Plos ONE: Zmanjšanje miR-202-3p izražanja, ki je roman zaviralnih, želodčnega raka

Povzetek

nastajajoče študije so pokazale, da so microRNAs vključeni v razvoj in napredovanje raka. Tu smo ugotovili, da je bil miR-202-3p pogosto navzdol urejeno v želodcu tkivih raka. Čezmernim miR-202-3p v želodcu rakavih celic MKN-28 in BGC-823, izrazito zatreti celične proliferacije in inducirane celične apoptoze tako in vitro
in in vivo
. Poleg tega je bila Gli1 izraz pogosto pozitivna pri želodčnih tkivih raka in obratno povezana z miR-133b izražanja. Želimo pokazati, da je transkripcijski faktor Gli1 tarča pokoj-202-3p in igra pomembno vlogo kot posrednik bioloških učinkov pokoj-202-3p pri bolnikih z rakom želodca. MIR-202-3p ovira tudi izraz y-catenin in BCL-2. V celoti gledano, te ugotovitve kažejo, da lahko miR-202-3p deluje kot nova zaviralnih raka želodca in njeno anti-tumor dejavnosti lahko pripišejo neposredno ciljanje in inhibicijo Gli1

Citation. Zhao Y, Li C Wang M Su L, Qu Y Li J, et al. (2013) Zmanjšanje miR-202-3p izražanja, romana zaviralnih, želodčnega raka. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10,1371 /journal.pone.0069756

Urednik: William C. S. Cho, Elizabeth Hospital Queen, Hong Kong

Prejeto: 28. februar 2013; Sprejeto: 11. junij, 2013; Objavljeno: 25. julij 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprta s sredstvi iz državnega Natural Science Foundation Kitajske (št. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 in 81272749), znanost in tehnologijo komisije občine Shanghai (št. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 in 12PJ1406300), ključni projekti v National znanost in tehnologijo steber programa Kitajske (št 2011BA203191), raziskovalni sklad za doktorski program za visoko šolstvo Kitajske (št 20110073110071), Key Projekt Shanghai odbora za izobraževanje (št. 12ZZ102, 12ZZ105) in fundacija za inovacije za PhD Diplomanti Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je ena izmed najpogostejših malignih obolenj in drugi najpogostejši vzroki raka povezanih smrti po vsem svetu [1]. Čeprav je napredek v zdravljenju, je stopnja preživetja bolnikov z GC je žalostno, da je to predvsem zaradi majhnega obsega posebnih terapevtskih ciljev. Zato je ključnega pomena, da se opredelijo molekularne mehanizme, ki podpirajo razvoj raka želodca.

MicroRNAs (miRNAs) so razred majhnih (18-25 nukleotidov), nekodirano, enojnoverižne endogenih RNA. So zatreti izražanje proteinov z učinkovanjem z odlično ali nepopolnih komplementarnih sekvenc, ki se nahajajo v 3'untranslated regijah (3'UTRs) ciljnih genov. Raziskave v zadnjih letih so pokazale, da dysregulated miRNAs igrajo pomembno vlogo pri različnih rakavih obolenj [1] - [4], vključno z GC [5] - [13]. Podatki iz študije o miRNAs in njihove ciljne geni lahko zagotovijo zanimive terapevtske možnosti [3].

Pred kratkim smo prepoznali več miRNAs dereguliranih v GC, kot downregulation Mir-126 [14], miR-409-3p [15], miR-625 [16], in Povecanje miR-21 [17], miR-301A [18]. Čeprav so mnogi miRNAs so bile ugotovljene povezujejo z GC, mehanizem teh miRNAs v želodcu tumorigeneze treba še raziskati. V prejšnjem delu, so bile ugotovljene številne domnevnih miRNAs, ki so pokazali diferencialno izražanje med GC tkiv in njihovih sosednjih non-tumorskih tkiv 28 bolnikov [19]. Med njimi je bil miR-202-3p eden izmed najbolj znatno zmanjšala miRNAs. Vendar pa je vloga pokoj-202-3p v GC redko raziskana.

MIR-202-3p, prejšnji imenovan HSA-miR-202, ki se nahaja v kromosomsko občutljivem mestu v 10q26. Izbris krhkega mestu je bila povezana s endometrij [20], možganskih tumorjev [21], [22]. MIR-202 so poročali, da je treba deregulirati pri raku dojke [23], [24], materničnega vratu skvamoznih celic [25], kolorektalnega raka [26] in folikularni limfom [27]. Petrocca sod. ugotovljeno, da je miR-202 navzdol urejeno v kronični gastritis [28]. MIR-202 Dokazano je, da se s 4-hydroxynoneal (HNE) navzdol urejeno v HL-60 levkemije celic [29]. Nedavna študija je tudi pokazala, da miR-202 neposredno namenjen proto-onkogena MYCN, zaradi inhibicije nevroblastoma celične proliferacije [30].

