PLoS ONE: Mir-30b, Down-regulirana u rak želuca, potiče apoptozu i suzbija rast tumorskih ciljajući inhibitor aktivatora plazminogena-1

Sažetak pregled

Pozadina pregled

karcinoma želuca je jedan od Najčešće maligne bolesti u svijetu. Sve je više dokaza je pokazalo da su mikroRNA (miRNAs) povezana s razvojem tumora i napredovanje. Naši prethodne studije su pokazale da H. pylori pregled infekcija je bio u mogućnosti da se potakne promijenjena ekspresija Mir-30b u želučanim epitelnim stanicama. Međutim, malo se zna o potencijalnom ulogom Mir-30b u raka želuca. Pregled

Metode pregled

analizirali smo ekspresiju Mir-30b u želučanim staničnim linijama karcinoma i ljudskih tkiva raka želuca. ispitan je učinak miR-30b oponaša na apoptozu želučanih stanica raka in vitro pomoću protočne citometrije (fcm) i testovima caspase-3/7 aktivnosti. Golih miševa ksenograft model je korišten za određivanje je li miR-30b je uključen u nastanku tumora i raka želuca. Meta Mir-30b je identificiran bioinformatika analiza, testa za luciferazu i Western blot. Konačno, proveli smo analizu korelacije između Mir-30b i njegove ciljne izražavanja u raka želuca. Pregled

Rezultati pregled

Mir-30b bio je značajno dolje regulirano želučanih stanica raka i ljudskih tkiva raka želuca. Prisilni izraz Mir-30b promovirao apoptozu želučanih stanica raka in vitro i Mir-30b može značajno inhibiraju torn smjeru od raka želuca povećanjem apoptoze udio stanica raka in vivo. Osim toga, inhibitor aktivatora plazminogena-1 (PAI-1) identificiran je kao potencijalni cilj Mir-30b i razinu miR-30b obrnuto povezana sa PAI-1 ekspresije u raka želuca. Osim toga, odsutnost PAI-1 bio u mogućnosti phenocopy učinak miR-30b prekomjernom ekspresijom na apoptozu regulaciju stanica karcinoma, i pretjerana ekspresija PAI-1 može se potisnuti djelovanje potiče stanične apoptoze Mir-30b, što ukazuje PAI-1 potencijalno su uključeni u miR-30b-induciranu apoptozu u stanicama raka. pregled

Zaključak pregled

miR-30b može funkcionirati kao novi tumor supresorskog gena u karcinomu želuca ciljajući PAI-1 i regulaciju apoptoze stanice raka. Mir-30b mogla poslužiti kao potencijalni biomarkera i terapijskog cilja protiv raka želuca pregled

Izvor:. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) Mir-30b, Down-regulirana u rak želuca, potiče apoptozu i suzbija rast tumorskih ciljajući inhibitor aktivatora plazminogena-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10,1371 /journal.pone.0106049 pregled

Urednik: Gerolama Condorelli, Federico II Sveučilišta u Napulju, Italija, Italija pregled

Primljeno: 7. svibnja 2014. godine Prihvaćeno: 28. srpnja 2014; Objavljeno: 29. kolovoz 2014 pregled

Copyright: © 2014 Zhu et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Data Dostupnost:. The autori potvrđuju da su svi podaci na kojima se temelji nalaze u potpunosti na raspolaganju bez ograničenja. Svi relevantni podaci u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 81202310), znanstvene inovacije Research Foundation Treće Vojnomedicinsku Sveučilišta (br 2009XQN20). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

karcinoma želuca uzrokuje oko 738.000 smrtnih slučajeva u svijetu godišnje, i to je bio prepoznat kao treći vodeći uzrok raka povezanih smrti kod muškaraca [1]. Rana dijagnoza i liječenje doveli su do izvrsnih očekivanja za dugoročni opstanak i dobru prognozu, dok su izgledi za pacijente s uznapredovalim rakom želuca i dalje loš. Poput drugih vrsta raka, razvoj karcinoma želuca smatra se da je više činilaca. Helicobacter pylori (H. Pylori) pregled infekcija prepoznata biti važan pokretač karcinoma želuca [2]. Iako su mnogi genetski i Epigenetske promjene zabilježene su kod raka želuca, molekularni mehanizam u pozadini razvoja raka želuca ostaje nejasno. Pregled

