PLoS ONE: Pasaulis-30b, žemyn reguliuojama skrandžio vėžio, skatina apoptozę ir slopina naviko augimą nukreipiant plazminogeną aktyvatoriaus inhibitoriaus-1

Anotacija

Fonas

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių ligų visame pasaulyje. Kylančios faktais įrodyta, kad mikro RNR (miRNAs) yra susijęs su naviko vystymąsi ir progresavimą. Mūsų ankstesni tyrimai atskleidė, kad H. pylori
infekcija buvo gali sukelti pakeista išraiška miR-30b skrandžio epitelinių ląstelių. Tačiau mažai žinoma apie galimą vaidmenį PPN-30b skrandžio vėžio.

Metodai

Tyrėme PPN-30b išraišką skrandžio vėžio ląstelių linijų ir žmogaus skrandžio vėžio audiniuose. Mes išnagrinėjo Pasaulis-30B imituoja poveikį skrandžio vėžio ląstelių apoptozę vitro tėkmės citometrijos (FCM) ir kaspazės-3/7 Aktyvumas tyrimus. Nuogas pelės svetimo transplantanto modelis buvo naudojamas nustatyti, ar miR-30b dalyvauja tumorigenezei skrandžio vėžio. MiR-30b tikslas buvo žymimas bioinformatikos analizės, liuciferazės tyrimo ir Western Blot. Galiausiai, mes atliko koreliacinę analizę tarp miR-30b ir jos tikslinės raiškos skrandžio vėžio.

Rezultatai

Pasaulis-30b buvo gerokai žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ląstelių ir žmogaus skrandžio vėžio audiniuose. Vykdomas išraiška miR-30b skatinamas skrandžio vėžio ląstelių apoptozę in vitro, ir miR-30b galėtų reikšmingai slopina tumorogeniš- skrandžio vėžio didinant apoptozę dalį vėžinių ląstelių in vivo. Be to, plazminogeno aktyvatoriaus inhibitoriaus-1 (PAI-1) buvo nustatyta kaip tapti taikiniu miR-30b, ir miR-30b lygis buvo atvirkščiai koreliuoja su PAI-1 ekspresija skrandžio vėžio. Be to, triukšmo slopinimo PAI-1 galėjo phenocopy miR-30b raiškos poveikį apoptozės reguliavimo vėžinių ląstelių, ir raiškos PAI-1 gali slopino skatinti ląstelių apoptozės efektą miR-30b, nurodant PAI-1 yra potencialiai dalyvauja Pasaulis-30b sukeltos apoptozės nuo vėžinių ląstelių.

Išvada

Pasaulis-30b gali veikti kaip naują auglio slopinamojo geno skrandžio vėžio nukreipiant PAI-1 ir reguliuojant apoptozę vėžio ląstelės. Pasaulis-30b galėtų būti potencialus biologinis žymuo ir terapinio tikslo prieš skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Zhu El-D, Li N Li B-S Li W Zhang W-J Mao X yra H, et al., (2014) Pasaulis-30b, žemyn reguliuojama skrandžio vėžio, skatina apoptozę ir slopina naviko augimą nukreipiant plazminogeną aktyvatoriaus inhibitoriaus-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. Doi: 10,1371 /journal.pone.0106049

redaktorius: Gerolama CONDORELLI Federico II universiteto Napolis, Italija, Italija

Įstojo: Gegužės 7, 2014; Priėmė: Lie 28, 2014 m Paskelbta rugpjūčio 29, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Zhu et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

Finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81.202.310), Mokslo inovacijų mokslinių tyrimų fondo trečiųjų Karo medicinos universiteto (Nr 2009XQN20). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys sukelia apie 738.000 mirčių visame pasaulyje per metus, ir tai buvo pripažinta trečioji pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirties vyrai [1]. Ankstyva diagnozė ir gydymas lėmė puikus lūkesčius ilgalaikiam išlikimui ir geros prognozės, o pacientų perspektyvos sergantys išplitusiu skrandžio vėžiu išlieka prasta. Kaip ir kitų vėžio formų, skrandžio vėžio vystymąsi yra manoma, kad daugelis veiksnių. (Pylori O). Helicobacter pylori
infekcijos buvo pripažintas svarbiu sukelti skrandžio vėžio [2]. Nors daugelis genetinių ir Epigenetiniai pokyčiai buvo pranešta apie skrandžio vėžį, molekulinė mechanizmo, lemiančio skrandžio vėžio vystymąsi lieka neaiškus.

