PLoS ONE: Smanjenje Mir-202-3p izražavanja, roman supresor tumora, u želučanom Cancer

Sažetak pregled

Nove studije su pokazala da su mikroRNA uključene u razvoj i progresiju raka. Ovdje smo otkrili da Mir-202-3p je često dolje regulirano u želučanim tkiva raka. Prekomjerna ekspresija Mir-202-3p u želučanih stanica raka MKN-28 i BGC-823, znatno potisnute proliferacije stanica i inducirane stanične apoptoze i In vitro pregled i in vivo pregled. Nadalje, Gli1 izraz lica bio je često pozitivan u želučanom tkivu raka i obrnuto povezana s Mir-133B izražavanja. Mi pokazuju da je transkripcijski faktor Gli1 bio meta Mir-202-3p i ima važnu ulogu kao posrednik bioloških učinaka Mir-202-3p u raka želuca. Mir-202-3p također inhibirao ekspresiju y-katenina i bcl-2. Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da je Mir-202-3p može funkcionirati kao novi tumor supresor u rak želuca i njegovo djelovanje protiv tumora može pripisati direktan ciljanje i inhibiciju Gli1

Citation. Zhao Y, Li C, Wang M, Su L, Qu Y, Li J et al. (2013) Smanjenje Mir-202-3p izražavanja, roman tumor supresor u rak želuca. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10,1371 /journal.pone.0069756 pregled

Urednik: William C. S. Cho, Queen Elizabeth bolnica, Hong Kong pregled

Primljeno: 28. veljače 2013. godine; Prihvaćeno: 11. lipanj 2013; Objavljeno: 25. srpnja 2013 pregled

Copyright: © 2013 Zhao i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija bio podržan od darovnica iz Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 i 81272749), znanosti i tehnologije komisije općine Šangaj (br. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 i 12PJ1406300), ključni projekti u National znanosti i tehnologije krovnog programa Kine (br 2011BA203191), istraživački fond za doktorski program visokog obrazovanja u Kini (br 20110073110071), ključni projekt odbora za obrazovanje Šangaju (br. 12ZZ102, 12ZZ105) i Zaklade inovacije za PhD Maturanti Shanghai Jiao Tong University School of medicine (BXJ201213). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je jedan od najčešćih zloćudnih bolesti i drugi najčešći uzrok raka povezane smrti u svijetu [1]. Iako je napredak u liječenju, stopa preživljavanja bolesnika s GC je razočaravajuće, to je uglavnom zbog paucity specifičnih terapijskih ciljeva. Dakle, bitno je identificirati molekularne mehanizme kojima se temelji razvoj karcinoma želuca. Pregled

mikroRNA (miRNAs) su klasa malih (18-25 nukleotida), nekodirajuće, jednostruke niti endogenih RNA. Oni potiskuju ekspresije proteina interakcijom sa savršenim ili nesavršene komplementarne sekvenci smještenih u 3 'netranslatirano regija (3'UTR) ciljnih gena. Studije u proteklih nekoliko godina pokazali su da nereguliranom miRNAs igraju važnu ulogu u različitim oblicima raka [1] - [4], uključujući GC [5] - [13]. Podaci iz studije o miRNAs i njihove ciljne gene može pružiti uzbudljive terapijske mogućnosti. [3] pregled

Nedavno smo identificirali nekoliko miRNAs dereguliranih u GC, kao što su silazni Mir-126 [14], Mir-409-3p [15], Mir-625 [16], a uzlazni Mir-21 [17], Mir-301A [18]. Iako su mnogi miRNAs su identificirani povezivanje s GC, mehanizam tih miRNAs u želučanom tumorigenezi još treba istražiti. U našem dosadašnjem radu, brojni navodni miRNAs koji su pokazali diferencijalnu ekspresiju između GC tkiva i njihovih susjednih ne-tumorskih tkiva od 28 pacijenata su identificirani [19]. Među njima, Mir-202-3p je bio jedan od najvažnijih značajno smanjen miRNAs. No uloga Mir-202-3p u GC rijetko istražuju. Pregled

Mir-202-3p, prethodno nazvana HSA-Mir-202, koji se nalazi unutar kromosomske krhke stranice u 10q26. Brisanje krhke stranice je povezana s endometrija [20], tumori mozga [21], [22]. Mir-202 je objavljeno da deregulirani u raka dojke [23], [24], cervikalna skvamoznih stanica [25], rak debelog crijeva [26] i folikularni limfom [27]. Petrocca et al. utvrdio da Mir-202 je dolje regulirana u kronični gastritis [28]. Mir-202 pokazano je da podregulira 4-hydroxynoneal (HNE) u HL-60 stanica leukemije [29]. Nedavno istraživanje također je pokazala da miR-202 izravno cilja protoonkogen MYCN, što rezultira u inhibiciji neuroblastoma stanične proliferacije [30]. Pregled