mikroRNA (miRNAs) su male ne-kodiranje RNA koja posttranscriptionally reguliraju ekspresiju gena. Zreli miRNAs može specifično vežu na 3 'UTRs od ciljne stanične mRNA je pak izazvalo mRNA degradacije ili inhibiciju prijevoda [3], [4]. miRNAs djeluju kao ključni regulatori u raznim biološkim procesima, uključujući razvoj, diferencijaciju stanice, apoptoza, metabolizam i prijenos signala [5], [6]. Pokazano je da je 50% miRNAs često se nalaze na rakom genomskih regija ili krhkim mjestima [7]. Rastu dokazi su pokazala da poremećena miRNAs ekspresija korelira s raznim humanim karcinomima i pokazuje da miRNAs može djelovati kao onkogena ili tumor-supresorskih gena [8] - [10]. Nedavno je znatan broj neregulirana miRNAs uključujući Mir-106b-25 klastera, Mir-21, Mir-218, Mir-7, i Mir-335 su identificirani kao modulatori rasta stanica, apoptoza, migracije ili invazije na rak želuca razvoj [11] - [15]. Ovi rezultati ukazuju na miRNAs može odigrati ključnu ulogu u patogenezi karcinoma želuca. Pregled

Naša dosadašnja istraživanja su pokazala da H. pylori pregled infekcija je mogao izazvati promijenjena ekspresija miRNAs u želučanog epitela uključujući Mir-155, Mir-146A i Mir-30b, miRNAs može funkcionirati kao novi negativni regulatori za fino podešavanje H. pylori pregled induciranu upalu [16], [17]. Osim toga, pokazali smo da Mir-146a može igrati potencijalnu ulogu u razvoju raka želuca modulacijom proliferaciju i apoptozu želučanih stanica raka [18]. Naime, mi smo također našli Mir-30b može regulirati proces autophagy vrijeme H. pylori
ustrajati infekcije, čime se doprinosi upornosti H. pylori pregled infekcija [19]. Međutim ulozi Mir-30b u karcinomu želuca još nepoznanica. Pregled

inhibitor aktivatora plazminogena 1 (PAI-1) je glavni inhibitor serin proteaza tkiva tipa (t-PA) i urokinazni tip ( u-pA), aktivator plazminogena i stoga igra važnu ulogu u plazminogena-plazmina sustavu [20]. Prethodne studije su ilustrirani PAI-1 je loš prognostički čimbenik u nekoliko zajedničkih tumora, a povezana je s invazije i metastaziranja raka [21]. Nedavno, mnoge grupe su također otkrili da PAI-1 može poticati tumorski rast kroz inhibiciju stanične apoptoze. Na primjer, dodavanje stabilne divljeg tipa PAI-1 u ljudske stanična linija karcinoma prostate PC-3, humani promijelocitne leukemije stanične linije HL-60, pa čak i ne-tumorska stanica rezultirala značajnom inhibicijom apoptoze [22] , Kada se injektira subkutano u gole miševe s PAI-1 ekspresiju mišji fibrosarkom stanica, tumori su brzo uspostavljen, a PAI-1 deficijentnih stanice imaju potisnuta tumorogenosti [23]. Drugi izvještaj pokazao da genetski i farmakološka inhibicija PAI-1 u tumorskim staničnim linijama (HT-1080, 549, HCT-116 i MDA-MB-231) povećan spontana apoptoze, a što je zanimljivo, ugrađuju PAI-1 obaranje HT 1080 stanica na PAI-1 knockout miševa rezultirala smanjenjem tumorigenezi i dugotrajno preživljavanje u usporedbi s kontrolnim miševima [24]. Ove studije pružaju važne dokaze da PAI-1 Djeluje zaštitnu ulogu protiv tumorskih stanica apoptoza. Pregled

U trenutnoj studiji, otkrili smo da Mir-30b bio je značajno dolje regulirano želučanih stanica raka i tumorskih tkiva. Ektopijska ekspresija Mir-30b može potaknuti apoptozu želučanog stanicama raka in vitro i miR-30b može značajno inhibirati tumorogenosti želučanog raka u golih miševa modelu ksenografta. Štoviše, PAI-1 je identificirana kao potencijalne mete Mir-30b i 30b miR-inducira apoptozu i suzbijanje rasta tumora potiskujući ekspresije PAI-1. Naši rezultati ukazuju na to da Mir-30b može funkcionirati kao novi tumor supresorski gen kod raka želuca, a može biti potencijalna meta terapija za rak želuca. Pregled

materijali i postupci

Etika Izjava pregled

Sve pokusa na životinjama su odobreni od strane životinja Etičko i eksperimentalnu odbora Vojnomedicinsku Sveučilišta Trećeg. Sve operacije životinja bila izvedena pod natrijev pentobarbitala anestezijom, a učinjeni su svi napori kako bi se smanjili patnju. Studija uključuje uzorke tkiva odobrilo je Etičko pregled odbor na trećem Vojnomedicinsku Sveučilišta, te pismeni informirani pristanak koji je dobiven od svih bolesnika prije sudjelovanja. Pregled

