PLOS ONE: MIR-30b, nedregleras i magcancer Främjar Apoptos och dämpar tumörtillväxt genom att rikta plasminogenaktivatorinhibitor-1

Abstrakt

Bakgrund

Gastric cancer är en av de vanligaste maligna sjukdomar i världen. Emerging bevis har visat att mikroRNA (miRNA) är associerade med tumörutveckling och progression. Våra tidigare studier har visat att H. pylori
infektion kunde förmå den ändrade uttrycket av MIR-30b i gastric epitelceller. Men lite är känt om den potentiella rollen av MIR-30b i magcancer.

Metoder

Vi analyserade uttrycket av MIR-30b i gastriska cancercellinjer och humana magcancer vävnader. Vi undersökte effekten av MIR-30b härmar på apoptos av gastric cancerceller in vitro med flödescytometri (FCM) och kaspas-3/7-aktivitetsanalyser. Nakenmus xenograft modell användes för att bestämma huruvida miR-30b är involverad i tumörgenes av gastrisk cancer. Målet för MIR-30b identifierades genom bioinformatik analys, luciferas analys och Western blot. Slutligen genomförde vi korrelationsanalys mellan MIR-30b och dess mål uttryck i magcancer.

Resultat

MIR-30b var betydligt nedregleras i gastric cancerceller och humana magcancer vävnader. Påtvingad uttryck av MIR-30b främjat apoptos av gastric cancerceller in vitro, och MIR-30b kan hämma tumörbildning av magcancer genom att öka apoptos andelen cancerceller i vivo. Dessutom har plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) identifierats som potentiella mål för MIR-30b, och MIR-30b nivån omvänt korrelerad med PAI-1 uttryck i magcancer. Dessutom, tysta PAI-1 kunde phenocopy effekten av MIR-30b uttryck på apoptos reglering av cancerceller, och överuttryck av PAI-1 kan undertryckte verkan är att främja cell apoptos genom MIR-30b, vilket tyder på PAI-1 är potentiellt involverade i mIR-30b-inducerad apoptos på cancerceller.

Slutsats

miR-30b kan fungera som ett nytt tumörsuppressorgen i gastric cancer genom att rikta PAI-1 och reglera apoptos hos cancerceller. MIR-30b skulle kunna tjäna som en potentiell biomarkör och terapeutiska mål mot magcancer

Citation. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) MIR-30b, nedreglerade i magcancer Främjar Apoptos och dämpar tumörtillväxt genom att rikta plasminogenaktivatorinhibitor-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10.1371 /journal.pone.0106049

Redaktör: Gerolama Condorelli, Federico II-universitetet i Neapel, Italien, Italien

emottagen: 7 maj 2014; Accepteras: 28 juli 2014. Publicerad: 29 augusti, 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet. Det författarna bekräftar att all data som ligger till grund resultaten är helt utan begränsning. Alla relevanta uppgifter finns inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (nr 81.202.310), vetenskaplig innovation Research Foundation i tredje militära Medical University (nr 2009XQN20). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Magcancer orsakar cirka 738 tusen dödsfall i världen per år, och det har erkänts som den tredje ledande orsaken till cancerrelaterad död hos män [1]. Tidig diagnos och behandling har lett till goda förväntningar för långsiktig överlevnad och god prognos, medan utsikterna för patienter med avancerad magsäckscancer är fortfarande dålig. Liksom andra cancerformer, är utvecklingen av magcancer tros vara beroende av flera faktorer. Helicobacter pylori (H. Pylori) Review infektion har erkänt att vara en viktig trigger för magcancer [2]. Även om många genetiska och epigenetiska förändringar har rapporterats i magcancer, är fortfarande oklart den molekylära mekanismen som ligger bakom utvecklingen av magcancer.

mikroRNA (miRNA) är små icke-kodande RNA som posttranscriptionally reglerar genexpression. Mogna miRNA kan binda specifikt till 3 'UTR av mål cellulär mRNA i sin tur utlöser mRNA nedbrytning eller hämning av translation [3], [4]. miRNA fungerar som viktiga regulatorer i ett stort antal biologiska processer såsom utveckling, celldifferentiering, apoptos, metabolism och signaltransduktion [5], [6]. Det har visats att 50% av miRNA ofta är belägna vid cancerassocierade genomregioner eller i instabila områden [7]. Växande bevis har visat att avvikande miRNA uttryck korrelerar med olika humana cancerformer och indikerar att miRNA kan fungera som onkogener eller tumörsuppressorgener [8] - [10]. Nyligen har ett stort antal avreglerade miRNA inklusive MIR-106b-25 kluster, MIR-21, MIR-218, MIR-7, och MIR-335 har identifierats som modulatorer av celltillväxt, apoptos, migration, eller invasion i magcancer utveckling [11] - [15]. Dessa resultat tyder på att miRNA kan spela en avgörande roll i patogenesen av magcancer.