Ovdje pokazujemo opće smanjenje miR-202-3p razine ekspresije u 150 GC tkiva u usporedbi s ne-tumorskih tkiva i da se Mir-202-3p razine povezane s veličinom tumora i dobi bolesnika. Osim toga, otkrili smo, po prvi put, da Mir-202-3p može spriječiti rast i inducira apoptozu GC stanicama i In vitro pregled i In vivo
izravno ciljanje faktora transkripcije Gli1 i zabranjivanje izraz Gli1 ciljnih gena γ-katenina i BCL-2. pregled

materijali i postupci

Izjava Etika pregled

Pismeni informirani pristanak dobiven je od svih sudionika. Istraživanje je odobreno od strane istraživačkog etičkog povjerenstva za ljudska i Ruijin bolnice Medicinskog fakulteta, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), u laboratorijskih životinja Etičkog komiteta RuiJin bolnice (LAEC 11-062). Postupci životinja su provedena sukladno protokolu odobrenom od njega i uporaba odbora institucionalni životinja (IACUC) na Shanghai Jiao Tong University, Šangaju, Kina.

Kultura Cell pregled

Ljudski GC stanične linije SGC -7901 i BGC-823 kupljeni su od Šangaj instituta za biološke znanosti kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina). MKN-45 i MKN-28 stanične linije dobivene su iz japanske Cancer Research potencijala banke (Tokyo, Japan). NCI-N87, AGS, Kato III i SNU-1 stanične linije su originalno kupljen od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ljudskog embrija stanice bubrega 293T (HEK-293) je sačuvan u našem institutu. Stanice su pohranjene, dobiven od zamrzavanja u tekućem dušiku, a koristi se u ranim prolaza. Stanice su održavane u mediju RPMI-1640 plus 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i uzgajane u 5% CO2 vlažnom ambijentu. Eksponencijalno rastuće stanice su se koristili za eksperimente. Pregled

Pacijent Tkiva

Primarni GC tkiva i podudaraju non-tumorskih tkiva dobiveni su od 150 GC bolesnika podvrgnutih radikalnu gastrektomije na Odjelu za kirurgiju, Ruijin bolnica, škola Medicinski, Shanghai Jiao Tong University. Uzorci snap-smrznuto, neposredno nakon kirurškog zahvata. Svi uzorci su potvrđeni neovisnom patološkog pregleda. Nijedan od pacijenata primili predoperativnu terapiju. Za sve pacijente, kliničkopatološkim podaci bili dostupni. Klasifikacija tumora prema Međunarodnoj unije protiv raka (2009). pregled

RNA i kvantitativna Real-time PCR (QRT-PCR) pregled

Ukupna RNA je ekstrahirana iz stanične linije i uzoraka tkiva koriste Trizola reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) prema uputama proizvođača. Koncentracije i čistoće RNA uzoraka su mjereni pomoću elektroforeze i spektrofotometrijskim metodama. Razina ekspresije Mir-202-3p i U6 male nuklearne RNA (RNU6B) ispitani su trostruko od strane matičnih petlje RT-PCR metodom koja koristi ukosnica-on ™ miRNAs qPCR kvantifikacije Kit (GenePharma, Šangaj, Kina) sa specifičnim primerima formiR-202-3p i U6 mali nuklearni RNA (RNU6B). Relativna Mirna izraz Mir-202-3p je normaliziran u odnosu na endogene kontrole, U6, koristeći DDCt metode. Razine mRNA Gli1 i GAPDH mjereni su trostruko pomoću SYBR Green PCR u realnom vremenu (Applied Biosystems, USA) sljedeće uputama proizvođača. Kvantifikacija je učinjeno pomoću DDCt relativna metoda kvantifikacije s ljudskim GAPDH kao interna kontrola. Korišteni su sljedeći primeri: Gli1 (smisao: 5'-GGA AGT MAČKA ACT CAC GCC TCG A-3 ', negativna: 5'-MAČKA TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3') [31] i GAPDH (smisao: 5'-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3 ', negativna: 5'-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3'.) pregled

