PLoS ONE: микроРНК-30b, понижающей регуляции в рак желудка, стимулирует апоптоз и подавляет рост опухоли путем пристреливать ингибитора активатора плазминогена-1

Абстрактный

Фон
<р> Рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний во всем мире. Новые данные показали, что микроРНК (миРНК) связаны с развитием опухоли и прогрессии. Наши предыдущие исследования показали, что H. Pylori
инфекция была способна индуцировать измененную экспрессию микроРНК-30b в эпителиальных клеток желудка. Тем не менее, мало известно о потенциальной роли микроРНК-30b при раке желудка.

Методы
<р> Мы проанализировали экспрессию микроРНК-30b в желудочном линиях раковых клеток и раковых тканей желудка человека. Мы исследовали влияние микроРНК-30b мимики на апоптоз клеток рака желудка в пробирке с помощью проточной цитометрии (ТСМ) и анализов каспазы-3/7 деятельности. Обнаженные мышиная модель ксенотрансплантата была использована для определения, является ли микроРНК-30b участвует в онкогенеза рака желудка. Цель MIR-30b был идентифицирован с помощью анализа биоинформатики, люциферазы и Вестерн-блоттинга. Наконец, мы провели анализ корреляции между MIR-30b и его целевой экспрессии при раке желудка.

Результаты
<р> микроРНК-30b была значительно понижающей регуляции в клетках рака желудка и желудочных раковых тканей человека. Принудительная экспрессия микроРНК-30b способствовало апоптоз клеток рака желудка в пробирке, и микроРНК-30b может значительно ингибировать туморогенности рака желудка за счет увеличения доли апоптоза раковых клеток в живом организме. Кроме того, ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) был идентифицирован как потенциальная мишень MIR-30b, и уровень микроРНК-30b обратно коррелирует с PAI-1 экспрессии при раке желудка. Кроме того, глушение PAI-1 был способен фенокопии эффект микроРНК-30b сверхэкспрессии на апоптоз регуляции раковых клеток, и избыточная экспрессия PAI-1 может подавляться эффект продвижения клеточного апоптоза MIR-30B, указывает на ИАП-1 потенциально участвуют в микроРНК-30b-индуцированного апоптоза в раковых клетках.

