt pedig az háromszoros ismétlésben által vízoldható tetrazolium sót (WST) assay segítségével sejtszámláló Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japán), és a mért követve a gyártó utasításait.}

Soft Agar telepképző assay

miRNS utánozza transzfektált sejteket újra felszuszpendáltuk 0,3% -os lágy agaróz (A9045, alacsony gélesedési hőmérsékletű, Sigma-Aldrich, USA) tartalmazó RPMI 1640, amely 10% FBS-t és rétegezzük 0,4% megszilárdult agar RPMI 1640, amely 10% FBS-sel 6-lyukú lemezre (1 × 10 ^{3 sejt /mérőhely) 24 órával a transzfekció. A lemezeket inkubáltuk 2 héten át. A telepeket, amelyek legalább 50 sejteket megszámláltuk.}

Az apoptózis elemzése

előtt egy nappal a transzfekciót a miRNS-utánzatok, 1 × 10 ^{6 sejteket oltottunk 6 mérőhelyes lemezeken. Negyvennyolc órával a transzfekció után a sejteket összegyűjtjük, és megfestettük Annexin V /PI kettős festés kit (BD Biosciences, USA), a gyártó protokollja szerint. Az apoptotikus sejteket értékelték háromszori ismétlésben, és háromszor megismételtük függetlenül áramlási citometriával FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).}

retrovirális transzfekció Stabil sejtvonalak

genomikus tartomány, amely tartalmazta a a primer transzkriptum miR-202-3p klónoztuk az EcoRI-XhoI hely a módosított pMSCV-GW-RFA-PGK-EGFP retrovirális vektor. Negatív kontroll vektorok nem volt betét. HEK 293T sejteket (1 × 10 ^{6 /lyuk) oltottunk 6 mérőhelyes lemezekre előtti napon transzfekció. Tíz ug retrovirális konstrukciót, amely vagy miR-202-3p vagy inszert nélküli, 2 ug gag /pol és 2 ug VSVG voltak ko-transzfektáltuk HEK 293T-sejteket Lipofectamine ™ 2000 reagenst és Opti-MEM I redukált szérum táptalajban az egyes lemez. Vírusok gyűjtöttünk 48 óra és 72 óra post-transzfekció virális gyűjtemény tápközeg (RPMI-1640, 10% hővel inaktivált FBS + 1% glutamin 20 mM HEPES). Fertőzések MKN-28 sejteket végezzük jelenlétében 8 ug /ml polibren egyes lyukakban egy 6 mélyedéses lemezen. A sejteket centrifugálás fertőzött 1500 rpm, 30 percig szobahőmérsékleten. Vírust tartalmazó felülúszót eltávolítottuk, 2 óra után. Pozitív sejtet kiválasztott GFP FACS-válogatás és elemzi RV-miR-202-3p és RV-miR-ellenőrzés volt. MiR-202-3p kifejezés igazoltuk qRT-PCR. Katalógusa}

tumor növekedésére Nude egerek katalógusa

Férfi BALB /c nu /nu egereken évesen hat héten (Zoológiai Intézet Kínai Tudományos Akadémia Akadémia), tartottunk egy meghatározott kórokozóktól mentes környezetben az Állat-Laboratóriumi berendezés, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong Egyetem, Kína. Az egerek humánus ellátást és a vizsgálati protokollok szerint hajtottuk végre, hogy a protokoll által jóváhagyott intézményi Animal Care and Use Committee (IACUC) a Shanghai Jiao Tong Egyetem, Sanghaj, Kína. A sejteket (100 ul, 2 × 10 ^{6 sejtek) stabilan transzfektált vonalak RV-miR-202-3p vagy RV-miR-ellenőrzési gyűjtöttünk és szubkután oltottunk egerekbe. Hat egereket használtunk minden csoportban. Az egereket hetente ellenőrizve, és a tumor gócok mértük tolómércével. A tumor térfogatát (V) becsültük egyenlet segítségével V = 4 /3π × L /2 × (W /2) 2, ahol L a közepén tengely hossza, és W jelentése a közép-tengely width.The tumor sejteket hagytunk növekedés 5 hetes és a tumor növekedési görbék, és gátolja arányok számoltunk. Miután az egereket leöltük, az összes tumor graftokat kivágtuk, lemértük, betakarított, fix, és a beágyazott. Mindegyik kísérletet kétszer végeztük.}