Prijelazna Transformacija Mirna oponaša pregled

MiR- 202-3p oponaša (dsRNA nukleotida) i negativni mimics1 kontrola (NC) (smisao: 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ', negativna: 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3') su kupljene od GenePharma (Shanghai, Kina). Stanice su posađene u ploče sa 6 jažica dan prije transfekcije da se osigura 40% konfluenciju stanica u trenutku transfekcije. Transformacija Mirna oponaša u stanice provedeno sa Lipofectamina 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) prema postupku proizvođača. Mirni oponaša su korištena u konačnoj koncentraciji od 100 nM. Pregled

stanične proliferacije pregled

24 sata nakon transfekcije s Mirni oponaša, stanice (2 x 10 ^{3 stanica /jažici ) posađeno je u pločice s 96 jamica i inkubiraju 72 sata. stanična proliferacija je procijenjena trostruko od topiv u vodi tetrazolij soli (WST) testom pomoću brojanja Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan), a mjerena nakon uputama proizvođača. pregled}

Soft agar kolonija Formiranje Test

Mirni oponaša stanice su ponovo suspendirane s 0,3% meko agaroze (A9045, niske temperature geliranja, Sigma-Aldrich, USA) u RPMI 1640 koji sadrži 10% FBS i slojevito na 0,4% skrutne agar u RPMI 1640 koji sadržava 10% FBS u 6 jamica (1 × 10 ^{3 stanica /jažica) na 24 sata poslije infekcije. Ploče su inkubirane 2 tjedna. Kolonije koje sadrže najmanje 50 stanica su izbrojani. Pregled}

Apoptoza Analiza pregled

Jedan dan prije transfekcije s Mirna oponaša, 1 × 10 ^{6 stanice su posađene u 6 jažica. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice su sakupljene i bojane s AnnexinV /PI double staining kompletom (BD Biosciences, USA) prema protokolu proizvođača. Apoptotičke stanice su ocijenjeni trostruko i ponovio tri puta, neovisno protočnom citometrijom na FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Pregled}

Retroviral Transformacija za stabilne stanične linije

Genska regija koja je uključivala primarni transkript Mir-202-3p kloniran u EcoRI-Xhol mjesto pMSCV modificiranog-GW-RFA-PGK-EGFP retrovirusni vektor. Negativne kontrole vektora imala umetak. HEK 293T stanice (1 × 10 ^{6 /šupljini) nasađeno je u ploče sa 6 jažica dan prije transfekcije. Deset ug retroviralnim konstruktom koji sadrži bilo miR-202-3p ili bez umetka, 2 ug gag /pol i 2 ug VSVG sutransficirana su u HEK 293 stanice korištenjem Lipofektamin ™ 2000 reagensa i Opti-MEM I smanjuje seruma u svakom ploča. Virusi su sakupljene u 48 sati i 72 sati nakon transfekcije pomoću virusno skup mediju (RPMI-1640 s 10% toplinski inaktiviranog FBS + 1% glutamin + 20 mM HEPES). Infekcije MKN-28 stanica provodi se u prisutnosti 8 g /ml polibren u svaku jažicu na ploču s 6 jažica. Stanice su inficirane centrifugiranjem na 1500 rpm tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. supernatant koji sadrži viruse bio je uklonjena nakon 2 h. Pozitivne stanice su izabrani na ekspresiju GFP FACS sortiranje i zove RV-Mir-202-3p i RV-Mir-kontrolu respektivno. Mir-202-3p izraz je potvrdio QRT-PCR. Pregled}

Rast tumora na miševe

Muški BALB /c nu /nu miševa, u dobi od šest tjedana (Institut za zoologiju kineske akademije znanosti), smještene su u određenom okruženju bez patogenih organizama u životinjskom Laboratorijska jedinica Medicinskog fakulteta, Shanghai Jiao Tong University, Kina. Miševi su primili humanu njegu i studije protokoli su provedena sukladno protokolu koji je odobrila Institucionalna Animal njega i uporaba odbora (IACUC) na Shanghai Jiao Tong University, Šangaju, Kina. Stanice (100 ul, 2 x 10 ^{6 stanice) iz stabilnih transfektiranih linija RV-miR-202-3p ili RV-miR kontrole su prikupljeni i supkutano u miševe. Šest miševa su korištene za svaku skupinu. Miševi su provjereni tjedno, i tumor čvorovi su mjerena pomoću kalipera. volumen tumora (V) procijenjena je pomoću jednadžbe V = 4 /3π × L /2 × (W /2) 2, gdje je L duljina mid-osi, a W je mid-os width.The tumorske stanice su ostavljene da rastu 5 tjedana i krivulja rasta tumora i inhibiciju se izračunaju. Nakon što su žrtvovani miševi, svih tumorskih transplantati su izrezani, izvagani uzete, fiksirane i ugrađen. Svaki eksperiment je izveden dva puta. Pregled}