Заключение
<р> микроРНК-30b может функционировать в качестве нового гена-супрессора опухолей при раке желудка путем охвата ИАП-1 и регулирующих апоптоз раковые клетки. микроРНК-30b может служить в качестве потенциального биомаркера и терапевтической мишени против рака желудка
<р> Образец цитирования:. Чжу Е-Д, Ли N, Li B-S, Li W, Чжан W-J, Мао X-H и др. (2014) микроРНК-30b, понижающей регуляции в рак желудка, стимулирует апоптоз и подавляет рост опухоли путем пристреливать ингибитора активатора плазминогена-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. DOI: 10.1371 /journal.pone.0106049
<р> Редактор: Gerolama Кондорелли, Федерико II Университет Неаполя, Италия, Италия
<р> Поступило: 7 мая 2014 года; Принято: 28 июля 2014; Опубликовано: 29 августа 2014
<р> Copyright: © 2014 Чжу и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводы полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 81202310), Научно-инновационного исследовательского фонда Третьего военного медицинского университета (No. 2009XQN20). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка вызывает около 738000 смертей во всем мире в год, и она была признана третьей ведущей причиной рака, связанных смерти у мужчин [1]. Ранняя диагностика и лечение привели к отличным ожиданий для долгосрочного выживания и хорошим прогнозом, в то время как прогноз для пациентов с распространенным раком желудка остается на низком уровне. Как и другие виды рака, развитие рака желудка считается многофакторной. Helicobacter Pylori (H. Пилори)
инфекции была признана важным триггером рака желудка [2]. Хотя многие генетические и эпигенетические изменения были зарегистрированы в раке желудка, молекулярный механизм, лежащий в основе развития рака желудка остается неясной.
<Р> микроРНК (миРНК) представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые posttranscriptionally регулируют экспрессию генов. Зрелые микроРНК может специфически связываться с 3'-НТО целевой клеточной мРНК в свою очередь, вызывая деградацию мРНК или ингибирование трансляции [3], [4]. микроРНК выступать в качестве ключевых регуляторов в самых разнообразных биологических процессов, в том числе развитие, дифференцировку клеток, апоптоз, метаболизм, и передача сигнала [5], [6]. Было показано, что 50% микроРНК часто расположены в раковых ассоциированных геномных областей или в хрупких участков [7]. Растущий данные показали, что экспрессия аберрантных микроРНК коррелирует с различными злокачественных опухолей человека и указывает на то, что микроРНК может функционировать как онкогены или гены-супрессоры опухолей [8] - [10]. В последнее время значительное количество нерегулируемых микроРНК включая микроРНК-106b-25 кластера, MIR-21, микроРНК-218, MIR-7, и микроРНК-335 были идентифицированы в качестве модуляторов клеточного роста, апоптоза, миграции или вторжения в рак желудка развитие [11] - [15]. Эти данные позволяют предположить, что микроРНК могут играть решающую роль в патогенезе рака желудка.
<Р> Наши предыдущие исследования показали, что H. Pylori
инфекция была способна индуцировать измененную экспрессию микроРНК в эпителиальных клеток желудка, включая микроРНК-155, микроРНК-146а и MIR-30b, микроРНК может функционировать как новые негативные регуляторы для точной настройки H. Pylori
индуцированная воспаление [16], [17]. Более того, мы показали, что микроРНК-146а может играть потенциальную роль в развитии рака желудка путем модулирования пролиферации и апоптоза клеток рака желудка [18]. Следует отметить, что мы также нашли микроРНК-30b может регулировать процесс аутофагии во время H. пилори
сохраняются инфекции, способствуя тем самым сохранением H. Pylori
инфекции [19]. Однако роль микроРНК-30B при раке желудка до сих пор в значительной степени неизвестными.
<Р> ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1) является основным ингибитором сериновых протеазы тканевого типа (ТАП) и урокиназы типа ( U-PA), активатора плазминогена и, следовательно, играет важную роль в системе плазминогена-плазмин [20]. Предыдущие исследования продемонстрировали ИАП-1 является плохим прогностическим фактором в нескольких распространенных опухолей, и связан с вторжением и метастазирование раковых [21]. В последнее время многие группы также обнаружили, что PAI-1 может способствовать росту опухоли посредством ингибирования апоптоза клеток. Например, добавление стабильной дикого типа PAI-1 в клеточной линии рака предстательной железы человека PC-3, человеческий промиелолейкозе клеточной линии HL-60 и даже не-туморальный клеток, привело к существенному ингибированию апоптоза [22] , При подкожном введении голым мышам с PAI-1 с гиперэкспрессией мышиных клеток саркомы, опухоли быстро установлены, в то время как PAI-1 дефицитные клетки были подавленную онкогенность [23]. Другой отчет показал, что, генетические и фармакологические ингибирование PAI-1 в клеточных линий опухолей человека (HT-1080, А549, НСТ-116 и MDA-MB-231) увеличилось спонтанного апоптоза, и, что интересно, имплантированных ИАП-1 нокдаун HT- 1080 клеток к PAI-1 мышей с привело к снижению туморогенез и увеличивал выживаемость по сравнению с контрольными мышами [24]. Эти исследования дают важные свидетельства того, что PAI-1 оказывает защитную роль против апоптоза опухолевых клеток.
<Р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что микроРНК-30b была значительно понижающей регуляции в клетках рака желудка и опухолевых тканей. Эктопическая экспрессия микроРНК-30b может способствовать апоптозу желудочного раковых клеток в пробирке, и микроРНК-30b может значительно ингибировать туморогенности рака желудка в обнаженной модели мыши ксенотрансплантата. Кроме того, PAI-1 был идентифицирован как потенциальных мишеней микроРНК-30b, и микроРНК-30b может индуцировать апоптоз и подавляют рост опухоли, подавляя экспрессию PAI-1. Наши результаты показывают, что микроРНК-30b может функционировать в качестве нового гена супрессора опухолей при раке желудка и может быть потенциальной мишенью для терапии рака желудка.

Материалы и методы

Заявление по этике
<р> Все эксперименты на животных были одобрены Animal этичное и экспериментальной комитета Третьего военного медицинского университета в с. Все операции животных проводили под наркозом пентобарбиталом натрия, и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания. Исследование с участием образцов тканей, была утверждена Советом по рассмотрению этики на третьей военно-медицинского университета, а также письменное информированное согласие было получено от всех пациентов до участия.