Tukaj smo pokazati, na splošno zmanjšanje miR-202-3p ravni izražanja v 150 GC tkiva v primerjavi z ne-tumorskih tkivih in ugotovili, da so miR-202-3p koncentracije povezane z velikostjo tumorja in bolnikih, starih. Poleg tega smo ugotovili, prvič, da bi miR-202-3p zavirajo rast in inducira apoptozo GC celic tako in vitro
in in vivo
neposredno ciljanje transkripcijski faktor Gli1 in inhibira izražanje Gli1 ciljnih genov γ-catenin in BCL-2.

Etika Izjava materiale in metode

Pisna privolitev je bilo pridobljeno od vseh udeležencev. Študija je odobril Odbor za etiko človeškega raziskovalnega Bolnišnica Ruijin, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), odbor za laboratorijske živali etiko bolnišnice Ruijin (LAEC 11-062). Postopki na živalih so bile izvedene v skladu s protokolom, ki ga Odbor za institucionalne živali Nega in uporabo (IACUC), odobrenega na Shanghai Jiao Tong University, Šanghaj, Kitajska.

Cell Culture

celične linije Human GC SGC -7901 in BGC-823 so bile kupljene od Shanghai inštituti za biološke vede, kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska). MKN-45 in MKN-28 celične linije so bili pridobljeni iz japonske Cancer Research virov banke (Tokio, Japonska). NCI-N87, AGS, KATO III in snu-1 celične linije so bile prvotno kupljene od American Type Culture Collection (Manassas, VA, ZDA). Človeških embrionalnih ledvic celična linija 293T (HEK-293T) se je ohranila v našem zavodu. Celice so bile shranjene, izterja od kriogensko v tekočem dušiku pri zgodnjih prehodov. Vse celice smo vzdrževali v RPMI-1640 medij plus 10% fetalni goveji serum (FBS) in gojimo v 5% CO2 navlaženi atmosferi. Eksponentno so bili uporabljeni rastoče celice za poskuse.

Robčki bolnikov

Primarni GC tkiva in se ujema non-tumor tkiva so bili pridobljeni od 150 bolnikov GC poteka radikalna želodca na oddelku za kirurgijo, Ruijin bolnišnica, šola Medicinska, Shanghai Jiao Tong University. Vzorci so bili snap zmrznjene neposredno po operaciji. Vsi vzorci so bili potrjeni s strani neodvisnih patološkim pregledom. Nobeden od bolnikov je prejelo preoperativno zdravljenje. Pri vseh bolnikih, je bilo na voljo clinicopathological informacije. Klasifikacija tumor v skladu z mednarodnim Union proti raku (2009).

RNA Isolation in Quantitative Real-time PCR (QRT-PCR)

Total RNA je bila vzeta iz celičnih in tkivnih vzorcev z uporabo TRIzola reagent (Invitrogen, Carlsbad, ZDA) po navodilih proizvajalca. Koncentracije in čistost vzorcev RNA smo izmerili s pomočjo elektroforeze in spektrofotometričnih metodah. Stopnje izraženosti Mir-202-3p in U6 majhno jedrsko RNA (RNU6B) smo testirali v treh izvodih z metodo izvornih loop RT-PCR z uporabo Ostra-it ™ miRNAs qPCR kvantifikacije Kit (GenePharma, Šanghaj, Kitajska) s posebnimi primerji formiR-202-3p in U6 majhna jedrska RNA (RNU6B). Relativna miRNA izraz pokoj-202-3p je normaliziral proti endogenim nadzor, U6, metodi DDCt. Ravni mRNA za Gli1 in GAPDH smo izmerili v treh izvodih z SYBR Green PCR v realnem času (Applied Biosystems, ZDA) naslednje navodilih proizvajalca. Količinska bilo izvedeno z uporabo DDCt relativno metodo kvantifikacije s humano GAPDH kot notranji nadzor. Uporabljeni so bili naslednji primerji: Gli1 (občutek: 5'-GGA AGT CAT ACT CAC GCC TCG A-3 '; protismiselna: 5'-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3 ") [31] in GAPDH (občutek: 5'-GGA SCT GAC CTG CCG TCT AG-3 '; protismiselna: 5'-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3 ".)

prehodna Transfekcija miRNA Posnema

MiR- 202-3p posnema (dsRNA oligonukleotidi) in negativne kontrole mimics1 (NC) (občutek: 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ', protismiselni: 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'), ki so bile kupljene od GenePharma (Shanghai, Kitajska). Celice smo zasejali v 6 vdolbinami dan pred transfekcijo zagotoviti 40% celic strnjene v trenutku transfekciji. Transfekciji Mirna posnema v celice je bila izvedena z Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) po postopku proizvajalca. Mirne posnema so bile uporabljene v končni koncentraciji 100 nM.