TUNEL Analiza pregled

Terminal nucleotidyl nick kraj transferaza posredovane označavanje testu (TUNEL) provedena je u skladu s uputama proizvođača kompleta slijepi ™ Kolorimetrijska TUNEL sustava (Promega, SAD). Tkiva su fiksirane u 10% formalinu i neutraliziran uronjeni u parafinske blokove. Sekcije (4 um) su pripremljene za pregled. Nakon deparaffinization, sekcije su tretirani s 20 g /ml proteinaze K 10 minuta, uz 0.3% H _{2O 2 u metanolu za 10 min i 0.1% Triton X-100 u 0,1% natrijev citrat za 2 minute na ledu. Zatim su sekcije su inkubirane s TUNEL reakcijsku smjesu tijekom 60 min na 37 ° C. Daljnje inkubacije sa peroksidazom konjugirani antitijela je provedena tijekom 30 min pri 37 ° C. Sekcije su označene s diaminobenzidin otopinu 10 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim protu hematoksilinom. Pregled}

Imunohistokemija pregled

sekcija (debljine 6 mm) na formalinom fiksiranih, u parafin uklopljenih tumora specimenswere deparafmizirani u ksilen i rehidrira u ocjenjuju alkohola. Endogene peroksidaze je blokirana upotrebom 3% H _{2O 2 10 min. Nakon pronalaženja antigena u citratnom puferu (pH 6,0), sekcije tkiva su inkubirani s normalnim kozjim serumom za blokiranje vezanja nespecifične antitijela (20 min na sobnoj temperaturi). Sekcije su zatim inkubirane Gli1 antitijela (1:50, SC-20.687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) pri 37 ° C u humidchambers za 2 h. Nakon ispiranja s PBS-om tri puta, sekcije su inkubirane s peroksidazom-konjugirani anti-zečjim IgG, tijekom 1 h na sobnoj temperaturi. Sljedeći, stakalca su isprana s PBS-om i inkubirane 5 minuta s DAB supstrat za manje od 30 minuta. Hematoksilin je korišten za counterstaining. Pregled}

Konstrukcija plazmida i luciferaze Aktivnost pregled

203-bp pune duljine divljeg tipa (WT) Gli1-3'UTR ili mutant Gli1-3 ' UTR (mut) koji sadrži pretpostavljenu mir-202-3p vezno mjesto je sintetiziran (Sangon, Šangaj, Kina). Nakon digestije Spel i Hindlll, fragmenti divljeg tipa i mutanta Gli1-3'UTR klonirani u mjestima Spel i HindIII od pMIR-izvješće luciferaza vektora (Applied Biosystems) i zove pMIR /Gli1 i pMIR /Gli1 /mut, odnosno. Sekvencioniranje DNA se koristi za potvrdu konstrukti. Pregled

HEK-293T stanice su nasađene u 24 jažica 24 sata prije izvođenja analize. U svaku jažicu, 100 ng pMIR /Gli1 ili pMIR /Gli1 /mut, 2 ng PRL-TK (Promega, Madison, WI, USA) koji sadrži Renilla luciferaze i 100 Nm Mirna oponaša su kontraučinak korištenjem Lipofektamin ™ 2000 reagensa i Opti-MEMI smanjen serum medij. Relativna aktivnost luciferaze je izračunata 48 sata nakon ko-transfekcijom pomoću Dual-Glo Luciferase (Promega, SAD) prema postupku proizvođača. Aktivnost luciferaze krijesnice je normalizirana na Renilla aktivnost luciferaze. pregled

Western blot analiza pregled

Stanice i tumor su lizirane korištenjem M-PO reagense i Halt koktel inhibitora proteaze kitova (Pierce, USA). Koncentracija proteina u staničnim lizatima se kvantificira korištenjem BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). Protein se odvoje pomoću SDS poliakrilamid gel elektroforezom i mrlja na 0,22-p.m polivinilidenfluorid membrane (Millipore, MA, USA). Korišteni su slijedeći specifičnih antitijela: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-katenina (1:2000, BD Biosciences, USA), bcl-2 (1:2000, EPITMICS, USA) i GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). Razine proteina su normalizirani na ukupnu GAPDH pregled