образцов тканей
<р> В общей сложности, желудочные раковые ткани и прилегающие ткани неопухолевой были получены у пациентов с первичным раком желудка, перенесших радикальную гастрэктомию в Юго-Западной больнице, третий военный медицинский университет, Китай, и клиникопатологическими характеристики больных раком желудка приведены в таблице 1. После хирургического удаления, ткани были заморожены немедленно в жидком азоте и хранили при -80 ° с. Исследование было одобрено советом по вопросам этики в третьей военно-медицинского университета, и информированное согласие было получено от всех пациентов до участия.

Клеточные линии и клеточная культура
<р> Все клеточные линии, используемые в данном исследовании были получены из Шанхая коллекции типовых культур китайской академии наук (Шанхай, Китай), желудочные линии раковых клеток AGS человека культивировали в F12 Хэма (Hyclone) среда с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), другие желудочно-кишечные клеточные линии рака MKN45 , ТЖК-27, КУП-823, СГК-7901 и эмбриональной почки человека (НЕК) 293 клетки культивировали в среде DMEM (Hyclone) с добавлением 10% FBS, они все поддерживали в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% CO <суб> 2 37 ° с, как описано ранее.

Количественный оТ-ПЦР
<р> Общую РНК экстрагировали реагентом TRIzol (Invitrogen), с последующей обратной транскрипции с использованием анализов TaqMan микроРНК (Амбион), с U6 малым ядерная РНК в качестве внутреннего нормированного ссылки. Реакции QRT-ПЦР проводили с использованием следующих параметров: 95 ° С в течение 2 мин с последующими 40 циклами при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 30 с. QRT-PCR-анализа для мРНК PAI-1 проводили с использованием PrimeScript RT-PCR наборы (Takara), а следующие параметры: 95 ° C в течение 30 с последующими 40 циклами 95 ° С в течение 5 с, 60 ° С в течение 5 с и 72 ° С в течение 30 с. Уровень мРНК бета-актина использовали в качестве внутреннего контроля. Последовательности праймеров, используемых приведены в таблице 2.

Northern-блот
<р> Малогабаритные РНК выделяли с использованием РНК изоляции комплект Mirvana (Амбион). Три пары клинических образцов были выбраны случайным образом из 21 пациента, для последующего Нозерн-блот-анализа. Северный блоттинг проводили по стандартной методике с таблицей ранее [17]. Антисмысловые ДНК-зондов олигонуклеотидных используется для обнаружения MIR-30b и U6 мяРНК были следующими: MIR-30B (5'- AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') и U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3')

трансфекции клеток.

микроРНК-30b подражает, вскарабкался MIR-контроль, химически модифицированный микроРНК-30b дуплекс (agomir), химически модифицируют вскарабкался микроРНК-контроль, PAI-1 миРНК, или миРНК отрицательный контроль были приобретены у GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., Китай). PAI-1 (Serpine1) кДНК человека ORF клон был приобретен у Origene (Origene Technologies, Пекин, Китай). Трансфекция были выполнены с использованием Липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя.

апоптозом клеток для анализа с помощью ТСМ
<р> SGC-7901 или ГГК-27 клетки высевают в 12-луночный планшет в подходящий плотность и выращивают до 30% сплошности, после 24 ч. Затем клетки трансфицировали микроРНК-30b мимике или MIR-контроль, и среду заменяли не содержащей сыворотки DMEM в течение 48 часов. Для Котрансфекция эксперимента с MIR-30b и PAI-1, выражающей вектор, SGC-7901-клетки трансфицировали микроРНК-контрольными или микроРНК-30b мимике, а затем с PAI-1 вектора Clone кДНК человека ORF (обозначается как PAI-1) или пустой вектор через 24 часа. Через 24 ч после трансфекции вектора, среду заменяли бессывороточной DMEM в течение еще 24 ч. Наконец, клетки были применены к анализу апоптозу. Для анализа ТСМ, в комплект аннексина V-FITC Апоптоз Обнаружение I (BD Pharmingen) был использован, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCantoTM II).

каспазы-Glo 3/7 Анализ
<р> активность каспазы-3/7 был обнаружен с использованием каспазы-Glo 3/7 анализа (Promega). Добавьте 100 мкл каспазы-Glo 3/7 реагента с белыми стенами 96-луночный планшет, осторожно перемешать содержимое лунок, а затем инкубируют в лунки при комнатной температуре в течение 30 мин. Свечение было обнаружено с помощью GloMax-96 микропланшет люминометра (Promega).