Tissue primjeraka

U ukupno, želučanih tkiva raka i susjedne ne-tumorskih tkiva dobiveni su od bolesnika s primarnim karcinomom želuca prolaze kroz radikalnu gastrektomije na jugozapadnoj Hospital, treće Vojnomedicinsku University, Kina, i kliničko karakteristike pacijenata oboljelih od raka želuca su prikazani u tablici 1. Nakon kirurškog uklanjanja, tkiva su zamrznuti odmah u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ° C. Istraživanje je odobrilo Etičko nadzornog odbora na trećem Vojnomedicinsku Sveučilišta i informirani pristanak koji je dobiven od svih bolesnika prije sudjelovanja. Pregled

staničnih linija i kultura stanica pregled

Sve stanične linije se koriste u ovom istraživanju dobiveni su iz Šangaja Type Culture Collection kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina), ljudska želučani staničnim linijama karcinoma AGS se uzgaja u Ham F12 (Hyclone) mediju s 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), drugi želučani stanične linije raka MKN45 , HGC-27 BGC-823, SGC-7901 i bubrega ljudskog embrija (HEK) 293 stanice su uzgojene u DMEM (Hyclone), 10% FBS, svi su održavane u vlažnom inkubatoru s 5% CO _{2 na 37 ° C, kao što je ranije opisano. pregled}

kvantitativni RT-PCR pregled

Ukupna RNA se ekstrahira sa TRIZOL reagensom (Invitrogen), nakon čega je reverznom transkripcijom pomoću TaqMan analize Mirni (Ambion), s malim U6 nuklearne RNA kao unutarnji normalizacijom referencu. QRT-PCR reakcije provedene su uz slijedeće parametre: 95 ° C 2 min a zatim 40 ciklusa od 95 ° C za 15 s i 60 ° C tijekom 30 s. QRT-PCR analize za mRNA PAI-1 se izvodi pomoću PrimeScript RT-PCR pribora (Takara), kao što je sljedeće parametre: 95 ° C za 30 s, a zatim 40 ciklusa od 95 ° C u trajanju od 5 sekundi, 60 ° C 5 s i 72 ° C tijekom 30 s. MRNK razina P-aktin korištena je kao interna kontrola. Sekvence prajmera upotrijebljene su prikazani u tablici 2. pregled

Northern blot pregled

Mali veličine RNA je izolirana pomoću mirVana RNA kompleta (Ambion). Tri para kliničkim uzorcima su nasumce odabrani od 21 bolesnika za daljnju Northern blot analize. Northern blot je izveden prema standardnim postupkom kao što je prethodno [17] što je opisano. DNK oligonukleotidne antisense sonde koriste za otkrivanje Mir-30B i U6 snRNA su kako slijedi: Mir-30B (5'AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') i U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3') pregled

Cell ubacivanja.

Mir-30b oponaša, kodirani Mir-kontrolu, kemijski modificirani Mir-30b duplex (agomir), kemijski modificirane kodirani Mir-kontrole, PAI-1 siRNA ili siRNA negativne kontrole su kupljeni od GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., Kina). PAI-1 (Serpine1) Ljudski cDNA ORF Klon je kupljen od Origene (Origene Technologies, Peking, Kina). Transfekcije su provedene pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Pregled

Cell apoptoze ispitivanje FCM

SGC-7901 ili HGC-27 stanice su posađene u pločice s 12 jamica u prikladnu gustoća i narasla do 30% pokrivenosti nakon 24 sata. Potom stanice su transfektirane s miR-30b oponaša ili Mir kontrolu i medij je zamijenjen s DMEM bez seruma tijekom 48 sata. Za kotransfekcijskim eksperimenta s Mir-30b i PAI-1 eksprimira vektor, SGC-7901 stanice su transfektirane s miR kontrolu ili miR-30b oponaša, a zatim s PAI-1 ljudski cDNA ORF kloniranja vektora (navedeni kao PAI-1) ili prazan vektor 24 sata kasnije. 24 sata nakon transfekcije vektora, medij je zamijenjen s DMEM bez seruma tijekom dodatnih 24 sata. Konačno, stanice se primjenjuju na apoptoze analize. Za FCM analize, što je Annexin V-FITC Apoptoza Detection Kit sam (BD Pharmingen) koji se koristi, a zatim analiziraju pomoću protočne citometrije (BD FACSCantoTM II). Pregled