TUNEL analízis

A terminál nucleotidyl transzferáz mediálta nick end labeling assay (TUNEL) végeztük a gyártó utasításai szerint Deadend ™ Kolorimetriás TUNEL rendszer készlet (Promega, USA). A szöveteket rögzítettük 10% semlegesített formalin és paraffinba ágyaztuk blokkokat. A (4 nm) ezután készült vizsgálat. Miután deparaffinization a metszeteket kezeltük 20 g /ml proteináz K-10 percen keresztül, 0,3% H _{2 O 2 metanollal 10 percig, és 0,1% Triton X-100, 0,1% -os nátrium-citrát 2 percig jégen. Ezután a metszeteket TUNEL reakcióelegyet 60 percig 37 ° C-on. További inkubálás peroxidázzal konjugált antitest végeztük 30 percen át 37 ° C-on. A metszeteket festettük diaminobenzidin oldattal 10 percen át szobahőmérsékleten keverjük, majd hematoxilinnel ellenfestettük.}

Immunhisztokémia

szakaszok (6 mm vastag) formalinnal fixált, paraffinba ágyazott tumor specimenswere paraffint a xilol és rehydráltuk felszálló alkohol. Az endogén peroxidáz blokkolva eluálószerként 3% H _{2 O 2-on 10 percig. Miután antigén visszakeresés citrát pufferben (pH = 6,0), a szöveti metszeteket normál kecske szérummal, hogy blokkolja a nem specifikus antitest kötődés (20 percig szobahőmérsékleten). A metszeteket ezután inkubáltuk Gli1 antitestek (1:50, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), 37 ° C-on humidchambers 2 órán át. Mosás után PBS-sel háromszor, a metszeteket peroxidáz-konjugált anti-nyúl IgG-t 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a tárgylemezeket öblítjük PBS-sel és 5 percig inkubáltuk DAB szubsztrát kevesebb, mint 30 perc. Hematoxilinnal használtunk counterstaining.}

plazmidok és luciferáz aktivitás Assay

203-bp teljes hosszúságú vad típusú (WT) Gli1-3'UTR vagy mutáns Gli1-3 ' UTR (mut), amely a feltételezett miR-202-3p kötőhely szintetizált (Sangon, Shanghai, Kína). Emésztés után a Spel és HindlII, a fragmenseket a vad típusú és a mutáns Gli1-3'UTR klónoztuk a Spel és HindIII helyei pMIR-Report luciferáz vektor (Applied Biosystems) és a megnevezett pMIR /Gli1 és pMIR /Gli1 /MUT, illetőleg. DNS szekvenálás arra használták, hogy ellenőrizze a konstrukciókat.

HEK-293T sejteket szélesztettünk 24 mérőhelyes lemezeken 24 órán előtt assay teljesítményét. Minden egyes lyukban, 100 ng pMIR /Gli1 vagy pMIR /Gli1 /MUT, 2 ng pRL-TK (Promega, Madison, WI, USA) tartalmazó Renilla luciferázt és 100 nM miRNS utánozza kotranszfektáltunk Lipofectamine ™ 2000 reagenst és Opti-Memi csökkentett szérum közegben. Relatív luciferázaktivitást számítottuk után 48 órával együttes transzfekció segítségével Dual-Glo Luciferase assay (Promega, USA) alkalmazásával a gyártó eljárást. Szentjánosbogár luciferáz aktivitást normalizáltuk Renilla luciferáz aktivitást.

Western-blot analízis

A sejteket és a tumor lizáltuk használatával M-PER reagensek és megállítása Protease Inhibitor Cocktail készletek (Pierce, USA). A fehérje koncentrációját a sejt lizátumok mennyiségét használva BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). Protein elválasztottuk SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel és blottoltuk 0,22-um polivinilidén-difluorid membránokra (Millipore, MA, USA). A következő specifikus ellenanyagokat alkalmaztuk: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-catenin (1:2000, BD Biosciences, USA), a Bcl-2 (1:2000, EPITMICS, USA), és a GAPDH (1: 20000, ABCAM, UK). Protein szint is teljes GAPDH. Katalógusa

Építőipari Gli1 expressziós plazmid és Transzfekció katalógusa

erősítő cDNS MKN-28 az alábbi primerek használatával: ész (5'AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 ') és antiszensz (5'-ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3'), teljes hosszúságú Gli1 kapunk, emésztettük EcoR V és Not I és beklónoztuk pcDNA3.1 vektorba (Invitrogen), és elneveztük pcDNA3 0,1-Gli1. DNS szekvenálás arra használták, hogy ellenőrizze a konstrukciókat.