Izgradnja Gli1 ekspresijskog plazmida i transfekcije

umnožavanjem cDNA MKN-28 upotrebom slijedećih prajmera. smislu (5'AGT ACA TGA TGG GAT ATC AT-3 '), a antisense (5'ATG CGG CCG AGG CTT CAC TA-3'), pune duljine Gli1 dobiven je digestirana EcoR V i Not i i klonirani u pcDNA3.1 vektor (Invitrogen) i nazvan pcDNA3 0,1-Gli1. Sekvencioniranje DNA se koristi za potvrdu konstrukti. Pregled

Stanice su nasađene u ploče sa 6 jažica dan prije transfekcije kako bi se osiguralo 80-90% konfluentnosti stanica u trenutku transfekcije. U svaku jažicu, stanice su transfektirane s 250 pmol miR-202-3p oponaša ili kontrolu, uz 4 ug pcDNA3.1-Gli1 ili pcDNA3.1 prazan vektor, pomoću Lipofectamine 2000. WST Test je proveden kod 24 sata nakon transfekcije, a analiza apoptoza je provedeno na 48 sata nakon ubacivanja. pregled

Statistička analiza

Kontinuirane varijable uspoređene su Student t
testa za normalno distribuiranih varijabli i Wilcoxon čin-zbroj test za nonnormally distribuiranih varijabli. Odnos između Mir-202-3p razinama ekspresije i kliničko parametara analiziran pomoću Pearson Chi-kvadrat test. Sve vrijednosti su prikazani kao srednje vrijednosti ± SDS. Sve statističke analize provedene su pomoću PASW statistikama 18,0 softver (IBM, USA). Dva kraka vrijednost P pregled. ≪ 0,05 smatrana je statistički značajna pregled

Rezultati

Izražavanje Mir-202-3p smanjena je u GC i korelira s kliničko Parametri

Iskazi Mir-202-3p su pregledane QRT-PCR u tumorskim tkivima i podudarne ne-tumorskih tkiva od 150 GC bolesnika (Sl. 1). Rezultati pokazuju da je ekspresija Mir-202-3p značajno regulirani u tumorskim tkivima u usporedbi s podudarnim ne-tumorskih tkiva u 68% (102/150) bolesnika GC. (P 0,001; Sl. 1A, B)

Kako bi se dodatno rasvijetliti vezu između razine ekspresije Mir-202-3p i kliničko čimbenika u ljudskoj GC, a 150 slučaja su dodatno analizirani (Tablica 1). Na temelju relativne Mir-202-3p izražavanja, 150 slučaja su podijeljeni u 3 skupine: Mir-202-3p niska ekspresija (tumor /ne-tumorske < 0.66, n = 85), Mir-202-3p umjereno ekspresije (tumor /ne-tumor omjer 0,66-1,5, n = 34) i miR-202-3p visoke ekspresije (tumor /ne-tumor > 1.5, n = 31). Mir-202-3p razinama su u negativnoj korelaciji s veličinom tumora i pozitivno korelira s dobi u ovih bolesnika, s Mir-202-3p niske ekspresije skupine izložene znatno veća veličina tumora (p = 0,013) i stariji dobi u usporedbi s umjerenim ili visoke ekspresije skupine (p = 0,028). Međutim, Mir-202-3p razine ekspresije nisu pokazali nikakvu vezu sa rodom, diferencijaciju lokaciji tumora, tumora lokalne invazije, limfnih čvorova metastaza ili TNM stadiju. Pregled

Prekomjerna ekspresija Mir-202-3p Koči GC stanična proliferacija pregled

s obzirom da miR-202-3p značajno je smanjena u GC, može funkcionirati kao tumor-supresor. Dakle, ispitali smo je li pretjerano izlučivanje Mir-202-3p u GC stanicama utjecati na rast stanica. MKN-28 i BGC-823 staničnih linija, čiji je izraz Mir-202-3p su najniže u osam testiranih GC stanične linije (sl. 1 C), izabrani su za sljedeće expreiments. Sintetički Mir-202-3p oponaša i negativni kontrolni oponašati molekule (NC) klonovi ubačeni u MKN-28 i BGC-823 stanicama respektivno. Ektopijsku izraz Mir-202-3p u stanicama je potvrdio QRT-PCR. Pregled