Caspase-Glo 3/7 Ispitivanje pregled

aktivnost kaspaze-3/7 detektiran je korištenjem caspase-Glo assay 3/7 (Promega). Dodati 100! -lL Caspase-Glo reagensom 3/7 do bijele stijenki s 96 jažica, pažljivo promiješati sadržaj jažice, a potom se inkubiraju jažica, na sobnoj temperaturi 30 min. Luminiscencija je detektiran pomoću GloMax-96 mikropločnom luminometru (Promega). Pregled

tumorogenosti pokusi na miševe

miševa koji se koristi u ovom eksperimentu su održavani pod specifičnim uvjetima bez patogena. Izvediv miR-30b mimics- i Mir kontrole transfektirane SGC-7901 stanice (1 × 10 ^{6) se suspendiraju u 100 ul PBS-a i potom injektira se supkutano u svaku stranu stražnjeg boka iste ženke BALB /c atimične akt miša na 4 do 6 tjedana starosti kao što je ranije [25] što je opisano. Rast tumora i stanje uključujući sveukupno zdravlje i ponašanje miševa ispitana su svaka tri dana za 4 tjedna. Tumorske donosio miševi nisu pokazivati ​​znakove boli ili nevolji, kao što su gubitak težine ili promjene u ponašanju, tako da su svi miševi su žrtvovani CO _{2 gušenje na dan 28. postubrizgavanje. Volumen tumora (V) je praćena mjerenjem duljine (L) i širinu (W) sa čeljustima i izračunato iz formule (L × W 2) × 0,5. pregled}}

TUNEL bojanja pregled

tumori pokupljene su nakon 26 dana i fiksirane u 10% otopine formaldehida, a zatim umetnute u parafin. Sekcije (5 um debljine) koji su deparafmizirani i rehidrirane su obojene s hematoksilinom i eozinom. Apoptotične tumorske stanice su obojene in situ terminal deoxynucleotidyltransferase posredovane dUTP Nick kraj označavanje (TUNEL) metodom in situ kit za detekciju stanične smrti (POD, Roche Diagnostics Co.). Negativna kontrola se podvrgne istim bojanja TUNEL bez TDT. Slike su prikupljeni pomoću mikroskopa sa × 200 uvećanjem. Pregled

Izgradnja plazmida

Izgradnja raznih luciferaze izvješća vektora za Mir-30b cilj je izvedena kao što je ranije opisano [16], [26] te konstrukt koji sadrži mutirani sjeme regiju generiran kao kontrola. Sekvence upotrijebljenih oligonukleotida su prikazane u tablici 2.

Luciferaze i GFP represija eksperimenti pregled

HEK-293 stanice su posađene na ploči od 96 jažica, po 5000 stanica po jažici, dan prije transfekcije. Stanice su transfektirane sa svakim krijesnice luciferaza reporter vektor, Renilla luciferaza kontrolnog vektor, PRL-TK (Promega), te miR-30b oponaša ili Mir-kontrole (GenePharma). Je ispitivanje luciferaze provedena je pomoću sustava reporter testu s dvostrukim luciferaze (Promega). Pregled

GFP represije eksperimente, HEK-293 stanice su nasađene u 12 jažica na 1 x 10 ^{5 na dobro dan prije transfekcije, a zatim su transfektirano s Mir-30b oponaša ili Mir-kontrole s različitim GFP reporter vektora. Stanice su podvrgnute protočne citometrijske analize, te su analizirani podaci pomoću CellQuest Pro. Pregled}

Western blot pregled

Tretirane stanice su bile isprane s ledeno hladnim PBS i lizirane pufera za lizu stanica (Probušiti). Nakon centrifugiranja na 12.000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta na 4 ° C, koncentracija proteina je određena za BCA proteinski test kit (Pierce). Proteina stanica lizati su odvojeni u 12% SDS denaturira poliakrilamidnom gelu, a zatim prenesen na polivinilidenfluorid membrane. Membrane su blokirane s 5% nemasnim suhim mlijekom u Tris-puferiranoj slanoj otopini, pH 7,4, koji sadrži 0,05% Tween 20 i inkubirane s primarnim antitijelima za PAI-1 (1:1000, Abcam) i P-aktin (1:1000 , Santa Cruz), na 4 ° C preko noći respektivno. Membrane su zatim isprane i inkubirane s peroksidaza-konjugiranog sekundarnog antitijela (1:5000, Santa Cruz) u skladu s uputama proizvođača. Protein od interesa je vizualizirana primjenom Western blot-ECL supstrata (Pierce), Chemidoc XRS dokumentiranje gelova System (BioRad). Pregled