туморогенности анализы в голых мышах

мышей, используемых в этом эксперименте, были сохранены под конкретного патогена условиях. Жизнеспособные микроРНК-30b mimics- и MIR-контроль трансфецированные СГК-7901 клетки (1 × 10 ^{6) суспендировали в 100 мкл PBS и затем вводили подкожно в обе стороны от заднего крыла той же самки BALB /C бестимусных голую мышь в 4-х до 6-недельного возраста, как описано ранее [25]. Рост опухоли и состояния, включая общее состояние здоровья и поведение мышей исследовали через каждые три дня в течение 4-х недель. Опухолевые мышей понесенные не проявляли признаков боли или бедствия, такие как потеря веса или поведенческие изменения, так что у всех мышей забивали СО <суб> 2 удушья на 28-й день после инъекции. Объем опухоли (V) контролировали путем измерения длины (L) и ширина (W) с суппортами и вычисляется по формуле (L × W 2) × 0,5.}

TUNEL окрашивание
<р> опухоли собирали через 26 суток, и фиксировали в 10% растворе формальдегида, а затем погружают в парафин. Разделы (толщиной 5 мкм), которые были депарафинировали и регидрировали окрашивали гематоксилином и эозином. Опухолевые клетки апоптотических окрашивали методом на месте терминал deoxynucleotidyltransferase-опосредованной дУТФ ник конца маркировки (TUNEL) в использовании на месте набора определения клеточной гибели (POD; Roche Diagnostics Co.). Отрицательный контроль был подвергнут той же окраски для TUNEL без TdT. Изображения были собраны с помощью микроскопа с увеличением × 200.

Построение плазмид
<р> Построение различных люциферазы векторов отчета для мишени микроРНК-30b проводили, как описано ранее [16], [26] и конструкцию, содержащую мутантный запальную зону был сгенерирован в качестве контроля. Последовательности олигонуклеотидов, используемых приведены в таблице 2.

анализа люциферазы и GFP репрессии эксперименты
<р> НЕК-293 клеток высевали в 96-луночные планшеты в количестве 5000 клеток на лунку в день перед трансфекцией. Клетки трансфецировали каждой люциферазы светляков вектора репортер, вектор управления люциферазы Renilla, PRL-TK (Promega) и микроРНК-30b мимике или MIR-контроль (GenePharma). Анализ люциферазы проводили с помощью двойного люциферазы системы репортер анализа (Promega).
<Р> Для GFP репрессии экспериментов, НЕК-293 клетки высевали в 12-луночный планшет при 1 × 10 ^{5 на лунку день до трансфекции, а затем были котрансфицируют с микроРНК-30b мимике или MIR-управления с различными векторами GFP репортер. Клетки были подвергнуты анализа проточной цитометрии, и анализировали данные с помощью CellQuest Pro программного обеспечения.}

Вестерн-блот
<р> Обработанные клетки промывали охлажденным льдом PBS и затем лизируют буфером для лизиса клеток (Пирс). После центрифугирования при 12000 оборотов в минуту в течение 15 мин при температуре 4 ° С, концентрация белка была измерена с помощью ВСА набора для анализа белка (Pierce). Клеточных белков лизаты были разделены на 12% SDS полиакриламидном геле денатурировали и затем переносили на поливинилидендифторидную мембрану. Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в Трис-буферном растворе, рН 7,4, содержащий 0,05% Tween 20, и инкубировали с первичными антителами в течение PAI-1 (1:1000, Abcam) и бета-актина (1:1000 , Santa Cruz) при 4 ° С в течение ночи, соответственно. Мембраны промывали и инкубировали с конъюгированного с пероксидазой хрена вторичных антител (1:5000, Santa Cruz) в соответствии с инструкциями изготовителя. Интерес белок визуализировали с использованием ECL Вестерн-блоттинга субстрат (Pierce) и системная документация Chemidoc XRS гель (BioRad).