Cell orožja Vsebnost

V 24 urah po transfekciji z miRNA posnema, celice (2 x 10 ^{3 celic /vdolbinico ) smo zasejali v 96-vdolbinami in inkubirali 72 ur. Cell orožja je bila ocenjena v treh izvodih, ki jih vodotopni tetrazolijevega soli (WST) preizkus s pomočjo mobilnega Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonska) in izmerjena po navodilih proizvajalca.}

Mehka Agar Colony Formation Vsebnost

Mirna posnema transficirane celice smo resuspendirali z 0,3% mehko agaroze (A9045, nizke temperature želirnim, Sigma-Aldrich, ZDA) v RPMI 1640, ki vsebuje 10% FBS in večplastna na 0,4% v RPMI 1640 strjen agar, ki vsebuje 10% FBS v 6-jamicami (1 × 10 ^{3 celic /vdolbinico) v 24 urah po letu transfekciji. Plošče inkubiramo za 2 tedna. Kolonije, ki vsebujejo vsaj 50 celice preštejemo.}

apoptoza Analiza

En dan pred transfekcijo s miRNA posnema, 1 x 10 ^{6 Celice smo zasejali v 6 vdolbinami. Oseminštirideset ur po transfekciji celice požanjemo in obarvajo z AnnexinV /PI dvojni kit obarvanje (BD bioznanosti, ZDA) po protokolu proizvajalca. Apoptotske celice so ocenili v treh izvodih in ponovi trikrat neodvisno s pretočno citometrijo na FACSCAN (Beckman Instruments, Fullerton, CA, ZDA).}

retrovirusni Transfekcija za stabilne celične linije

Genomska regija, ki je vključeval primarni prepis pokoj-202-3p smo klonirali v mesto EcoRI-Xhol spremenjenega pMSCV-GW-rFA-PGK-EGFP retrovirusni vektor. Negativne vektorji nadzor ni imel vložek. HEK 293T celice (1 x 10 ^{6 /jamico) smo posejali v 6 vdolbinami dan pred transfekcijo. Deset ug za retrovirusni konstrukt, ki vsebuje bodisi miR-202-3p ali ni vložek, je bilo 2 ug od gag /pol in 2 ug od VSVG co-transfektirali v HEK 293T celic z uporabo Lipofectamine ™ 2000 reagent in Opti-MEM I serumu medij zmanjša v vsaki plošča. Virusi so bile pridelane na 48 ur in 72 h post-transfekciji po virusni zbirka srednje (RPMI-1640 z 10% toplotno inaktiviran FBS + 1% Glutamin 20 mM Hepes-om). Okužbe MKN-28 celice so bile izvedene v prisotnosti 8 ug /ml za polybrene v vsako vdolbino 6 vdolbinami. Celice so bile spin okuženih pri 1500 obratih na minuto za 30 minut pri sobni temperaturi. Supernatant, ki vsebuje virus, smo odstranili po 2 urah. Pozitivne celice za GFP izražanja izbere FACS razvrščanjem in imenovan RV-MIR-202-3p in RV-MIR-nadzor oz. MIR-202-3p izraz je potrdil QRT-PCR.}

Tumor Rast golih miših

Moški BALB /c nu /nu miši, v starosti šestih tednov (Inštitut za zoologijo kitajske akademije znanosti), so bili nastanjeni v specifičnih povzročiteljev bolezni brez okolja v enoti za živali Laboratory, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kitajska. Miši prejel humano nego in študijski protokoli so bile izvedene v skladu s protokolom, ki ga Odbor za institucionalne živali Nega in uporabo (IACUC), odobrenega na Shanghai Jiao Tong University, Šanghaj, Kitajska. Celice (100 ml, 2 x 10 ^{6 celic) iz stabilnih transfekciji linij RV-miR-202-3p ali RV-miR-control bili zbrani in podkožno, cepljenih v miši. Šest miši smo uporabili za vsako skupino. Miši tedensko preverja, in tumor grude so bile izmerjene s šestilom. Volumen tumorja (V), je bila ocenjena s pomočjo enačbe V = 4 /3π x L /2 x (W /2) 2, kjer je L dolžina sredi osi, in W je srednja os width.The tumorske celice so bile pustimo rasti 5 tednih in krivulje rasti tumorja in Izračunali smo neomejenih cene. Potem ko so žrtvovali miši, so izrezali vse tumor cepljenke, stehtajo, pridelane, fiksne in vgrajene. Vsak poskus smo izvedli dvakrat.}