Statistička analiza pregled

Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) iz najmanje tri neovisna pokusa. Studentov t-test je primijenjen za analizu razlika između grupa. Odnos između razine Mir-30b i PAI-1expression analizirana je pomoću Pearsonov koeficijent korelacije. Statistička analiza je izvršena sa SPSS programa (verzija 17). Statističke razlike su proglašeni značajna na P izvoznici < 0,05 razini. Statistički značajne podatke označene su zvjezdicom ( P izvoznici < 0,05 (*), P pregled. ≪ 0,01 (**) pregled

Rezultati

smanjena ekspresija Mir-30b u ljudskim staničnim linijama karcinoma želuca i uzoraka GC tkiva

Da bi se odredilo ulogu Mir-30b u patogenezi karcinoma želuca, analizirali smo razine Mir-30B u raznim želučanih stanica raka, uključujući HGC-27, AGS, BGC-823 i SGC-7901. Kao što je prikazano na slici 1A, izražavanje Mir-30b bio je značajno dolje regulirano u četiri staničnim linijama u usporedbi s bazenom od pet ne-tumorske želučanog tkiva ( p pregled. <. 0,01) pregled

izraz Mir-30b dodatno je ispitana u 21 uparenim GC i susjednih ne-tumorske želučanog tkiva kroz TaqMan kvantitativne PCR u stvarnom vremenu (QRT-PCR) Kao što je prikazano u slici 1B, smanjenje Mir-30b pronađen je u 18 od 21 pacijenata (85.7%) u usporedbi s odgovarajućim ne-tumorskih tkiva. Nadalje, raspršuju dijagram pokazali da miR-30b bio je značajno podregulirani u uzorcima raka želuca u odnosu na normalne sluznice želuca, s prosječnim padom 6,28 puta ( P pregled = 0,002) (slika 1C). Kako provjeriti podatke ekspresije stečena iz QRT-PCR, 3. svih 21 parova Uzorci su nasumično odabrali za određivanje razine Mir-30b koristi sjeverni vijak. Također smo otkrili dosljedna smanjena ekspresija Mir-30b kod raka želuca u usporedbi s ne-tumorske želučanog tkiva (Slika 1D). Ovi rezultati sugeriraju da je Mir-30b je izraz često se regulirano na rak želuca, a možda i koji su uključeni u razvoj karcinoma želuca. Pregled

Prekomjerna ekspresija Mir-30b povećava apoptozu želučanih stanica raka pregled

Jedna od odlika karcinoma je njegova sposobnost da izbjegne apoptoze [27], pa smo ispitali učinak Mir-30b na želučane stanice raka apoptoze. SGC-7901 ili HGC-27 stanice su transfektirane sa Mir-30b oponaša ili kodirane Mir-kontrolu, a vrijednost Mir-30b izvanmaternične izražavanja je potvrdio QRT-PCR (Slika 2). Tada je učinak Mir-30b na apoptozu sGC 7901 ili HGC-27 stanica je ocijenjena pomoću protočne citometrije (FCM) analiza i caspase-3/7 aktivnosti ispitivanjima. Kao što je prikazano na Slici 2B i 2C, pronašli smo udio apoptičnih stanica značajno povećana u sGC 7901 ili HGC-27 stanicama koje su transfektirane s miR-30b oponaša usporedbi s Mir kontrolu transficiranih stanica (16.08% nasuprot
8,25% do SGC-7901 stanica, a 17,83% u odnosu na pregled 10.87% na HGC-27 stanice). Nadalje, značajno povećanje kaspaze-3/7 aktivnost je pronađena u SGC-7901 ili HGC-27 stanicama koje su transfektirane s Mir-30b odnosu miR kontrolu transfektanata ( P pregled < 0.01, Slika 2D). Iznad rezultati pokazuju da prekomjerna ekspresija Mir-30b može promicati apoptozu raka želuca in vitro. Pregled