Статистический анализ
<р> Результаты выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD) по меньшей мере, в трех независимых экспериментах. критерий Стьюдента был применен для анализа различий между группами. Взаимосвязь между уровнем микроРНК-30b и PAI-1expression была проанализирована с помощью корреляции Пирсона. Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения SPSS (версия 17). Статистические различия были признаны значимыми при P
&л; 0,05 уровень. Статистически значимые данные обозначены звездочками ( P
&л; 0,05 (*), P
&л;. 0,01 (**)

Результаты

Снижение экспрессии микроРНК-30b в желудочном линиях раковых клеток человека и образцов ткани GC
<р> Для того, чтобы определить роль микроРНК-30b в патогенезе рака желудка, мы проанализировали уровни микроРНК-30B в различных клеток рака желудка, в том числе ТЖК-27, АГС, КУП-823 и SGC-7901. Как показано на рисунке 1А, экспрессия микроРНК-30b была значительно вниз регулируется в четырех клеточных линиях по сравнению с пулом пяти неопухолевыми желудочных тканей ( P
&л;.. 0,01)
<р> выражение MIR-30b дополнительно исследовали в 21 парного GC и прилегающих к нему неопухолевыми желудочных тканей через TaqMan количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) Как показано в фигуре 1В, уменьшение MIR-30b был обнаружен у 18 из 21 пациентов (85,7%) по сравнению с соответствующими тканями неопухолевыми. Кроме того, диаграмма рассеяния показали, что микроРНК-30b была значительно понижающей регуляции в желудочном образцах рака по сравнению с нормальной слизистой оболочкой желудка, со средним снижением 6,28 раза ( P
= 0,002) (рис 1C). Для проверки достоверности данных, полученных от экспрессии QRT-PCR, 3 из всех 21 пар образцов были случайным образом выбирали для определения уровня MIR-30b, используя Северный болт. Мы также обнаружили последовательное снижение экспрессии микроРНК-30b при раке желудка по сравнению с неопухолевой желудочных тканей (рис 1D). Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия микроРНК-30b часто подавляется при раке желудка и, возможно, участвует в развитии рака желудка.

Гиперэкспрессия MIR-30b увеличивает апоптоз клеток рака желудка
<р> Один из отличительным признаком рака является его способность уклоняться от апоптоза [27], поэтому мы исследовали влияние MIR-30b на желудочную раковых клеток апоптоза. SGC-7901 или ГГК-27 клетки трансфицировали микроРНК-30b мимике или платные каналы MIR-контроль, а также обоснованность эктопической экспрессии микроРНК-30b было подтверждено QRT-PCR (рис 2A). Тогда эффект MIR-30b на апоптоз SGC-7901 или ГГК-27 клеток оценивали с помощью анализов проточной цитометрии (FCM) анализа и каспазы-3/7 деятельности. Как показано на фигуре 2В и 2С, мы обнаружили, доля апоптотических клеток была значительно увеличена в SGC-7901 или клетках ТЖК-27, трансфицированных микроРНК-30b мимике по сравнению с контроля трансфицированные Mir клеток (16,08% <ЕМ> против
8,25% до SGC-7901 клеток, а также 17,83% по сравнению с
10,87% до ТЖК-27 клеток). Кроме того, значительное увеличение каспазы-3/7 активности был найден в SGC-7901 или ГГК-27 клеток, трансфицированных MIR-30b по сравнению с микроРНК-управления трансфектантов ( P
&л; 0,01, рис 2D). Приведенные выше результаты показывают, что избыточная экспрессия микроРНК-30b может способствовать апоптозу рака желудка в пробирке.

микроРНК-30b подавляет онкогенность и способствует апоптозом клеток в естественных условиях
<р> Для дальнейшего определения микроРНК-30В участвует в онкогенеза рака желудка, использовали обнаженная модель мыши ксенотрансплантата. Потому что мы обнаружили, что микроРНК-30b играет более важную роль в содействии SGC-7901 клетки апоптозу, чем клетки ТЖК-27 в пробирке, мы исследуем роль микроРНК-30b в онкогенеза рака желудка с использованием SGC-7901 клеток. микроРНК-управления- и микроРНК-30b-tranfected СГК-7901 клетки вводили подкожно в заднюю либо бок тех же голых мышей. Мышей наблюдали в течение наблюдения роста ксенотрансплантата в течение 4-х недель. Было установлено, что введение MIR-30B в СГК-7901 клеток приводило к значительному уменьшению размера объема опухоли (фиг.3А и 3В), а также опухоли, полученные из MIR-30B лечение СГК-7901 клетки росли медленнее по сравнению с контролем группы в течение всего периода роста опухоли (рис 3C, левая панель). Когда опухоли собирали, средний объем опухолей, полученных из группы микроРНК-30b имитирует лишь 27,87% от этого в микроРНК-контрольной группе (рис 3C, правая панель, P
< 0,01). Опухоли собирали в 26 дней, с двух сторон от заднего крыла той же мыши, апоптозом на месте были измерены с помощью TUNEL. Как показано на фиг.3D, опухолевые участки от микроРНК-30b мимике лечение ксенотрансплантаты показали значительно увеличение TUNEL-положительных клеток. Эти результаты убедительно показывают, что введение MIR-30b может ингибировать рост рака желудка, способствуя апоптоз раковых клеток.