Test stanica Rast WST pokazala značajne inhibicije rasta stanica u MKN-28 stanica transficiranih Mir-202-3p (Sl. 2.a). Slični su rezultati opaženi kod BGC-823 stanicama (Sl. 2B). Za daljnju karakterizaciju efekta Mir-202-3p na rast stanica, proveli smo mekani agar testa formiranja kolonija u inficiranim stanicama. Otkrili smo da je broj kolonija iz MKN-28 stanice transfecirane sa Mir-202-3p oponaša je gotovo polovica da se od kontrole i roditeljske grupe (Sl. 2C). Slični su rezultati opaženi kod BGC-823 stanicama (Sl. 2.d). Ovi rezultati pokazuju da Mir-202-3p može suzbiti staničnu proliferaciju GC stanicama In vitro pregled. Pregled

Prekomjerna ekspresija Mir-202-3p izaziva GC stanicama Apoptoza pregled

Od inhibicija rasta možda zbog začepljenja progresije staničnog ciklusa ili povećane apoptoze, što sljedeći put izveden test stanična dioba ciklus i apoptozu protočnom citometrijom. Naši podaci pokazuju da su apoptične stope oba MKN-28 i BGC-823 stanicama koje su transfektirane s miR-202-3p oponaša značajno doreguliran (Sl. 3A, B). Međutim, nije bilo značajne razlike u staničnom ciklusu između različito tretiranih skupina (podaci nisu pokazali). Ovi rezultati pokazuju da prekomjerna ekspresija Mir-202-3p inducira apoptozu u GC stanicama mogu doprinosi inhibitornih svojstava rasta Mir-202-3p. Pregled

Prekomjerna ekspresija Mir-202-3p Koči torn smjeru i povećava apoptozu in vivo

S obzirom da je mir-202-3p inhibira rast GC stanice, te potiče apoptozu In vitro pregled, mi sljedeći ispituje da li mir-202-3p mogao potisnuti rast tumora i potaknuti apoptoza in vivo pregled. dobiveni su stanice MKN-28, RV-Mir-202-3p (MKN-28 stanice s retrovirus posredovanog Mir-202-3p stabilna ekspresija) ili RV-Mir-kontrole (MKN-28 stanica sa praznim vektorom), kako je opisano u Materijal i metode. Stanice su injektirane subkutano u golih miševa. Stvaranje tumora je praćen. Vrijeme tumor latencije su pokazali značajnu razliku između miševa kojima je ubrizgan RV-Mir-NC stanica i RV-Mir-202-3p stanica (Sl. 4a). To je od velikog interesa koji Tumori dobiveni iz RV-miR-202-3p stanica rasla znatno sporije u odnosu na RV-miR kontrolnu skupinu tijekom rasta tumora (Sl. 4B). Prosječna težina tumora koji proizlaze iz RV-Mir-202-3p bio je znatno manji od tumora koji su izvedeni iz RV-Mir-kontrole (Sl. 4C, D). Pregled

Osim toga, Tunel testovi tumorskih tkiva su izvedeni. Kao što je prikazano na slici. 5E, RV-Mir-202-3p stanice su pokazali više stanica tumora pozitivno bojenje i znatno veću apoptotski indeks nego RV-Mir-kontrolnih stanica ( P izvoznici < 0,01). Ovi rezultati ukazuju na to da Mir-202-3p inhibicija torn smjeru pripisuje povećanom apoptoze in vivo pregled. Pregled

Mir-202-3p izravno ciljaju Gli1 pregled

razumjeti mehanizam podlozi tumorsko-zabranjivanje svojstva Mir-202-3p u GC, tražili smo svojim pretpostavljenim ciljnih gena s potencijalnim pro-onkogena funkcija pomoću online alata za pretraživanje (RNAhybrid i Miranda algoritmi), i geni predvidio oba bioinformatika alata su izabran kao ciljnim kandidat gena Mir-202-3p. Među stotinama gena kandidata predvidjeti, transkripcije aktivatora Gli1 je od posebnog interesa (Slika S1). Pretpostavljena sekundarne strukture RNA hibrida za ljudsku Mir-202-3p i Gli1 prikazan je na slici S2. Gli1 je izvijestila vrlo izražen u GC [32], [33]. To sugerira da smanjuje izraz Gli1 rezultiralo GC inhibiciju rasta staničnih linija i apoptoze [33]. Pregled

Još jedan savjet o mogućim ulozi Mir-202-3p u regulaciji Gli1 izražavanja došao iz analize osam različitih staničnih linija raka želučani (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, Kato III, BGC-823 i MKN-28). Statistička analiza pokazala je značajnu obrnuto obrasce ekspresije između Mir-202-3p i Gli1 ((r = -0,345, P pregled. ≪. 0.001, slika 5A) pregled