Mir-30b potiskuje torn smjeru i potiče stanice apoptoza in vivo pregled

Kako bi se dodatno utvrditi da li Mir-30b je sudjeluje u nastanku tumora raka želuca, bio korišten goli miš modelu ksenografta. Budući da smo otkrili da Mir-30b igrao značajniju ulogu u promicanju SGC-7901 stanica apoptozu od HGC-27 stanica in vitro, možemo istražiti ulogu Mir-30b u nastanku tumora raka želuca upotrebom SGC-7901 stanica. Mir-kontrolom- i miR-30b-transficirane SGC-7901 stanice injicirane su supkutano u obje stražnje strane istih miševa. Miševi su praćeni na promatranje rasta ksenografta, u trajanju od 4 tjedna. Utvrđeno je da uvođenje Mir-30b u SGC-7901 stanica dovela je do značajnog smanjenja veličine volumena tumora (slika 3A i 3B) i tumori koji potječu od Mir-30b tretira SGC-7901 stanica rasla sporije u usporedbi s kontrolom grupa tijekom cijelog razdoblja rasta tumora (Slika 3C, lijevi panel). Kada se prikupe tumori, prosječni volumen tumora koji su izvedeni iz grupe Mir-30B imitira je samo 27,87% od toga u Mir-kontrolne skupine (Slika 3C, desna ploča, P izvoznici < 0,01). Tumori pokupljene su nakon 26 dana od dvije strane stražnjeg boka istog miša, apoptoza in situ je mjerena TUNEL. Kao što je prikazano na Slici 3D tumorske rez miR-30b oponaša pomiješa ksenografta izložene značajno povećati u TUNEL pozitivnih stanica. Ovi rezultati snažno sugeriraju da uvodenje Mir-30b može inhibirati rast raka želuca promicanjem apoptozu stanica raka. Pregled

PAI-1 je meta kandidat gen Mir-30b Netlogu

Kako bi se dodatno procijeniti funkcija Mir-30b, važno je utvrditi u kojima se nalazi mRNA se regulirani Mir-30B. U prethodnoj studiji ispitali smo profil ekspresije mRNA u pet pari primarnih tumora tkiva pacijenata oboljelih od raka želuca i uparen bez tumorskih tkiva pomoću mikročipa. Potpuno, pronašli smo 303 doreguliran gena (fold promjenu do 2, P pregled < 0,05) u želučanom tkivu karcinoma u usporedbi s ne-tumorskim tkivima (podaci nisu prikazani). S obzirom na regulirani izraz Mir-30b kod raka želuca, usredotočeni smo na listi gena koji pokazuju povećanu izraze i odabrali top 30 povećana gena u karcinomu želuca, a zatim odrediti ako su ti geni su potencijalne mete Mir-30b pomoću algoritam predviđanja , TargetScan. Zanimljivo, otkrili smo da PAI-1 gena koji je reguliran u microarray (3,83 puta, P pregled = 0.04) može biti vjerojatna meta gen Mir-30b (slika 4a). Izravno se obratiti bilo Mir-30b veže s 3'-UTR od ciljne mRNA, konstruirali smo luciferaze izvješće vektora koji sadrže navodni Mir-30B vezna mjesta unutar 3 'UTR. Kao što je prikazano na Slici 4B, gledali smo značajno smanjenje aktivnosti luciferaze ( P izvoznici < 0,01), nakon contransfection luciferaze vektora izvješća i Mir-30b oponaša. Nasuprot tome, nikakve promjene luciferaze opažena je u stanicama koje su transfektirane s mutantnim 3'-UTR konstrukata. Ovaj rezultat je kasnije potvrđeno GFP represije eksperimenata. Kao što je prikazano na slici 4C i 4D, GFP fluorescencija se znatno smanjila u stanicama koje su transfektirane sa GFP izvješća vektore koji sadrže mjesta za spajanje i miR-30b imitiraju, dok nije bilo promjene u GFP fluorescencije u stanicama koje su transfektirane s mutantnim vektor i miR-30b oponaša. Nadalje, pojačanom ekspresijom Mir-30b u AGS i HGC-27 stanica rezultirala down-regulacije razine bjelančevina PAI-1 (slika 4E). Uzeti zajedno, gornji podaci pokazuju da PAI-1 je potencijalna meta za Mir-30b, a Mir-30b može se regulirati ciljni protein. Pregled

Inverse korelacija između Mir-30b i PAI-1 ekspresije u želučanom raka tkiva i stanične linije raka