PAI-1 является кандидатом целевой ген микроРНК-30b

Для дальнейшей оценки функция MIR-30b, важно определить, какие хозяева мРНК регулируются с помощью микроРНК-30b. В нашем предыдущем исследовании, мы исследовали профиль экспрессии мРНК в пяти пар первичных тканей опухолей у больных раком желудка и соответствием без опухолевых тканей с помощью микрочипов. Всего мы нашли 303 повышающей регуляции генов (Fold изменение &циклопентилпурин 2, P
≪ 0,05) в желудочном раковых тканей по сравнению с неопухолевой ткани (данные не показаны). Учитывая подавляются экспрессию микроРНК-30b при раке желудка, мы сосредоточили внимание на список генов, показывающих повышенные выражения и выбраны 30 лучших возросшие генов при раке желудка, а затем определить, если эти гены являются потенциальными объектами MIR-30b с помощью алгоритма прогнозирования , TargetScan. Интересно, что мы обнаружили, что PAI-1 гена, который усиливается в микрочипе (3,83 раза, P
= 0.04) может быть вероятной мишенью ген микроРНК-30b (рис 4A). Для того, чтобы напрямую обратиться, связывается ли микроРНК-30b к 3'-UTR из мРНК мишеней, мы построили векторы люциферазы отчета, которые содержат предполагаемую MIR-30b сайты связывания в пределах 3'-UTR. Как показано на рисунке 4B, мы наблюдали заметное снижение активности люциферазы ( P
&л; 0,01) после того, как contransfection люциферазы векторов отчетов и микроРНК-30b мимике. В отличие от этого, не было обнаружено никаких изменений люциферазы в клетках, трансфецированных мутантными конструкциями 3'-UTR. Этот результат был впоследствии подтвержден GFP репрессии экспериментов. Как показано на фигуре 4C и 4D, GFP флуоресценции была значительно снижена в клетках, трансфицированных векторами отчета GFP, содержащих сайты связывания и микроРНК-30B мимику, в то время как не было никакого изменения GFP флуоресценции в клетках, трансфицированных мутантом векторных и микроРНК-30b мимике. Кроме того, избыточная экспрессия микроРНК-30b в AGS и ГГК-27 клеток привела к понижающей регуляции уровней протеина PAI-1 (рис 4д). Взятые вместе, выше данные свидетельствуют о том, что PAI-1 является потенциальной мишенью MIR-30b, и микроРНК-30b может понижающей регуляции целевого белка.

обратная корреляция между MIR-30b и PAI-1 выражение в желудочном раковые ткани и линии клеток рака
<р> Учитывая, что микроРНК-30b подавляется при раке желудка, и сообщалось, что PAI-1 белка в раковых тканях желудка является значительно выше, чем в неопухолевых тканях [ ,,,0],28], мы провели анализ корреляции между MIR-30b и PAI-1 экспрессии в желудочном клеточных линий рака желудка и рака тканей. Как показано на рисунке 5А сверху, ИАП-1 уровень белка был самым низким в AGS клетки среди пяти желудочных клеточных линий. В отличие от этого, уровень микроРНК-30b был самым высоким в АГС, по сравнению с другими клеточными линиями (рис 5А внизу). Затем мы исследовали PAI-1 и микроРНК-30b выражение в 21 наборов рака желудка и прилегающих к нему тканей неопухолевыми. Мы обнаружили, что 81% (17/21) из рака желудка показаны более высокие PAI-1-мРНК по сравнению с нормальными тканями. В противоположность этому, микроРНК-30b была обычно понижающей регуляции у 18 из 21 опухолей. Использование корреляционного анализа Пирсона мы наблюдали значительную обратную корреляцию между MIR-30b и PAI-1 мРНК (рис 5В, R
= -0,6475, P
= 0,0123). Приведенные выше результаты позволяют предположить, что экспрессия микроРНК-30b обратно коррелирует с PAI-1 экспрессии при раке желудка, а также расширение PAI-1 экспрессию при раке желудка может быть результатом снижения экспрессии микроРНК-30b.