mikro RNR (miRNAs) yra mažų ne kodavimo RNR kad posttranscriptionally reguliuoti genų ekspresiją. Brandaus miRNAs gali specialiai jungiasi prie 3 'UTRs tikslinės ląstelių mRNR savo ruožtu suaktyvina iRNR savybių blogėjimą arba slopina vertimas [3], [4]. miRNAs veikti kaip pagrindinius reguliuotojams įvairių biologinių procesų, įskaitant plėtrą, ląstelių diferenciacijos, apoptozės, metabolizmo ir signalo perdavimas [5], [6]. Buvo įrodyta, kad 50% miRNAs yra dažnai yra ne vėžio-susijęs genomo regionuose arba silpnų vietų [7]. Vis daugėja įrodymų matyti, kad neįprastų miRNAs išraiška koreliuoja su įvairiais žmogaus vėžio ir rodo, kad miRNAs gali veikti kaip onkogenų ar naviko slopintuvas genų [8] - [10]. Neseniai nemažai nereguliuojamų miRNAs įskaitant miR-106b-25 grupėje, PPN-21, PPN-218, PPN-7, ir Pasaulis-335 buvo nustatyta, moduliatoriai ląstelių augimą, apoptozės, migracijos, ar invazijos skrandžio vėžio plėtra [11] - [15]. Šie rezultatai rodo, kad miRNAs gali suvaidinti lemiamą vaidmenį skrandžio vėžio patogenezėje.

Mūsų ankstesni tyrimai atskleidė, kad H. pylori
infekcija galėjo sukelti pakitusi išraišką miRNAs skrandžio epitelinių ląstelių, įskaitant miR-155, PPN-146A ir miR-30B, miRNAs gali veikti kaip naujų neigiamų reguliatoriai suderins h. pylori
indukuotų uždegimas [16], [17]. Be to, mes parodė, kad Pasaulis-146A gali žaisti galimą vaidmenį plėtojant skrandžio vėžio moduliuoja platinimu ir apoptozę skrandžio vėžio ląstelių [18]. Pažymėtina, kad mes taip pat nustatė, Pasaulis-30b galėtų reguliuoti autofagija procesą H metu. pylori
išlieka infekcijos, taip prisidedant prie H atkaklumo. pylori
infekcijos [19]. Tačiau miR-30b skrandžio vėžio vaidmuo yra vis dar nėra plačiai žinomas.

plazminogeno aktyvatoriaus inhibitoriaus 1 (PAI-1) yra pagrindinis serino proteazės inhibitorius audinių tipo (t-PA) ir urokinazės-tipo ( U-MA) plasminogeno aktyvatorius ir todėl vaidina svarbų vaidmenį plasminogeno-plazmino sistemos [20]. Ankstesni tyrimai iliustruoja PAI-1 yra prasta prognostinis faktorius keliose bendrų navikų, ir yra susijęs su vėžio invazijos ir metastazių [21]. Pastaruoju metu daug grupių, taip pat nustatė, kad "PAI-1 gali skatinti navikų augimą slopina ląstelės apoptozės. Pavyzdžiui, papildymas stabilios laukinio tipo PAI-1 į žmogaus prostatos vėžys ląstelių linijos PC-3, žmogaus promielocitinės leukemijos ląstelių linija HL-60 ir net ne-tumoural ląstelės, labai stipriai slopina apoptozę [22] , Kai švirkščiamas po oda į nuogas pelių PAI-1 ekspresija pelių fibrosarkoma ląsteles, augliai buvo greitai nustatytos, o PAI-1 trūkumu ląstelės turėjo nutylėtų tumorogeniš- [23]. Kitas ataskaita parodė, kad genetiniai ir farmakologinis slopinimas PAI-1 žmonių navikinių ląstelių linijoms (HT-1080, A549, HTC-116, ir MDA-MB-231) padidėjo spontaniškas apoptozė ir įdomiai, implantuoti PAI-1 nokdaunas HT 1080 ląstelės į PAI-1 nokautas pelių sumažėjo tumorigenezei ir ilgesnį išlikimą, lyginant su kontrolinės pelių [24]. Šie tyrimai teikia svarbią įrodymų, kad PAI-1 daro apsauginį vaidmenį nuo naviko ląstelių apoptozę.