s obzirom da miR-30b je podregulirao u karcinomu želuca, a objavljeno je da PAI-1 proteina u želučanom tkivu raka je značajno viša nego u ne-tumorskih tkiva [ ,,,0],28], proveli smo analizu korelacije između Mir-30b i PAI-1 ekspresije u želučanim staničnih linija raka i želučane tkiva raka. Kao što je prikazano na slici 5A vrhu, PAI-1 na razini proteina bila je najmanja u AGS stanici između pet staničnih linija želuca. Nasuprot tome, razina Mir-30b bio je najveći u AGS, u usporedbi s drugim staničnim linijama (slika 5A dolje). Nakon toga, ispitali smo PAI-1 i Mir-30B izraz u 21 kompleta raka želuca i susjednih ne-tumorskih tkiva. Otkrili smo da je 81% (17/21) želučanog karcinoma prikazuje višu PAI-1 mRNA u usporedbi s normalnim tkivom. Nasuprot tome, Mir-30b je obično dolje reguliran 18 od 21 tumora. Korištenje Pearsonov korelacijska analiza, gledali smo značajnu inverznu korelaciju između Mir-30b i PAI-1 mRNA (slika 5B, R pregled = -0,6475, P pregled = 0.0123). Iznad rezultati ukazuju na to da Mir-30b izraz je obrnuto proporcionalna s PAI-1 ekspresije kod raka želuca, a poboljšana PAI-1 ekspresiju u raka želuca može biti rezultat smanjene ekspresije Mir-30b. Pregled

PAI-1 potencijalno uključena u mir-30b-inducirana apoptoza Netlogu

Kako bi se dodatno istražiti da li PAI-1 je uključen u mir-30b-promiče apoptoze, prvo smo testirali ako je odsutnost PAI-1 ekspresije mogu imati sličan apoptoza poticanje učinak kao mir-30b prekomjernom ekspresijom. SGC-7901 stanice su transfektirane s PAI-1 siRNA ili negativna kontrola RNA (NC) za 48h kao što je prikazano na slici 6A, razine mRNA PAI-1, mogu se znatno smanjiti njegovu siRNA. Nakon toga, PAI-1 siRNA prikazuju očite povećava u apoptoze stope u SGC-7901 stanica (Slika 6b, 6c), u usporedbi s Mir-kontrolu. Naime, PAI-1 siRNA bio u mogućnosti da phenocopy učinak Mir-30b prekomjernom ekspresijom na apoptozu regulaciju stanica raka (Slika 6b, 6c). Jedan reprezentativni primjer točkastog grafikona prikazan je na slici 6D. Dalje, mi također ispituje da li PAI-1 mogao ukinuti učinak promicanja apoptoze Mir-30B. SGC-7901 stanice su transfektirane s miR kontrolu ili miR-30b oponaša 24 sata, a potom slijedi transfekcija s PAI-1 ljudski cDNA ORF kloniranja vektora (kao što je označeno PAI-1) ili praznim vektorom. Kao što je prikazano na slici 6E-G je prekomjernom ekspresijom u PAI-1 dovodi do očitog suzbijanje o utjecaju miR-30b-inducirane apoptoze. Uzeti zajedno, naši rezultati ukazuju na to da PAI-1 je potencijalno uključena u Mir-30b-promiče apoptoze. Pregled

Rasprava pregled

Iako je primijetio deregulacija miRNAs u želučanim tkiva raka i stanične linije, točan molekularni mehanizam, kojim miRNAs modulirati proces tumorigenesis još nije u potpunosti razjašnjen. Do danas, niz miRNAs je izvijestila da funkcionira kao onkogena u razvoju raka želuca [29], [30], no miRNAs djeluje kao tumor supresorski geni trebaju dodatno istražiti. Pregled

Evo, mi pokazala mir-30b je dolje regulirano u želučanim stanicama raka i tumorskih tkiva. Naši podaci također pokazuju da overxepression Mir-30b može poboljšati apoptozu želučanih stanica raka in vitro i in vivo, te miR-30b bio je u mogućnosti suzbiti rast tumora raka želuca in vivo. Mi i dalje karakterizira PAI-1 kao potencijalni cilj Mir-30b, a izraz Mir-30b obrnuto povezana sa PAI-1 ekspresije u raka želuca. Osim toga, PAI-1 potencijalno je uključen u miR-30b apoptozi. Iznad rezultati sugeriraju Mir-30b može djelovati kao novi tumor supresor reguliranjem apoptozu stanica raka kod raka želuca. Pregled

Mir-30b je jedna od Mir-30 obitelj koja je povezana s razvojem mnogih vrsta karcinoma. Međutim, uloga Mir-30b u nastanku tumora je sporno. Mir-30b je izvijestila da se dolje regulirana raka prostate [31], invazivni tumor mokraćnog mjehura [32], anaplastični rak štitnjače [33], raka jednjaka [34], i raka pluća [35], dok su pojačane ekspresije miR- 30b je identificiran u meduloblastom [36] i maligni mezoteliom [37]. Osim toga, Mir-30b je identificiran kao jedan od nezavisnih prediktora za recidiva bez preživjelima od hepatocelularnog karcinoma [38]. Od Mir-30b je bilo regulira prema gore ili smanjene u različite oblike raka, mogli bismo zaključiti da je Mir-30b može imati različite uloge kao onkogena ili gena za suzbijanje tumora u različitim oblicima raka. Pregled