sejteket oltottunk 6 mérőhelyes lemezekre napon a transzfekció előtt annak biztosítása érdekében, 80-90% sejt összefolyás pillanatában transzfekció. Minden egyes lyukban a sejteket transzfektáltunk 250 pmol miR-202-3p utánozza, vagy kontroll, együtt 4 ug pcDNA3.1-Gli1 vagy a pcDNA3.1 üres vektor, a Lipofectamine 2000 WST vizsgálatot végeztünk 24 óra transzfekciót követően, míg az apoptózist elemzést végeztünk 48 órával a transzfekciót. katalógusa

Statisztikai elemzés katalógusa

a folytonos változók, mint a Student-féle t katalógusa teszt normális eloszlás és Wilcoxon rank-sum tesztet nonnormally eloszlású változók. A kapcsolat a miR-202-3p expressziós szintek és a klinikopatológiai paraméterek elemeztük a Pearson Chi-négyzet próba. Minden érték van bemutatva, mint azt jelenti, ± SDS-ben. Minden statisztikai analízist végeztük PASW Statisztika 18,0 szoftver (IBM, USA). A kétfarkú értéke P katalógusa < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

A kifejezés a miR-202-3p csökkent a GC és korrelál klinikai és paraméterek

a kifejezések a miR-202-3p vizsgáltuk qRT-PCR tumorszövetmintákból kiegyenlített a nem daganatos szövetekben 150 GC beteg (1A.). Az eredmények azt mutatják, hogy a kifejezés a miR-202-3p szignifikánsan csökkent expressziót a daganatos szövetekben képest kiegyenlített, nem daganatos szövetek 68% (102/150) a GC-betegekben (p <0,001; 1A., B).

a további megvilágítása korreláció expressziós szintje miR-202-3p klinikopatológiai faktorokkal humán GC, 150 esetben tovább elemezzük (1. táblázat). A viszonylagos miR-202-3p kifejezés, a 150 esetet rétegezni 3 csoportba: miR-202-3p alacsony expressziója (tumor /nem-daganatos arány < 0,66, n = 85), a miR-202-3p mérsékelt kifejezés (tumor /nem-daganatos arány 0,66-1,5, n = 34) és miR-202-3p magas expressziós (tumor /nem-daganatos arány > 1,5, n = 31). A miR-expressziós szinteket 202-3p korrelált a tumor mérete és pozitívan korrelál az életkorral ezeknél a betegeknél, a miR-202-3p alacsony expressziós csoportjánál jóval nagyobb a tumor mérete (p = 0,013) és az idős kor, mint a közepesen vagy magas expressziós csoportban (p = 0,028). Azonban miR-202-3p expressziós szintje nem mutatott összefüggést a nemmel, a differenciálás, lokalizációja, a daganat helyi invázió, nyirokcsomómetastasis vagy TNM. Katalógusa

túltermelése miR-202-3p Gátolja GC sejt proliferáció

Tekintettel arra, hogy a miR-202-3p jelentősen csökkent GC, ilyenkor mint egy tumor szupresszor. Ezért megvizsgáltuk, hogy túltermelése miR-202-3p GC érintett sejtek a sejtek növekedését. MKN-28 és a BGC-823 sejtvonal, melynek kifejezése miR-202-3p volt a legalacsonyabb a nyolc tesztelt GC sejtvonalak (ábra. 1C), választottunk a későbbi expreiments. Szintetikus miR-202-3p utánozza és negatív kontroll utánzó molekulák (Észak-Karolina) t transzfektáltunk MKN-28 és a BGC-823 sejtek esetében. A méhen kívüli kifejezése miR-202-3p sejtekben igazoltuk qRT-PCR. Katalógusa

A WST sejtnövekedést vizsgálatban szignifikáns sejtnövekedést gátlások MKN-28 transzfektált sejtek miR-202-3p (ábra. 2.A). Hasonló eredményeket figyeltünk meg BGC-823 sejtek (ábra. 2.B). További jellemzése a hatás miR-202-3p a sejtnövekedésre végeztünk lágy agar telepképző assay transzfektált sejtekben. Azt találtuk, hogy a számos telepet MKN-28 transzfektált sejtek a miR-202-3p utánozza csaknem fele, a kontroll és a szülői csoportban (ábra. 2C). Hasonló eredményeket figyeltünk meg BGC-823 sejtek (ábra. 2.D). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a miR-202-3p elnyomja a sejtek szaporodását a GC sejtek in vitro katalógusa.