PAI-1 потенциально вовлечены в микроРНК-30b-индуцированного апоптоза

Для дальнейшего изучения ли участвует PAI-1 в микроРНК-30b раскрученной апоптоза, мы сначала проверили, если глушение PAI-1 экспрессии может иметь подобный апоптоз-продвижение эффект, как микроРНК-30b избыточной экспрессии. СГК-7901 клетки были трансфицированы PAI-1 или миРНК отрицательный контроль РНК (NC) в течение 48 ч, как показано на рисунке 6, а уровни мРНК PAI-1 может быть значительно уменьшено с помощью его миРНК. Впоследствии, PAI-1 миРНК отображается очевидное увеличение апоптотической скорости в SGC-7901 клеток (рис 6b, 6с), по сравнению с MIR-контролем. Следует отметить, что PAI-1 миРНК смог фенокопии эффект микроРНК-30b сверхэкспрессии на апоптоз регуляции клеточного рака (рис 6В, 6С). Один из представителей пример точечного участка был показан на рисунке 6D. Далее, мы также исследовали ли PAI-1 может аннулирует эффект содействия апоптоз MIR-30b. СГК-7901 клетки были трансфицированы микроРНК-контрольными или микроРНК-30b имитаторов в течение 24 ч, а затем трансфекции PAI-1 Clone вектор кДНК человека ORF (указанной как PAI-1) или пустым вектором. Как показано на рисунке 6E-G, то гиперэкспрессией из PAI-1 приводило к очевидному подавления на эффекте микроРНК-30b-индуцированного апоптоза. Взятые вместе, наши результаты свидетельствуют о том, что PAI-1 потенциально участвует в микроРНК-30b раскрученной апоптоза.