TUNEL Analiza

terminal nucleotidyl-transferaza nick konec označevanje test (TUNEL) je bila izvedena po navodilih proizvajalca v kompletu Konca slepe ™ Kolorimetrijska TUNEL sistema (Promega, ZDA). Tkiva so bile določene v 10% nevtralizirana formalina in vgrajeni v parafin blokih. Oddelki (4 pm) smo nato pripravili za pregled. Po deparaffinization so bili odseki obdelamo z 20 g /ml proteinaze K 10 minut, z 0,3% H _{2O 2 v metanolu za 10 minut in 0,1% Triton X-100 v 0,1% natrijevega citrata za 2 min na ledu. Nato so bili odseki inkubirali s TUNEL reakcijske zmesi 60 minut pri 37 ° C. Nadaljnja inkubacija s peroksidazo konjugiranih protitelesa smo izvedli v 30 minutah pri 37 ° C. Oddelki smo obarvali z raztopino diaminobenzidine 10 minut pri sobni temperaturi, nato pa jih nasprotno s hematoksilinom.}

Imunohistokemija

oddelki (6 mm) iz formalinom določen,-parafinski vgrajeni tumorja specimenswere deparaffinized pri ksilen in rehidrirane v stopenjski alkohola. Endogene peroksidaze bil blokiran s pomočjo 3% H _{2o 2 za 10 min. Po pridobivanje antigena v citratnem pufru (pH 6,0), so odseki tkiva inkubirana z običajnim kozjim serumom blokirati nespecifično protitelesa vezavo (20 min pri sobni temperaturi). Odseki smo nato inkubirali s protitelesi Gli1 (1:50, sc-20.687, Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA) pri 37 ° C v humidchambers za 2 uri. Po spiranju s PBS trikrat, so odseki inkubirali s peroksidazo konjugiranih anti-kunčjega IgG 1 uro pri sobni temperaturi. Naslednji so bili drsi spere s PBS in inkubiramo 5 min s DAB podlago za manj kot 30 minut. Hematoksilinom je bila uporabljena za counterstaining.}

konstruiranje plazmidov in luciferazno aktivnost Vsebnost

203-bp Celotna dolžina divjega tipa (WT) Gli1-3'UTR ali mutant Gli1-3 " UTR (mut), ki vsebuje domnevne miR-202-3p vezavno mesto sintetiziramo (Sangon, Šanghaj, Kitajska). Po prebavo, ki ga Spel in HindIII, so fragmenti divjega tipa in mutant Gli1-3'UTR klonirali v mestih Spel in Hindlll za pMIR-Report luciferaza vektorja (Applied Biosystems) in ga poimenovali pMIR /Gli1 in pMIR /Gli1 /mut, oz. DNA sekvencioniranje smo uporabili za preverjanje konstrukte.

HEK-293T celice smo zasejali v 24-vdolbinami 24 ur pred učinkovitosti metod. V vsako vdolbino, 100 ng pMIR /Gli1 ali pMIR /Gli1 /Mut, 2 ng PRL-TK (Promega, Madison, WI, ZDA), ki vsebuje Renilla luciferaze in 100 nm miRNA posnema so kotransfektiramo uporabo Lipofectamine ™ 2000 reagent in Opti-Memi zmanjša seruma medij. Relativna luciferazno aktivnost je bila izračunana 48 ur po kotransfekcijo uporabo Dual-Glo luciferazni test (Promega, ZDA) v skladu s postopkom proizvajalca. Firefly luciferazno aktivnost je bila preračunana na Renilla luciferazne aktivnosti.