túltermelése miR-202-3p indukál GC Cells apoptózist katalógusa

Mivel növekedés gátlása vajon miatt blokkolt sejtciklus progresszióját vagy fokozott apoptózis, a következő alkalommal előre sejtosztódási ciklus vizsgálat és az apoptózis áramlási citometriával. Eredményeink azt mutatták, hogy az apoptotikus aránya mindkét MKN-28 és a BGC-823 sejteket transzfektáltunk miR-202-3p utánozza szignifikánsan felülszabályozott (3A., B). Azonban nem volt szignifikáns különbség a sejtciklus közötti különbözőképpen kezelt csoportok (az adatokat nem mutatjuk). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy túltermelése miR-202-3p apoptózist indukál GC sejtek hozzájárul a növekedést gátló tulajdonságait miR-202-3p. Katalógusa

túltermelése miR-202-3p Gátolja tumorgenézisre és Növeli apoptózis in vivo Matton

Tekintettel arra, hogy a miR-202-3p gátolja GC sejtek növekedését és apoptózist indukál in vitro katalógusa, a következő alkalommal vizsgálta, hogy a miR-202-3p tudta elnyomni a tumor növekedését, fokozza apoptózis in vivo katalógusa. A sejteket a MKN-28, RV-miR-202-3p (MKN-28 sejtek retrovírus által közvetített miR-202-3p stabil expresszió), vagy RV-miR-vezérlés (MKN-28 sejtek az üres vektor) kaptuk leírtak az Anyag és módszer. A sejteket injektáltunk szubkután csupasz egerekben. A tumorképződés nyomon. A tumor lappangási idő szignifikáns különbség a kezelt egerek RV-miR-NC sejtek és RV-miR-202-3p sejtek (4A.). Ez a jelentős érdeklődés, hogy a daganatok származó RV-miR-202-3p sejtek jelentősen nőtt lassabban, mint az RV-miR-kontrollcsoportban a daganat növekedését (ábra. 4B). Az átlagos súlya tumorok eredő RV-miR-202-3p szignifikánsan kisebb volt, mint a tumorok származó RV-miR-vezérlés (ábra. 4C, D).

Továbbá, TUNEL assay a tumor szövetek végeztünk. Ábrán látható. 5E, a RV-miR-202-3p sejteket mutatott több tumorsejt pozitív festéssel és jelentősen magasabb apoptotikus index, mint az RV-miR-kontroll sejtek ( p
< 0,01). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-202-3p gátlása tumorogenitás tulajdonított fokozott apoptózist in vivo katalógusa.

miR-202-3p közvetlenül célozzák Gli1 katalógusa

Ahhoz, hogy megértsük a mechanizmus alapjául a tumor-gátló tulajdonságokkal miR-202-3p GC kerestünk annak feltételezett célgének potenciális pro-onkogén funkciók segítségével online keresés szerszámok (RNAhybrid és Miranda algoritmusok), és a gének által megjósolt mind a bioinformatikai eszközök voltak választották a jelölt célgénjeit miR-202-3p. Között több száz jelölt gén jósolt, a transzkripciós aktivátor Gli1 különösen érdekes (ábra S1). A feltételezett másodlagos szerkezetét RNS hibrid emberi miR-202-3p és Gli1 ábrán látható S2. Gli1 számoltak erősen expresszálódik GC [32], [33]. Azt javasolta, hogy a csökkenő kifejezése Gli1 eredményezett GC sejtvonalak növekedésének gátlását és az apoptózis. [33] katalógusa

A további tippet a potenciális szerepét miR-202-3p szabályozásában Gli1 kifejezés jelent meg az elemzés nyolc különböző gyomor rákos sejtvonalat (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, KATO III, BGC-823 és MKN-28). A statisztikai elemzés szignifikáns fordított minták kifejezés között miR-202-3p és Gli1 ((r = -0,345, P katalógusa < 0,001, Fig. 5A). Katalógusa