Обсуждение
<р> Хотя дерегулирование микроРНК наблюдается в желудочном раковых тканях и клеточных линиях, то точный молекулярный механизм, с помощью которого микроРНК модулировать процесс онкогенеза еще полностью не выяснены. На сегодняшний день ряд микроРНК, как сообщается, функционировать в качестве онкогена в развитии рака желудка [29], [30], однако микроРНК действует в качестве генов-супрессоров опухолей необходимо дальнейшее исследование.
<Р> Здесь мы показал микроРНК-30b был понижающей регуляции в клетках рака желудка и опухолевых тканей. Наши данные также показали, что overxepression из MIR-30b может улучшить апоптоз клеток рака желудка в пробирке и в естественных условиях, и микроРНК-30b был способен подавлять рост опухоли рака желудка в естественных условиях. Кроме того, мы характеризуется PAI-1 в качестве потенциальной мишени MIR-30b, и выражение MIR-30b обратно коррелирует с PAI-1 экспрессии при раке желудка. Кроме того, PAI-1 потенциально участвуют в микроРНК-30b-индуцированного апоптоза. Выше результаты показывают, микроРНК-30b может выступать в качестве нового опухолевого супрессора путем регуляции апоптоза раковых клеток при раке желудка.
<Р> микроРНК-30b является одним из микроРНК-30 семейства, которая связана с развитием многих видов раковых заболеваний. Тем не менее, роль микроРНК-30b в онкогенеза является спорным. микроРНК-30b, как сообщалось, понижающей регуляции при раке простаты [31], опухоли мочевого пузыря инвазивная [32], анапластической рака щитовидной железы [33], рака пищевода [34], и рака легких [35], в то время как усиленную экспрессию зер- 30b был идентифицирован в медуллобластомой [36] и злокачественной мезотелиомы [37]. Кроме того, микроРНК-30b была определена в качестве одного из независимых предикторов безрецидивная пережитков гепатоцеллюлярной карциномы [38]. Так как микроРНК-30b был или повышающей регуляции или уменьшается в различных видов рака, мы можем сделать вывод о том, что микроРНК-30b могут играть различные роли как онкоген или ген-супрессор опухолей в различных раковых образований.
<Р> В текущем исследовании , мы обнаружили, что экспрессия микроРНК-30b было значительно снижено в желудочном раковых тканей и клеточных линий по сравнению с нормальными тканями желудка. В соответствии с нашим выводом, микроРНК-30b было обнаружено, что вниз выражается микроРНК массив из 184 рака желудка и 169 неопухолевой слизистая [39], и Цяо и др обнаружили, что микроРНК-30b была понижающего выражена в желудочном ткани рака и желудочные раковых клеточных линий, AGS и КУП-823 клетки [40]. Таким образом, потеря экспрессии микроРНК-30b может быть связан с патогенезом и прогрессированию рака желудка.
<Р> Апоптоз представляет собой упорядоченный процесс гибели клеток, который имеет место в физиологических и патологических состояниях. Разрушение этого хрупкого равновесия может привести к развитию рака [27]. Сейчас мало известно о влиянии MIR-30b на апоптоз в раковых заболеваний. Спорное выражение MIR-30b предполагает сложность функции MIR-30b. В последнее время, Ли и др [41] обнаружили, что микроРНК-30b была значительно снижена в ответ на стресс стимуляции окислительного и микроРНК-30b может ингибировать митохондриальный деление и последующее апоптоз. Напротив, было показано, что микроРНК-30 может ингибировать самообновление и индуцирует апоптоз опухолевых молочной железы инициирующих клеток (BT-ИС) с помощью глушителей Ubc9 и ITGB3 [42]. Выше доказательства показывают, что микроРНК-30 представляет собой многофункциональный ген, который может ингибировать или индуцировать апоптоз. В настоящем докладе, мы нашли внематочной выражение MIR-30b может индуцировать апоптоз клеток рака желудка в пробирке, а избыточная экспрессия микроРНК-30b может значительно ингибировать рост опухоли у обнаженной модели ксенотрансплантата мыши путем индукции апоптоза клеток рака желудка в естественных условиях. Выше результаты показывают, что микроРНК-30b может играть потенциальную роль в развитии рака желудка, способствуя апоптозу рака.
<Р> Чтобы изучить молекулярный механизм, лежащий в основе функции микроРНК-30b, важно определить его ген-мишень. В последнее время несколько новые цели MIR-30b было подтверждено в том числе р53 [43], как Дельта-4 [44], и Snail1 [45]. В нашем исследовании, PAI-1was идентифицированы в качестве целевого гена MIR-30b при раке желудка. ИАП-1 является ингибитором основной ТФК и УАП, и PAI-1 может блокирует активацию плазминогена. Было хорошо известно, что экспрессия PAI-1 при раке желудка выше, чем в тканях контрольных и PAI-1, может служить в качестве нового прогностическим фактором при раке желудка, прогнозируя более короткое выживание [28], [46], [47 ]. Интересно отметить, что недавно полученные данные показывает protumorigenic активность PAI-1, может быть через антиапоптического функции [22]. Наше исследование показало, что экспрессия микроРНК-30b обратно коррелирует с PAI-1 экспрессии в желудочном линиях раковых клеток и опухолевых тканей, PAI-1 избыточная экспрессия может противодействовать эффекту содействия апоптоз MIR-30b, и эктопическая экспрессия микроРНК-30b была похожа промоакций апоптозом эффект по сравнению с глушителей PAI-1 выражение. Это говорит о том, что ось микроРНК-30b-PAI-1, могут быть вовлечены в развитие рака желудка. Однако нисходящий путь необходим для дальнейшего изучения.
<Р> Развитие рака желудка характеризуется многофакторной и многоступенчатого процесса, и H. пилори
Было показано, что основной причиной рака желудка. Последние отчеты наших исследований и других исследований подчеркивается регулирующая роль микроРНК в H. пилори
инфекции и сопутствующих заболеваний. микроРНК является потенциальным мостом от H. Pylori
инфекции хронического гастрита и рака желудка [16], [48], [49]. Касательно MIR-30b, она может иметь многофункциональную в H. Pylori
инфекции и H. пилори
-associated заболеваний. Наш предыдущий отчет нашли микроРНК-30b был в состоянии регулировать процесс аутофагии путем пристреливать Atg12 и BECN1 во время H. пилори
сохраняются инфекции [19].

• PLoS ONE: внутриопухолевое IL-17-позитивных тучные клетки являются основным источником ИЛ-17, что является предикто…
• PLoS ONE: хеликобактер пилори Содействует Эпителиальные-мезенхимальных Переход в рака желудка по Downregulating Програ…