Western Blot Analiza

celice in tumor smo lizirali z uporabo M-per reagenti in zaustaviti inhibitor proteaze Cocktail kompleti (Pierce, ZDA). Koncentracija beljakovin v lizatov celic smo kvantificirali z uporabo BCA Protein testu Kit (Pierce, ZDA). Protein smo ločili s SDS poliakrilamidno gelsko elektroforezo in opral na 0,22-mikrometrskimi poliviniliden ditluoridne membrane (Millipore, MA, ZDA). Uporabljene so bile naslednje specifična protitelesa: Gli1 (1:1000, celična signalizacija Technology), γ-catenin (1:2000, BD Biosciences, ZDA), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, ZDA), in GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). vsebnosti beljakovin smo normalizirali na skupno GAPDH

Gradnja Gli1 Expression plazmida in transfekciji

Z okrepitvijo cDNA za MKN-28 z uporabo naslednjih primerjev:. pomenu (5'AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 ') in protismiselno (5'ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3'), celovečerni Gli1 bilo pridobljeno, prebavi EcoR v in ne jaz in klonirali v pcDNA3.1 vektor (Invitrogen) in imenovan pcDNA3 0,1-Gli1. DNA sekvencioniranje smo uporabili za preverjanje konstrukte.

Celice smo zasejali v 6 vdolbinami dan pred transfekcijo zagotoviti 80-90% celic strnjene v trenutku transfekciji. V vsako jamico smo celice transfektirali s 250 pmol z miR-202-3p posnema ali kontrolo, skupaj s 4 ug pcDNA3.1-Gli1 ali pcDNA3.1 nov vektor, s pomočjo Lipofectamine 2000. WST test je bil izveden pri 24 urah po transfekciji, medtem ko je analiza apoptoza izvedena na 48 h post-transfekciji.

Statistična analiza

zveznih spremenljivk smo primerjali z uporabo t
preizkus študent za normalno porazdeljene spremenljivke in Wilcoxonov rang test znesek za nonnormally porazdeljene spremenljivke. Razmerje med MIR-202-3p stopnjah izražanja in clinicopathologic parametrov smo analizirali z uporabo Pearson Chi-kvadrat test. Vse vrednosti so prikazane kot sredstvo ± SDS. Vse statistične analize smo izvedli s pomočjo PASW Statistika 18,0 programske opreme (IBM, ZDA). Dve zimsko vrednost P
. ≪ 0.05 smo imeli statistično značilno

Rezultati

Izraz miR-202-3p je zmanjšana v GC in je povezana s Clinicopathologic parametri

Prijave miR-202-3p so bile pregledane s QRT-PCR v tumorskih tkivih in izravnanih ne-tumorskih tkiv 150 bolnikov GC (sl. 1A). Rezultati kažejo, da je bila ekspresija miR-202-3p močno navzdol reguliranih v tumorskih tkiv v primerjavi z izravnanih non-tumorskih tkiv v 68% (102/150) bolnikov GC. (P; 0,001;. Slika 1A, B)

Za dodatno pojasnitev povezavo med stopnjo ekspresije miR-202-3p in clinicopathologic dejavnikov v človeškem GC, so 150 primerov dodatno analizirali (tabela 1). Na podlagi relativnega miR-202-3p izražanja, je bilo 150 primerov, stratifikacija v 3 skupine: miR-202-3p nizko izraz (tumor /non-tumor razmerja < 0,66, n = 85), MIR-202-3p zmerno izražanja (tumor /non-tumor razmerje 0,66-1,5, n = 34) in miR-202-3p visoka ekspresija (tumorja /non-tumor razmerje > 1,5, n = 31). MIR-202-3p stopnje izraženosti so bili negativni korelaciji z velikostjo tumorja in v pozitivni korelaciji s starostjo pri teh bolnikih z miR-202-3p nizko izraz skupine razstavljena bistveno večja velikost tumorja (p = 0,013) in starejši starosti v primerjavi z zmerno ali visoke izraz skupine (p = 0,028). Vendar miR-202-3p ravni izraz ni pokazal odnos s spolom, diferenciacija, lokacija tumorja, tumorja lokalne invazije, bezgavkah metastaze ali fazi TNM.

Čezmerno pokoj-202-3p Zavira GC Cell orožja

Glede na to, da je miR-202-3p bistveno zmanjšal v GC, lahko deluje kot zaviralnih. Zato smo pregledali, ali prekomerno miR-202-3p v GC celicah vpliva na rast celic. MKN-28 in BGC-823 celične linije, katerih izraz miR-202-3p bila najnižja v osmih testiranih GC celičnih linijah (sl. 1C), so bili izbrani za nadaljnje expreiments. Sintetični miR-202-3p posnema in negativni kontrolni shematični molekule (NC) smo transfektirali v MKN-28 in BGC-823 celic oz. Ektopična izraz pokoj-202-3p v celicah, je potrdil QRT-PCR.