Våra tidigare studier har visat att H. pylori
infektion kunde inducera förändrat uttryck av miRNA i gastric epitelceller inklusive miR-155, MIR-146a och MIR-30b, kan miRNA fungera som nya negativa regulatorer för att finjustera H. pylori
inducerad inflammation [16], [17]. Dessutom visade vi att MIR-146a kan spela potentiella roll i utvecklingen av magcancer genom att modulera proliferation och apoptos av gastric cancerceller [18]. Särskilt fann vi även MIR-30b kan reglera autophagy process under H. pylori
kvar infektion och därigenom bidra till den fortsatta H. pylori
infektioner [19]. Men rollen av MIR-30b i magcancer är fortfarande till stor del okända.

plasminogenaktivitetsinhibitor en (PAI-1) är huvud serinproteasinhibitor av vävnadstyp (t-PA) och urokinas-typ ( u-PA) plasminogenaktivator och spelar därför en viktig roll i den plasminogen-plasmin-systemet [20]. Tidigare studier har visat PAI-1 är en dålig prognostisk faktor för flera vanliga tumörer, och är associerad med cancerinvasion och metastas [21]. Nyligen många grupper har också funnit att PAI-1 kan främja tumörtillväxt genom hämning av cell apoptos. Till exempel, tillsats av en stabil vild-typ-PAI-1 till den humana prostatacancer-cellinje PC-3, den humana promyelocytiska leukemicellinjen HL-60 och till och med icke-tumörceller, resulterade i en signifikant inhibering av apoptos [22] . När de injiceras subkutant i nakna möss med PAI-1-överuttryckande murina fibrosarkomceller, var tumörerna snabbt etablerat, medan PAI-1-saknande celler hade en undertryckt tumorigenicitet [23]. En annan rapport visade att genetisk och farmakologisk hämning av PAI-1 i humana tumörcellinjer (HT-1080, A549, HCT-116, och MDA-MB-231) ökade spontan apoptos, och intressant, implanteras PAI-1 knockdown HT 1080 celler till PAI-1 knockoutmöss resulterade i minskad tumörbildning och förlängd överlevnad jämfört med kontrollmöss [24]. Dessa studier ger viktig bevis för att PAI-1 utövar en skyddande roll mot tumörcellen apoptos.

I aktuella studien fann vi att MIR-30b var betydligt nedregleras i gastric cancerceller och tumörvävnad. Ektopiskt uttryck av MIR-30b skulle kunna främja apoptos av magcancer cell in vitro, och MIR-30b kan hämma tumörbildning av magcancer i naken mus xenograft modell. Dessutom har PAI-1 identifierats som potentiella mål för MIR-30b och miR-30b kan inducera apoptos och undertrycka tumörtillväxt genom att undertrycka expressionen av PAI-1. Våra resultat tyder på att MIR-30b kan fungera som en ny tumörsuppressorgen i magcancer och kan vara en potentiell terapi mål för magcancer.

Material och metoder

Etik Statement

Alla djurförsök godkändes av Animal etiska och experimentell kommitté tredje militära Medical University. Alla djur kirurgi utfördes under natriumpentobarbital anestesi, och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet. Studien involverar vävnadsprover godkändes av etikprövningsnämnden i tredje militära Medical University, och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter innan deltagande.

Vävnadsprover

Totalt, magcancer vävnader och angränsande icke-tumörvävnad erhölls från patienter med primär magsäckscancer som genomgår radikala gastrektomi på Southwest Hospital, tredje militära Medical University, Kina, och clinicopathologic egenskaperna hos mag cancerpatienter sammanfattas i tabell 1. Efter kirurgiskt avlägsnande ades vävnaderna frystes omedelbart i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C. Studien godkändes av etikprövningsnämnd på tredje militära Medical University, och informerat samtycke erhölls från alla patienter innan deltagande.