dabartiniu tyrimu, mes nustatėme, kad Pasaulis-30b buvo gerokai žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ląstelių ir navikų audiniuose. Negimdinis išraiška miR-30B gali skatinti skrandžio vėžio ląstelių apoptozę in vitro ir Pasaulis-30b galėtų reikšmingai slopina tumorogeniš- skrandžio vėžio nuogas pelės ksenografiniuose modelį. Be to, PAI-1, buvo nustatyta, kad galimų tikslų miR-30b, ir miR-30b gali sukelti apoptozę ir slopinti auglio augimą, represuoti, kad PAI-1 išraiška. Mūsų rezultatai rodo, kad Pasaulis-30b gali veikti kaip naują auglio slopinamojo geno skrandžio vėžio ir gali būti potencialus terapija taikiniu skrandžio vėžio.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Visi eksperimentus su gyvūnais patvirtino gyvūnų etikos ir eksperimentinės komiteto Trečiojo karo medicinos universitete. Visi Gyvūnų chirurgija buvo atlikta pagal natrio pentobarbitalio anestezijos ir buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų. Tyrimas susijęs audinių pavyzdžius patvirtino Etikos ekspertizės valdyba trečiosioms Karo medicinos universitete, parašyta informuotas sutikimas buvo gautas iš visų pacientų, prieš dalyvavimą.

Audinių pavyzdžius

Iš viso skrandžio vėžio servetėlės ir gretimų ne navikų audiniuose, buvo gauti iš pacientams, sergantiems pirmine skrandžio vėžio atliekama radikali pašalintas skrandis ne Pietvakarių ligoninė, Trečiojo karo medicinos universitetas, Kinija, ir clinicopathologic charakteristikas skrandžio vėžiu sergantiems pacientams yra apibendrinti 1 lentelėje Po chirurginio pašalinimo, audiniai buvo įšaldyti iš karto skystame azote ir saugomi -80 ° C temperatūroje. Tyrimas patvirtino Etikos aspektų vertinimo valdybos Trečiojo karo medicinos universiteto ir sutikimas buvo gautas iš visų pacientų, prieš dalyvavimą.

Mobilaus ryšio linijų ir ląstelių kultūros

Visi ląstelių linijas, naudojami šiame tyrime buvo gauti iš Šanchajaus tipas kultūros kolekcijos Kinijos mokslų akademija (Šanchajus, Kinija), žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, AGS buvo kultivuojamos Ham F12 (Hyclone) vidutinio su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS), kitų skrandžio vėžio ląstelių linijas MKN45 , HGC-27, BGC-823, SGC-7901 ir žmogaus embriono inkstų (HEK) 293 ląstelės buvo auginamos DMEM (Hyclone) su 10% FBS, jie visi buvo prižiūrimi drėgnoje inkubatoriuje, kuriame yra 5% CO _{2 metu 37 ° C temperatūroje, kaip aprašyta anksčiau.}

Kiekybinė PGR

viso RNR buvo ekstrahuojamas Trizol reagento (Invitrogen), po to atvirkštinės transkripcijos naudojant TaqMan Mirna tyrimai (Ambion), su U6 mažas branduolinės RNR kaip vidaus normalaus nuoroda. KRL-PGR reakcijos buvo atliekama naudojant šiuos parametrus: 95 ° C temperatūroje 2 min, po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 15 s ir 60 ° C temperatūroje 30 s. KRL-PGR tyrimus, siekiant PAI-1 mRNR buvo atlikta naudojant PrimeScript RT-PGR rinkiniai (TAKARA), kaip parodyta toliau pateiktoje parametrais: 95 ° C temperatūroje 30 s, po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 5 S, 60 ° C 5 s ir 72 ° C temperatūroje 30 s. Lygis mRNR beta-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Į gruntai naudojami sekos yra parodyta 2 lentelėje