test Celica-rast WST pokazala pomembne inhibicije rasti celic v 28 podjetja MKN celicah transfekciji z miR-202-3p (sl. 2.A). Podobni rezultati so bili v BGC-823 celic (sl. 2.b) opazili. Za nadaljnjo opredelitev učinek MIR-202-3p na rast celic, smo izvedli mehki agar nastanek kolonij testa v transfekciji celic. Ugotovili smo, da je bilo število kolonij od 28 podjetja MKN celice transficirane z miR-202-3p posnema skoraj polovico ki iz kontrole in starševske skupine (sl. 2C). Podobni rezultati so bili v BGC-823 celic (sl. 2.d) opazili. Ti rezultati kažejo, da lahko miR-202-3p zavirajo proliferacijo celic GC celic in vitro
.

Čezmerno miR-202-3p inducira GC celice apoptoza

Ker je zaviranja rasti lahko zapade do blokiranih napredovanju celičnega ciklusa ali povečano apoptozo, smo poleg merodajen celično deljenje testa cikla in apoptozo s citometrije toka. Naši podatki kažejo, da so bili apoptoze stopnje obeh celic MKN-28 in BGC-823 transfekciji z miR-202-3p posnema bistveno molekul (sl. 3A, B). Vendar pa ni bilo bistvene razlike v celičnem ciklusu med različno tretiranih skupinah (podatki ne kažejo). Ti rezultati so pokazali, da prekomerno miR-202-3p inducira apoptozo v GC celic lahko prispeva k rasti inhibitornih lastnosti pokoj-202-3p.

Čezmerno pokoj-202-3p Zavira tumorogenosti in poveča apoptozo vivo

Glede na to, da miR-202-3p zavira rast GC celic in inducira apoptozo in vitro
, smo poleg preučila, ali bi miR-202-3p zavirajo rast tumorjev in povzroči apoptoza in vivo
. Celice MKN-28 RV-pokoj-202-3p (28 MKN-celice z retrovirusa posredovano miR-202-3p stabilna izraz) (28 podjetja MKN celic s praznim vektorjem) ali RV-miR nadzora smo dobili, kot je opisano v material in metode. Celice smo podkožno injicirali v golih miših. nastanek tumorja smo spremljali. Čas tumor latence pokazala pomembne razlike med miših vbrizgali RV-miR-NC celic in RV-miR-202-3p celic (sl. 4a). To je bistvenega pomena, da tumorji, ki izhajajo iz RV-miR-202-3p celic rasla precej počasneje kot RV-miR-kontrolni skupini ves čas rasti tumorja (sl. 4B). Povprečna teža tumorjev, ki so posledica RV-miR-202-3p je bistveno manjša od tumorjev, ki izhajajo iz RV-miR-kontrolo (sl. 4C D).

Poleg tega smo opravili tunel teste tumorskih tkiv. Kot je prikazano na sliki. 5E, da RV-miR-202-3p celice pokazala več tumorskih celic pozitivno barvanje in bistveno višjo apoptotske indeks od RV-miR-kontrolnih celic ( P
< 0,01). Ti rezultati kažejo, da je miR-202-3p zaviranje tumorjev pripisati povečano apoptozo in vivo
.

MIR-202-3p usmerjena neposredno Gli1

Da bi razumeli mehanizem temeljita-tumorske zavira delovanje mir-202-3p v GC, smo iskali njegovih domnevnih ciljnih genov s potencialnimi pro-onkogenih funkcij s spletnimi iskalniki (RNAhybrid in Miranda algoritmov), in geni, ki jih obe genske orodij Napovedane so bile izbrani so ciljne kandidat genov pokoj-202-3p. Med več sto kandidatnih genih napovedanih, prepisa aktivator Gli1 je posebnega pomena (slika S1). Domnevni sekundarna struktura RNA hibrida za prehrano miR-202-3p in Gli1 je prikazano na sliki S2. Gli1 so poročali zelo izražene v GC [32], [33]. Predlagala je, da zmanjšuje izražanje Gli1 povzročila inhibicijo rasti celične linije GC in apoptoze [33].