Cellinjer och cellkultur

Alla cellinjer som används i denna studie erhölls från Shanghai Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), den mänskliga gastric cancercellinjer AGS odlades i Hams F12 (Hyclone) medium med 10% fetalt bovint serum (FBS), andra gastric cancercellinjer MKN45 , HGC-27, BGC-823, SGC-7901 och humana embryonala njur (HEK) 293-celler odlades i DMEM (Hyclone) med 10% FBS, de var alla hålls i en fuktad inkubator innehållande 5% CO _{2 vid 37 ° C såsom beskrivits tidigare.}

Kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA extraherades med Trizol-reagens (Invitrogen), följt av en omvänd transkription med användning av TaqMan-miRNA analyser (Ambion), med U6 liten nukleär RNA som en intern normaliserat referens. QRT-PCR-reaktioner utfördes med användning av följande parametrar: 95 ° C under 2 min följt av 40 cykler av 95 ° C under 15 s och 60 ° C under 30 s. QRT-PCR-analyser för mRNA av PAI-1 utfördes med användning av PrimeScript RT-PCR-kit (Takara), som följande parametrar: 95 ° C under 30 s följt av 40 cykler av 95 ° C under 5 s, 60 ° C i 5 s och 72 ° C under 30 s. MRNA-nivån av β-aktin användes som en intern kontroll. Sekvenserna för primrarna som används visas i tabell 2.

Northern blot

Anordningar små RNA isolerades med användning av Mirvana RNA Isolation kit (Ambion). Tre par av kliniska prover valdes slumpmässigt vald från de 21 patienter för efterföljande Northern blot-analys. Northern blöt utfördes enligt standardproceduren som tidigare [17] descried. DNA-oligonukleotiden antisensprober används för att detektera miR-30b och U6 snRNA var följande: miR-30b (5'AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') och U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3') katalog

Cell transfektion.

mIR-30b härmar, scrambled mIR-kontroll, kemiskt modifierade mIR-30b duplex (agomir), kemiskt modifierade oordning mIR-kontroll, PAI-1 siRNA eller siRNA negativ kontroll köptes från GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., Kina). PAI-1 (Serpine1) Human cDNA ORF Clone köptes från Origene (Origene Technologies, Beijing, Kina). Transfektioner utfördes med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) enligt tillverkarens protokoll.

Cell apoptos analys genom FCM

SGC-7901 eller HGC-27-celler ympades i 12-brunnar vid en lämplig densitet och odlades till 30% konfluens efter 24 h. Då celler transfekterades med MIR-30b härmar eller miR-kontroll, och mediet ersattes med serumfritt DMEM under 48 timmar. För samtransfektion experiment med MIR-30b och PAI-1 uttryckande vektor, var SGC-7901-celler transfekterade med MIR-styr- eller miR-30b härmar, och sedan med PAI-1 Human cDNA ORF Klon vektor (indikerad som PAI-1) eller tom vektor 24 timmar senare. 24 h efter vektor transfektion, ersattes mediet med serumfritt DMEM i ytterligare 24 timmar. Slutligen ades cellerna appliceras på apoptos-analys. För FCM-analys, en Annexin V-FITC Apoptos Detection Kit I (BD Pharmingen) användes, analyserades sedan genom flödescytometri (BD FACSCantoTM II).

Caspase-Glo 3/7 Assay

aktiviteten av caspas-3/7 detekterades med användning av den kaspas-Glo 3/7 Assay (Promega). Tillsätt 100 pl av Caspase-Glo 3/7 reagens till vitt väggar 96-brunnar, blanda försiktigt innehållet i brunnarna, och sedan inkubera brunnarna i rumstemperatur under 30 min. Luminiscensen detekterades med användning av den GloMax-96 Microplate Luminometer (Promega).

tumorigenicitet analyser i nakna möss

möss användes i detta experiment upprätthölls under specifika patogenfria betingelser. Livskraftig miR-30b mimics- och MIR-kontroll-transfekterade SGC-7901 celler (1 x 10 ^{6) suspenderades i 100}

• PLOS ONE: intratumör IL-17-positiva Mastceller är den största källan till IL-17 Det förutsäger överlevnad i ventrikelcancer Patients
• PLOS ONE: Helicobacter pylori Främjar Epithelial-Mesenkymala Övergång vid ventrikelcancer genom nedreglering programmerad celldöd Protein 4 (PDCD4)