Šiaurės dėmė

Mažų RNR buvo išskirta naudojant mirVana RNR išskyrimas rinkinį (Ambion). Trys poros klinikinius mėginius buvo atsitiktinai pasirinkta iš 21 pacientų, norint vėliau Šiaurės blot analizė. Šiaurės dėmė buvo atliekamas pagal standartinę procedūrą descried anksčiau [17]. DNR oligonukleidų antiprasmq zondai naudojamas aptikti MIR-30b ir U6 snRNA buvo taip: mir-30b (5'-AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3) ir U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3 ")

Mobilusis transfekcijq.

Pasaulis-30B imituoja, plakta MIR-CONTROL, chemiškai modifikuotas Pasaulis-30b dvipusis (agomir), chemiškai modifikuotas plakta Pasaulis-kontrolės, PAI-1 siRNA arba siRNR neigiama kontrolė buvo įsigytas iš GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd, Kinija). PAI-1 (Serpine1) Žmogaus kDNR ORF Klonas buvo įsigytas iš Origene (Origene technologijų, Pekinas, Kinija). Transfekcija buvo atliekama naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) pagal gamintojo protokolą.

Mobilusis apoptozė tyrimas FCM

SGC-7901 arba HGC-27 ląstelių buvo pasėjamos į 12 šulinėlių plokštelės tinkamas tankis ir išaugo iki 30% susiliejimo po 24 h. Tada ląstelės buvo transfekuota su miR-30B imituoja arba miR-kontrolės, ir vidutinės buvo pakeistas su DMEM serumo neturinčioje 48 h. Dėl bendro transfekciją eksperimentas su miR-30b ir PAI-1 išreiškiamas vektoriumi, SGC-7901 ląstelės buvo pernešta su miR kontrolės arba Pasaulis-30B imituoja, o tada su PAI-1 Žmonių kDNR ORF klonas vektoriaus (nurodyta kaip PAI-1) arba tuščias vektorius 24 val vėliau. , Po 24 valandų vektoriaus transfekciją, vidutinės buvo pakeistas su DMEM dar 24 h serumo neturinčioje. Pagaliau, ląstelės buvo taikomas apoptozės analizės. FCM analizė, aneksinu-FITC Apoptozę nustatymo rinkinys I (BD Pharmingen) buvo naudojamas, tada analizuojama tėkmės citometrijos (BD FACSCantoTM II).

kaspaze Glo 3/7 Analizės

iš kaspazė-3/7 aktyvumas buvo nustatytas taikant kaspaze Glo 3/7 tyrimas (PROMEGA). Įpilama 100 pL kaspazės-Glo 3/7 reagentu baltojo-sienelėmis 96-šulinėlių plokštelės, švelniai išmaišykite šulinių, ir tada inkubuojama kambario temperatūroje šulinių 30 min. Liuminescencija buvo aptiktas naudojant GloMax-96 microplate luminometer (PROMEGA).

tumorogeniš- tyrimai nuogas pelėms

pelėmis naudojamos šiame eksperimente buvo prižiūrimi pagal konkrečias patogenais neužkrėstų sąlygomis. Matomų Pasaulis-30b mimics- ir mir-control-perkeltų SGC-7901 ląsteles (1 × 10 ^{6) buvo sustabdyta 100 iL PBS ir tada švirkšti po oda į vieną iš užpakalinės šono pačiu patelei Balb /c athymic pusėje nuogas pelė ne nuo 4 iki 6 savaičių amžiaus, kaip aprašyta anksčiau [25]. Naviko augimo ir su sąlyga, įskaitant bendrą sveikatos ir elgesio pelių buvo ištirti kas tris dienas 4 savaites. Naviko guoliais pelių nebuvo eksponuoti požymių skausmo arba kančios, pavyzdžiui, svorio praradimas ar elgesio pokyčių, todėl visi pelėms buvo paaukojo CO _{2 uždusinant dieną 28 po injekcijos. Naviko tūris (V) buvo stebimas matuojant ilgis (L) ir plotis (W) su apkabos ir apskaičiuojamas pagal formulę (L × W 2) × 0,5.}}