Še en namig o potencialni vlogi pokoj-202-3p pri ureditvi Gli1 izraza prišel iz analize osem različnih želodca linije rakava celica (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, snu-1, KATO III, BGC-823 in MKN-28). Statistična analiza je pokazala pomembno obrnjeni vzorce izražanja med miR-202-3p in Gli1 ((r = -0,345, P
<.. 0,001, slika 5A)

Za oceno kliničnega pomena teh ugotovitev, smo proučevali povezavo med prijavo Gli1 z miR-202-3p izražanja v GC tkivih. Ugotovili smo, da Gli1 in miR-202-3p kažejo inverzna izraz vzorec v GC tkivih (tabela 2). Ti rezultati podpirajo predpostavka, da downregulation miR-202-3p poveča raven Gli1 gena raka želodca.

luciferazno reporter analize so bile izvedene, da se preveri neposredno interakcijo med miR-202-3p in 3'UTR Gli1. luciferaza novinarji so bili zgrajeni, ki vsebuje bodisi divjega tipa Gli1 3'UTR sekvenco, ki vsebuje mIR-202-3p vezavno mesto (pMIR /Gli1), ali mutirani Gli1 3'UTR (pMIR /Gli1 /Mut) (sl. 5b). pMIR /Gli1 in pMIR /Gli1 /mut luciferaza reporter konstrukta transfektiramo v HEK-293T celic, skupaj z MIR-202-3p ali NC posnema. relativno luciferazno aktivnost novinar v pMIR /Gli1 je izrazito preprečena primerjali z pMIR /Gli1 /mut v miR-202-3p odvisni način (sl. 5C). Ta rezultat močno kaže, da 3'UTR Gli1 nosi neposredne vezavna mesta Mir-202-3p.

Da bi ugotovili, na ravni mRNA ali raven beljakovin pokoj-202-3p navzdol urejeno Gli1, smo zaznali Gli1 izraz s QRT-PCR in Western blot. Kot je prikazano na sliki. 5E, je bila stopnja Gli1 protein zmanjšala miR-202-3p posnema-transfektirane MKN-28 celice v primerjavi z NC posnema-transfektirali in starševski MKN-28 celice. Medtem pa ni bilo nobenega vpliva miR-202-3p na ravni Gli1 mRNA (sl. 5D). Ti rezultati nakazujejo, da miR-202-3p negativno ureja Gli1 izraz na translacijskih ravni.

Med genov, o katerih so poročali, da zavira apoptozo GC, γ-catenin (Plakoglobin) in BCL-2 so neposredna transkripcijske cilji od Gli1 [34], [35]. Kot je prikazano na sliki. 5E, raven beljakovin v y-catenin in BCL-2 so se izrazito zmanjšala v 28 podjetja MKN celicah transfekciji z miR-202-3p posnema.

Poleg tega smo preučili izražanje Gli1 beljakovin v podkožnih tumorjev, ki izhajajo od RV-miR kontrolo in RV-pokoj-202-3p v golih miših po zahodni blot analizo. Stopnja Gli1 beljakovin v tumorjih z RV-pokoj-202-3p dokazali downregulation v primerjavi s tisto v RV-pokoj-nadzor (sl. 5F). Ti rezultati nakazujejo, da miR-202-3p negativno ureja Gli1 izraz post-transkripcijsko.

Čezmerno Gli1 reši Učinek pokoj-202-3p v GC Celice

Ker pokoj-202-3p navzdol reguliranih Gli1 da inhibira celično proliferacijo in inducira apoptozo, je menil, da čezmernim Gli1 lahko vsaj obrniti ta pojav deloma. Dejansko, ko Gli1 čezmerno izraženim plazmida (pcDNA3.1-Gli1) je bila uvedena v celice podjetja MKN-28 ali BGC-823 prehodno transfekciji z miR-202-3p posnema, se je delno spremenilo, zaviralni učinek miR-202-3p na celično rast, ki smo opazovali z WST testom rast celic (sl. 6A, B). Poleg tega so ovirale napredovanje proti apoptoze tudi takrat, ko je bil Gli1 prekomerno v MKN-28 ali BGC-823 celic prehodno transficirane z miR-202-3p posnema (Sl. 6C, D) .Ti podatki dokažejo, da zaviranje rasti in celično apoptozo inducira miR-202-3p je vsaj delno povezana z njegovim učinkom na Gli1 izražanja.

Pogovor

kopičijo dokazi so pokazali frakcijo posebne miRNA v GC [4], [13] [36 ]. MIR-202-3p, ki se nahaja v 10q26, so poročali, da se disregulated pri raku dojke [23], [24], kolorektalnega raka [26] in folikularni limfom [27]. Petrocca sod. ugotovljeno, da je miR-202 navzdol urejeno v kronični gastritis [28]. Vendar pa je vloga pokoj-202-3p razvoj GC in napredovanja, je še vedno unkown. V tej študiji smo ugotovili, da je miR-202-3p izraz 68% karcinoma želodca vzorcih bistveno nižje kot pri izravnanih normalnih tkiv, kar kaže, da je zmanjšana miR-202-3p izraz pogost dogodek v GC. Pomembno je, da se raven miR-202-3p negativni korelaciji z velikostjo tumorja GC pri bolnikih. Ti rezultati kažejo zaviralne vloge pokoj-202-3p v razvoj in napredovanje GC.