U trenutnoj studiji , otkrili smo da mir-30b izražavanje bilo značajno smanjena u želučanom tkivu raka i staničnim linijama u usporedbi s normalnim želučanog tkiva. U skladu s našim saznanjima, Mir-30b je utvrđeno da se dolje izraziti mikrornk niz od 184 želučanog raka i 169 ne-tumorske sluznica [39] i Qiao sur otkrili da Mir-30b je dolje izražena u želučanom tkivu karcinoma i želučani stanične linije raka, AGS i BGC-823 stanice [40]. Stoga, gubitak miR-30b ekspresije može biti povezano s patogenezom i napredovanje raka želuca, pregled

Apoptoza je odredio proces smrti stanice koji se javlja u fiziološkim i patološkim uvjetima. Poremećaj ove osjetljive ravnoteže može dovesti do razvoja raka [27]. Sada se malo zna o učinku Mir-30b na apoptozu u rak. Kontroverzni izraz Mir-30b sugerira složenost funkcije Mir-30B. Nedavno, Li i sur [41] je utvrdio da Mir-30b je značajno smanjen odgovor na stimulaciju oksidativnog stresa, a Mir-30b može inhibirati mitohondrijsku fisije i slijedi apoptoza. Naprotiv, pokazalo se da je Mir-30 može inhibirati samoobnovu i izazivaju apoptozu dojke tumor pokretanje stanica (BT-ICS) by utišavanje Ubc9 i ITGB3 [42]. Iznad dokazi ukazuju na to da Mir-30 je multifunkcijski gen koji može inhibirati ili inducirati apoptozu. U tekućem izvještaju, pronašli smo izvanmaterničnu izraz Mir-30b može inducirati apoptozu želučanih stanica raka in vitro, te izražajnost Mir-30b može značajno inhibiraju rast tumora kod golih miševa modelu ksenografta pomoću poticanja apoptoze želučanih stanica raka in vivo. Iznad nalaza ukazuju na to da Mir-30b može igrati potencijalnu ulogu u razvoju raka želuca promicanjem apoptozu od raka. Pregled

Kako bi istražili molekularni mehanizam u podlozi Mir-30b funkciju, važno je odrediti ciljnu gen. Nedavno je nekoliko novih meta za Mir-30b potvrđena uključujući p53 [43], Delta-kao 4 [44], a Snail1 [45]. U našoj studiji, Pai-1was identificiran kao ciljni gen Mir-30b u raka želuca. PAI-1 je inhibitor glavni tPA i uPA i PAI-1 može blokira aktivaciju plazminogena. To je dobro dokumentirano da ekspresija PAI-1 je veća u karcinomu želuca nego u kontrolnih tkiva i PAI-1 može poslužiti kao novo prognostički faktor kod raka želuca, predviđajući kraće preživljavanje [28], [46], [47 ]. Zanimljivo, novi dokazi pokazuju da protumorigenic aktivnost PAI-1 može biti kroz antiapoptotsku funkcije [22]. Naše je istraživanje pokazalo da je Mir-30b izraz obrnuto povezana sa PAI-1 ekspresije u rak želuca staničnim linijama i tumorskih tkiva, PAI-1 pojačana ekspresija može umanjiti učinak promicanja apoptoze Mir-30b, a ektopično izraz Mir-30B imao slično promoviranje-apoptoza učinak u usporedbi s utišavanje PAI-1 izraz. To sugerira da je Mir-30b-PAI-1 osi mogu biti uključeni u razvoj karcinoma želuca. Međutim, nizvodno put je potrebno da se dodatno istražiti. Pregled

Razvoj karcinoma želuca karakterizira više-faktorski i višestupanjske procesa i H. pylori pregled Pokazalo se da glavni uzrok raka želuca. Nedavna izvješća naših istraživanja i druge studije naglasili su regulatornu ulogu miRNAs u H. pylori
infekcije i povezanih bolesti. Mirna je potencijalni most H. pylori pregled infekcija do kroničnog gastritisa i želučanog raka [16], [48], [49]. S obzirom na Mir-30b, možda je multi-funkcije u H. pylori pregled, infekcija i H. pylori
-associated bolesti. Naša prethodna izvješća pronađeno Mir-30b je u stanju regulirati proces autophagy ciljajući ATG12 i BECN1 u H. pylori
oduprijeti infekcije [19].