TUNEL dažymo

navikai buvo nuimami 26 dienų, ir nustatoma 10% formaldehido tirpalu, tada įdėta į parafiną. kad buvo deparaffinized ir rehidrataciją skyriai (5 mkm storio) buvo tamsintas hematoksilinu ir eozinu. Apoptozinės naviko ląstelės buvo tamsintas in situ terminalas deoxynucleotidyltransferase tarpininkaujant dUTP Nikas pabaiga ženklinimas (TUNEL) metodu, naudojant in situ ląstelių mirtis aptikimo rinkinį (POD; Roche Diagnostics Co.). Neigiama kontrolė buvo taikoma ta pati dažymą už Tünel be TDT. Vaizdai buvo surinkta naudojant mikroskopą su × 200 priartinimas.

Statybinės plazmidžių

Įvairių liuciferazės ataskaitos vektorių statybos Mir-30b tikslą buvo atliktas anksčiau aprašytas [16], [26] , konstruktas ir kurių sudėtyje yra mutantas sėklų regioną buvo sukurtas kaip kontrolei. Į nukleotidų naudojami sekos yra parodyta 2 lentelėje

liuciferazės tyrimas ir GFP represijų eksperimentams

HEK-293 ląstelės buvo sėklomis 96 šulinėlių plokštelės 5000 ląstelių viename pat dieną prieš transfekciją. Ląstelės buvo pernešta su kiekvienu Firefly liuciferazės reporteris vektorių, Renilla liuciferazė valdymo vektorių, PRL-TK (Promega), ir Pasaulis-30B imituoja arba miR-kontrole (GenePharma). Liuciferazės tyrimas buvo atliekamas pagal naudojant dvejopo liuciferazės reporterio testą sistemą (PROMEGA).

GFP represinėse eksperimentų, HEK-293 ląstelės buvo pasėjamos į 12 šulinėlių plokštelės 1 × 10 ^{5 už gerai dieną prieš transfekciją ir tada buvo cotransfected su mir-30B imituoja arba miR valdiklis su įvairių GFP reporteris vektorių. Ląstelės buvo atliktas tėkmės citometrijos analizę ir išanalizuoti duomenys naudojant CellQuest Pro programinę įrangą.}

Vakarų dėmė

Apdoroti ląstelės buvo plaunami ledinio PBS ir tada lizuoti pagal ląstelių lizės buferyje (Pierce). Po centrifugavimo 12000 rpm 15 min, esant 4 ° C, baltymo koncentracija buvo matuojamas pagal BCA baltymų bandymo rinkinio (Pierce). Mobilusis baltymų fragmentai buvo atskirtos 12% SDS denatūruotas poliakrilamido gelyje ir tada perkelti ant polivinilideno difluoridą membrana. Membranos buvo blokuotos 5% Nonfat sauso pieno tri-buferio druskų tirpalu, pH 7,4, kurių sudėtyje yra 0,05% Tween 20, ir buvo inkubuojamos su pirminių antikūnų PAI-1 (1:1000, Abcam) ir beta-aktino (1:1000 Santa Cruz), esant 4 ° C naktį atitinkamai. Membranos buvo plaunami ir inkubuojami su krienų peroksidazės konjuguoto antrinių antikūnų (1:5000, Santa Cruz) pagal gamintojo instrukcijas. Palūkanų baltymas ryškinamos naudojant ECL Imunoblotingo substrato (Pierce) ir Chemidoc XRS želė dokumentavimo sistema (BIORAD).