Glede miR-202 je navzdol urejeno v želodčnih tkivih raka, smo razmišljal, da bi prekomerno miR-202 zatreti maligni fenotipi želodčnih rakavih celic. V tej raziskavi smo pokazali, da obnova pokoj-202-3p v MKN-28 in BGC-823 celic močno zavira celično proliferacijo in inducira apoptozo tako in vitro
in in vivo
. Ti rezultati jasno pokazali, da bi morala biti zmanjšala miR-202-3p izraz v GC dejavnik, ki prispeva k razvoju, namesto da so prizadete zaradi GC. Zato je pomembno zaviranje tumorskih presadkov v golih miših kažejo, da so lahko terapevtske strategije uvajanja MIR-202-3p v rakavih celicah koristno za zadrževanje procesa tumorigeneze.

MiRNAs lahko regulira gensko ekspresijo skozi navzdol urejeno prevod ciljni mRNA ali do urejene degradacije ciljnih mRNA [3], [37]. Na podlagi genske algoritmov, prepoznamo Gli1 kot možen neposredni ciljnega gena pokoj-202-3p. Gli1, član Gli družine, je bila prvotno opredeljena kot ojačeno gena v malignega glioma [38]. To je močna pozitivna aktivator nadaljnjim ciljnih genov in je sama po sebi transkripcijski cilj Pst signalizacijo [39], in se lahko poveca tudi RAS /PKC [40], TGFβ [41] in PI3K [42] signalizacijo in navzdol reguliranih s PKA [42] in p53 signalizacijo [43]. Gli1 izraz v epitelijskih celic lahko povzroči transformacijo celic značilna povečana jedrskega orožja in pritrditve neodvisen orožja [35], [44]. Vedno več raziskav kaže, da je Gli1 izraženi pri različnimi vrstami raka, vključno z rakom želodca [32], [33], [45], in stopnje izraženosti v Gli1 so pozitivni korelaciji z diferenciacijo tumorja [33]. Zmanjševanje izraz Gli1 s cyclopamine ali siRNA povzročilo inhibicijo celične rasti GC in apoptoze [33]. Dodatno smo preverili Gli1 kot neposredni cilj pokoj-202-3p, smo ugotovili, da miR-202-3p mejni nepopolne dopolnjevanje do Gli1 3'UTR in prekomerno pokoj-202-3p navzdol ureja Gli1 na ravni beljakovin. Poleg tega je statistična analiza pokazala veliko obrnjeni vzorce izražanja med pokoj-202-3p in Gli1 v GC tkiv in celičnih linij. γ-catenin (Plakoglobin) in BCL-2, neposredne transkripcijske tarče Gli1, so poročali, da zavira apoptozo GC. Izraz Gli1 dolvodno ciljnih genov y-catenin (Plakoglobin) in BCL-2 [34], [35] sta znatno zmanjša, če se miR-202-3p prekomerno v GC celicah. To kaže, da bi zaviranje rasti GC celic z miR-202-3p induciranih delno povezana z njegovo zatiranje na y-catenin in BCL-2 ekspresije, ki so bili nato z neposredno povezavo s Gli1. Pomembno je, čezmernim Gli1 reši mobilnega zaviranja rasti in apoptozo celic s pokoj-202-3p inducirano, kar še dodatno dokazuje, da je Gli1 neposreden cilj pokoj-202-3p in kaže ključno vlogo pri Gli1 kot posrednik bioloških učinkov miR-202-3p v GC.

Če povzamemo, je miR-202-3p v človeškega raka želodca pogosto zmanjšala. Obnova pokoj-202-3p zavira GC širjenja vsaj delno skozi inducira apoptozo celic, ki jih neposredno povezavo z Gli1 (sl. 7). Takšne vloge pokoj-202-3p v GC kažejo svoj potencial kot terapevtsko microRNA za zdravljenje raka želodca, ki je vredno nadaljnje raziskave.

dodatne informacije
sliki S1.

• Plos ONE: prognostični Vrednost survivin pri bolnikih z želodčnim rakom: sistematični pregled z Meta-Analysis
• Plos ONE: Zmanjšan Izražanje AZGP1 je povezana s slabo prognozo v osnovni želodca Cancer