Kako procijeniti klinički značaj tih nalaza, ispitali smo povezanost između izraza Gli1 s mir-202-3p izražavanja u GC tkiva. otkrili smo da Gli1 i mir-202-3p pokazuju inverznu ekspresije u GC tkiva (Tablica 2). Ovi rezultati podupiru pretpostavka da je regulacija od Mir-202-3p povećava razinu Gli1 gena u raka želuca. pregled

luciferaze testovi se izvode kako bi potvrdili izravnu interakciju između Mir-202-3p i 3'UTR Gli1. luciferaza novinari izgrađene su sa ili divljeg tipa Gli1 3'UTR slijed uključujući Mir-202-3p veznog mjesta (pMIR /Gli1), ili mutiranog Gli1 3'UTR (pMIR /Gli1 /mut) (sl. 5b). the pMIR /Gli1 i pMIR /Gli1 /mut luciferaze konstrukti su transferirani u HEK-293T stanica, zajedno sa Mir-202-3p ili NC oponaša. relativna aktivnost luciferaze od reportera pMIR /Gli1 izrazito je potisnuto u usporedbi s onom pMIR /Gli1 /mut u mir-202-3p ovisan način (Sl. 5C). Ovaj rezultat je snažno ukazuje na to da 3'UTR Gli1 nosi izravnih mjesta povezivanja Mir-202-3p. Pregled

Da bi se utvrdilo na razini mRNA i na razini proteina Mir-202-3p dolje regulira Gli1, otkrio je izraz Gli1 by QRT-PCR i Western blot. Kao što je prikazano na slici. 5E, razina Gli1 protein je smanjen u Mir-202-3p oponaša transfektirane MKN-28 stanica u usporedbi s NC oponaša transfektirane i roditeljske MKN-28 stanice. U međuvremenu, tu nije bilo nikakvog učinka od Mir-202-3p na razini Gli1 mRNA (Sl. 5D). Ovi rezultati jasno ukazuju da miR-202-3p negativno regulira ekspresiju Gli1 na translacije razini. Pregled

Među gene da inhibiraju apoptozu GC, γ-katenina (Plakoglobin) i bcl-2 su izravne transkripcijski ciljevi od Gli1 [34], [35]. Kao što je prikazano na slici. 5E, razina proteina u y-katenina i bcl-2 je značajno smanjen u MKN-28 stanica transficiranih Mir-202-3p oponaša. Pregled

Osim toga, ispitali smo ekspresiju Gli1 proteina u potkožnim tumorima koji su izvedeni od RV-Mir-kontrole i RV-Mir-202-3p na miševe Western blot analizom. Razina Gli1 proteina u tumorima iz RV-Mir-202-3p pokazao downregulation usporedbi s onim u RV-Mir-kontrole (Sl. 5F). Ovi rezultati jasno ukazuju da Mir-202-3p negativno regulira ekspresiju Gli1 post-transkripcijski. Pregled

Prekomjerna ekspresija Gli1 spašava Utjecaj Mir-202-3p u GC stanicama

Od Mir-202-3p regulirani Gli1 inhibirati proliferaciju stanica i inducirati apoptozu, on je zaključio da je prekomjerna ekspresija Gli1 mogao preokrenuti ovaj fenomen barem djelomično. I doista, kada Gli1 ekspresiju plazmida (pcDNA3.1-Gli1) uvedena je u MKN-28 ili BGC-823 stanicama koje su prijelazno transficirane s miR-202-3p oponaša, inhibicijski učinak Mir-202-3p na rast stanica je djelomično obrnuta koja je promatrana pomoću WST test rasta stanica (sl. 6A, B). Štoviše, prema progresija apoptoze je također spriječen dok Gli1 je izraženo u MKN-28 ili BGC-823 stanice transfektirane sa miR-202-3p oponaša (sl. 6C, D) dužnici podaci pokazuju da inhibicija rasta i apoptozu stanica induciranu mir-202-3p je barem djelomično odnose na njezin utjecaj na Gli1 izražavanja. pregled