Annak felmérése klinikai jelentősége E megállapítások azt vizsgáltuk az összefüggést a kifejezései Gli1 a miR-202-3p expresszió GC szövetekben. azt találtuk, hogy Gli1 és miR-202-3p kiállítás inverz expressziós mintázatot GC szövetekben (2. táblázat). Ezek az eredmények alátámasztják feltevést, hogy downregulációját miR-202-3p emeli a Gli1 gén gyomorrákban. katalógusa

a luciferáz riporter vizsgálatot végeztünk, hogy ellenőrizze a közvetlen kölcsönhatás miR-202-3p és 3'UTR a Gli1. luciferáz riporterek épültek, amely vagy egy vad típusú Gli1 3'UTR szekvencia, beleértve a miR-202-3p kötőhely (pMIR /Gli1) vagy egy mutált Gli1 3'UTR (pMIR /Gli1 /MUT) (ábra. 5B.) a pMIR /Gli1 és pMIR /Gli1 /MUT luciferáz riporter konstrukciót transzfektáltuk HEK-293T-sejtek, valamint a miR-202-3p vagy NC utánozza. a relatív luciferáz aktivitását pMIR /Gli1 riporter kifejezetten visszaszorította összehasonlítottuk a pMIR /Gli1 /mut a miR-202-3p-függő módon (ábra. 5C). Ez az eredmény azt mutatja, hogy erősen 3'UTR a Gli1 hordozza a közvetlen kötőhelyek miR-202-3p. Katalógusa

Annak meghatározására mRNS-szinten vagy fehérje szinten a miR-202-3p leszabályozott Gli1 találtunk, Gli1 kifejezés qRT-PCR és Western blot. Ábrán látható. 5E, a Gli1 fehérje szintje csökkent a miR-202-3p utánozza transzfektált MKN-28 sejtek képest NC utánozza transzfektált és a szülői MKN-28 sejtekben. Közben nem volt hatása a miR-202-3p a Gli1 mRNS szintet (ábra. 5D). Ezek az eredmények határozottan arra utalnak, hogy a miR-202-3p negatívan szabályozza Gli1 expressziós transzlációs szinten.

közül a gének jelentett, hogy gátolja a apoptózist GC, γ-catenin (Plakoglobin) és Bcl-2 közvetlen transzkripciós célok a Gli1 [34], [35]. Ábrán látható. 5E, a fehérje szintje a γ-catenin és Bcl-2 jelentősen csökkent azon MKN-28 transzfektált sejtek miR-202-3p utánozza.

Emellett megvizsgáltuk expresszióját Gli1 fehérje szubkután tumorok származtatott származó RV-miR-szabályozás és RV-miR-202-3p nude egerekben Western blot analízissel. A Gli1 fehérje szintje tumorok RV-miR-202-3p bizonyította alulszabályozottsághoz képest, az RV-miR-vezérlés (ábra. 5F). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a miR-202-3p negatívan szabályozza Gli1 kifejezés utáni transzkripció szempontjából. Katalógusa

túltermelése Gli1 mentések hatása miR-202-3p GC Cells katalógusa

Mivel a miR-202-3p downregulált Gli1, hogy gátolja a sejtproliferációt és apoptózist indukál, akkor indokolt, hogy overexpressziója Gli1 megfordíthatja ezt a jelenséget legalább részben. Valóban, amikor Gli1 overexpresszáló plazmidot (pcDNA3.1-Gli1 volt) vezettünk be MKN-28 vagy BGC-823 sejteket tranziensen transzfektáltunk miR-202-3p utánozza, a gátló hatás a miR-202-3p sejtnövekedésre részben megfordult, amely által megfigyelt WST sejtnövekedési vizsgálati eljárás (a 6A., B). Sőt, progresszió felé apoptózist is megnehezíti, ha Gli1 volt túltermelõdik MKN-28 vagy BGC-823 sejtek átmenetileg transzfektált miR-202-3p utánozza (ábra. 6C, D) .Ezek az adatok bizonyítják, hogy a növekedés gátlása és a sejtek által indukált apoptózis miR-202-3p legalább részben kapcsolódik annak hatását Gli1 kifejezést. katalógusa

Vita katalógusa

a halmozódó bizonyítékok igazolták zavara specifikus miRNS GC [4], [13], [36 ]. MiR-202-3p található 10q26, leírták, hogy szabályozatlan emlőrákban [23], [24], végbélrák [26] és a follikuláris limfóma [27]. Petrocca et al. megállapította, hogy a miR-202-ben alulszabályozott krónikus gastritis [28]. Azonban a szerepe a miR-202-3p GC kialakulásának és progressziójának még unkown. Ebben a vizsgálatban azt találjuk, hogy a miR-202-3p expressziójának 68% gyomor karcinóma minták lényegesen alacsonyabb volt, mint a párosított normál szövetekben, ami arra utal, hogy a csökkentett miR-202-3p kifejezés egy gyakori esemény a GC. Fontos, hogy a miR-202-3p szint negatívan korrelált a tumor mérete GC betegeknél. Ezek az eredmények azt sugallják, a gátló szerepet a miR-202-3p a kialakulásában és progressziójában GC. Katalógusa