Rasprava pregled

Prikupljeni dokazi su pokazali deregulacija specifične Mirne na GC [4], [13], [36 ]. Mir-202-3p, koji se nalazi u 10q26, objavljeno je da se deregulirana kod raka dojke [23], [24], rak debelog crijeva [26] i folikularni limfom [27]. Petrocca et al. utvrdio da Mir-202 je dolje regulirana u kronični gastritis [28]. Međutim, uloga Mir-202-3p u razvoju i progresiji GC je još uvijek nepoznato. U ovom istraživanju, možemo vidjeti da Mir-202-3p izraz 68% uzoraka karcinoma želuca bila je značajno niža od one podudarnih normalnih tkiva, što ukazuje da je smanjena Mir-202-3p izraz je čest događaj u GC. Važnije, razine miR-202-3p negativnoj korelaciji s veličinom tumora GC kod pacijenata. Ovi rezultati ukazuju na inhibitorni ulogu Mir-202-3p u razvoju i progresiji GC. Pregled

S obzirom Mir-202 je dolje regulirana u želučanom tkivu raka, nagađa se da je prekomjerna ekspresija Mir-202 može suzbiti malignih fenotipa želučane stanice raka. U ovom istraživanju, pokazali smo da obnova Mir-202-3p u MKN-28 i BGC-823 stanicama značajno inhibira proliferaciju stanica i inducira apoptozu i in vitro
i in vivo pregled. Ovi rezultati snažno pokazala da je smanjena Mir-202-3p izraz u GC trebao biti faktor koji doprinosi razvoju umjesto da se pogođeni kao posljedica GC. Prema tome, značajna inhibicija tumorskih ksenograftova u golih miševa znači da terapijske strategije uvođenja Mir-202-3p u stanice raka mogu biti korisni za usporavanje procesa tumorogenezi. Pregled

MiRNAs mogu regulirati ekspresiju gena preko podregulirani prijevod ciljne mRNA ili gore održavanoj degradacije ciljne mRNA [3], [37]. Na temelju bioinformatiku algoritama, možemo identificirati Gli1 kao mogućeg izravnog ciljnog gena Mir-202-3p. Gli1, član obitelji Gli, izvorno je identificirana kao amplificiranog gena u malignog glioma [38]. To je jaka pozitivna aktivator nizvodno ciljnih gena i sam po sebi je transkripcijski meta shh signalizacije [39], a to također može biti regulirano RAS /PKC [40], TGF-beta [41] i PI3K signaliziranje [42] i regulirani by pKA [42] i p53 signalizaciju [43]. Gli1 ekspresija u stanicama epitela može izazvati transformaciju stanice karakterizira povećana proliferacije i sidrište neovisan proliferacije [35], [44]. Veći broj studija pokazuju da Gli1 je eksprimirana u različitim oblicima raka, uključujući rak želuca [32], [33], [45], te su razine ekspresije Gli1 pozitivno koreliraju s tumora diferencijacije [33]. Smanjivanje izraz Gli1 strane cyclopamine ili siRNA rezultiralo GC inhibicije rasta stanica i apoptoze [33]. Mi se potvrdilo Gli1 kao izravna meta Mir-202-3p, otkrili smo da Mir-202-3p granični s nepotpunim komplementarnosti na Gli1 3'UTR i prekomjernom ekspresijom Mir-202-3p dolje regulira Gli1 na razini proteina. Osim toga, statistička analiza je pokazala značajnu obrnuto obrasce ekspresije između Mir-202-3p i Gli1 u GC tkiva i staničnih linija. γ-katenina (Plakoglobin) i bcl-2, izravna transkripcijski mete Gli1, su izvijestili da inhibiraju apoptozu GC. Izraz Gli1 nizvodno ciljnih gena y-katenina (Plakoglobin) i bcl-2 [34], [35] izrazito se smanjuje kada Mir-202-3p je izraženo u GC stanicama. To sugerira da je inhibicija rasta GC stanica izazvanih Mir-202-3p možda djelomično odnose na njeno suzbijanje na y-katenina i bcl-2, za koju su pak kroz izravnu interakciju s Gli1. Važno je, pojačanom ekspresijom Gli1 spašava stanične inhibicije rasta i staničnu apoptozu izazvanu Mir-202-3p, dodatno pokazujući da Gli1 je izravna meta Mir-202-3p i sugerira važnu ulogu Gli1 kao posrednik bioloških učinaka mir-202-3p u GC. pregled

Ukratko, mir-202-3p često je smanjen u ljudskoj raka želuca. Obnova Mir-202-3p inhibira proliferaciju GC, barem djelomično, kroz indukciju stanične apoptoze izravnom interakcijom s Gli1 (Sl. 7). Takve uloge Mir-202-3p u GC predložiti svoj potencijal kao terapijski mikrornk za želučane liječenje raka, koji je vrijedan daljnjeg istraživanja. Pregled

popratne podatke
Slika S1.