Mivel a miR-202-t lefelé szabályozni a gyomorrák szövetekben, azt gondolták, hogy túltermelése miR-202 talán elnyomja a malignus fenotípus a gyomor rákos sejteket. A jelen tanulmányban azt mutatják, hogy a helyreállítás a miR-202-3p az MKN-28 és a BGC-823 sejtek jelentősen gátolja a sejtek szaporodását és apoptózist indukál mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Ezek az eredmények határozottan kimutatták, hogy a csökkent miR-202-3p expresszió GC kell egy tényező, amely hozzájárul a fejlesztés, ahelyett, hogy következtében érintett GC. Ezért a jelentős gátlását a tumor xenograftok pucér egerekben azt jelenti, hogy terápiás stratégiák bevezetésének miR-202-3p rákos sejtek hasznos lehet késlelteti a folyamat a tumorigenezis.

miRNS génexpressziót keresztül alulszabályozott fordítását cél-mRNS vagy up-szabályozott lebomlását target mRNS-ek [3], [37]. Alapján bioinformatikai algoritmusok azonosítjuk Gli1 mint lehetséges közvetlen cél gén miR-202-3p. Gli1, tagja Gli család, eredetileg azonosították amplifikált gén malignus glioma [38]. Ez egy erős pozitív aktivátor a downstream célgének és önmagában is egy transzkripciós célt Shh jelátviteli [39], és ez is túlszabályozott a RAS /PKC [40], TGFp [41] és a PI3K jelző [42], és downregulált PKA [42] és a p53 jelátvitel [43]. Gli1 expresszió hámsejtek indukálhat sejt transzformáció jellemzi fokozott proliferáció és rögzítéstől független proliferáció [35], [44]. Egyre több tanulmány azt mutatja, hogy Gli1 túlexpresszálódik különféle rákok, beleértve a gyomorrákot [32], [33], [45], és az expressziós szintek Gli1 pozitívan korrelál a tumor differenciálódásának [33]. Csökkenő expressziója Gli1 által ciklopamin vagy siRNS eredményezett GC sejtnövekedés-gátlás és apoptózis [33]. Mi inkább megerősítik Gli1 közvetlen cél a miR-202-3p, azt találtuk, hogy a miR-202-3p befoglaló hiányos komplementaritás Gli1 3'UTR, és túlzott mértékű miR-202-3p leszabályozza Gli1 fehérje szinten. Ezen túlmenően, a statisztikai analízis szignifikáns fordított minták expresszió között miR-202-3p és Gli1 GC szövetekben és sejtvonalakban. γ-catenin (Plakoglobin) és Bcl-2, a közvetlen transzkripciós célpontjai Gli1, jelentették, hogy gátolják az apoptózist a GC. A kifejezés a Gli1 downstream target gének y-catenin (Plakoglobin) és a BCL-2 [34], [35] a jelentősen csökken, ha a miR-202-3p overexpresszálódik GC sejtekben. Ez azt sugallja, hogy a növekedés gátlása a GC-sejtek által indukált miR-202-3p esetleg részben kapcsolódnak az elnyomása a γ-catenin és Bcl-2-expresszió, ezeket viszont közvetlen kölcsönhatás Gli1. Fontos megjegyezni, hogy túltermelése Gli1 megmenti a sejtnövekedést és a sejtek gátlása által indukált apoptózis miR-202-3p, ami további jele, hogy Gli1 közvetlen célpontja a miR-202-3p és arra utal, lényeges szerepet Gli1 mint közvetítő a biológiai hatásainak miR-202-3p GC. katalógusa

Összefoglalva, a miR-202-3p gyakran csökken a humán gyomorrák. Restaurálása miR-202-3p gátolja GC szaporodáshoz legalább részben indukáló sejt apoptózis közvetlen interakció Gli1 (7.). A feladatok a miR-202-3p GC sugallják potenciális terápiás mikroRNS gyomorrák kezelésére, amely érdemes a további kutatásokat. Katalógusa

alátámasztó információk katalógusa ábra S1.

• PLoS One: prognosztikus Survivin a gyomorrákos betegeknél: rendszeres felülvizsgálatát és meta-analízis
• PLoS One: csökkent expressziója AZGP1 társul rossz prognózissal Elsődleges gyomorkarcinóma