Statistinė analizė

rezultatai išreiškiami vidurkis ± standartinis nuokrypis (SN) iš ne mažiau kaip trijų nepriklausomų eksperimentų. Stjudento t testas buvo taikomas analizuoti tarp grupių skirtumus. Tarp Mir-30b lygio ir PAI-1expression santykiai buvo analizuojami naudojant Pearsono koreliacija. Statistinė analizė atlikta SPSS programinę įrangą (versija 17). buvo deklaruotos reikšmingas statistinių skirtumų, P
< 0,05 lygio. Statistiškai reikšmingi duomenys yra nurodyta žvaigždutėmis ( P
< 0,05 (*) P
. ≪ 0,01 (**)

Rezultatai

sumažėjęs Pasaulis-30b išraiška žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų ir GC audinių mėginių

Jei nustatyti PPN-30B į skrandžio vėžio patogenezėje svarbų vaidmenį, mes analizuojami mir-30B lygiai įvairiuose skrandžio vėžio ląstelių, įskaitant HGC-27, MAA, BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901. Kaip parodyta 1A paveiksle, PPN-30b išraiška buvo gerokai žemyn reguliuojama į keturias ląstelių linijų, palyginti su penkerių ne vėžinių skrandžio audinių (baseinas p
. <. 0,01)

miR-30b išraiška buvo toliau nagrinėjamas 21 suporuotų GC ir gretimų ne vėžinių skrandžio audinių per TaqMan kiekybinė realaus laiko PGR (KRL-PGR) Kaip parodyta į 1B pav, miR-30b sumažėjimas buvo nustatyta 18 iš 21 pacientų (85,7%), palyginti su atitinkamomis ne-navikų audiniuose. Be to, sklaida diagrama parodė, kad miR-30b buvo reikšmingai mažina reguliuojamas skrandžio vėžio mėginių palyginti normalus skrandžio gleivinės, su vidutiniu 6,28 kartus mažiau ( P
= 0,002) (1c pav.) Patvirtinti ekspresijos duomenys, gaunami iš KRL-PGR, 3 visų 21 porų mėginiai buvo atsitiktinai pasirinkti, kad nustatyti miR-30b, naudojant Šiaurės varžtą lygį. Mes taip pat nustatė, kad nuoseklus sumažėjo išraiška PPN-30b skrandžio vėžiu, palyginti su ne vėžinių skrandžio audinių (1d pav). Šie rezultatai rodo, kad miR-30b išraiška yra dažnai žemyn reguliuojama skrandžio vėžio ir gal dalyvauja skrandžio vėžio išsivystymo.

Padidėjusi miR-30b padidina skrandžio vėžio ląstelių apoptozę

Vienas iš vėžio požymis yra jos gebėjimas išvengti apoptozę [27], todėl mes išnagrinėjo miR-30b poveikį skrandžio vėžio ląstelės apoptozės. SGC-7901 arba HGC-27 ląstelių buvo pernešta su Pasaulis-30B imituoja arba plakta MIR-CONTROL, o Pasaulis-30b negimdinio išraiškos galiojimas buvo patvirtintas KRL-PCR (2A pav.) Tada miR-30b poveikis apoptozės SGC-7901 ar HGC-27 ląstelių buvo įvertintas tėkmės citometrijos (FCM) analizė ir kaspazės-3/7 Aktyvumas tyrimus. Kaip parodyta 2b ir 2c pav, mes nustatėme, kad apoptozinių ląstelių dalis buvo žymiai padidėjo SGC-7901 arba HGC-27 ląstelių transfektuotose Pasaulis-30B imituoja palyginti su MIR-control-perkeltų ląstelių (16.08% , palyginti su
8,25% iki SGC-7901 ląstelių, ir 17,83% , palyginti
10.87% iki HGC-27 ląstelių). Be to, žymiai padidėjo kaspazės-3/7 Aktyvumas buvo rastas SGC-7901 arba HGC-27 ląstelių transfektuotose miR-30b palyginti su miR kontrolės transfectants ( P
< 0,01, 2D brėžinį). Virš rezultatų matyti, kad padidėjusi miR-30B gali skatinti skrandžio vėžio apoptozę in vitro.

Pasaulis-30b slopina tumorogeniš- ir skatina ląstelių apoptozė in vivo

Jei dar nustatyti, ar Pasaulis-30b yra dalyvauja tumorigenesis skrandžio vėžio, buvo naudojamas nuogas pelės svetimo modelis. Kadangi mes nustatėme, kad Pasaulis-30b vaidino svarbesnį vaidmenį skatinant SGC-7901 ląstelių apoptozę nei HGC-27 ląstelėms in vitro, mes ištirti PPN-30b vaidmenį Tumorigenesis skrandžio vėžio naudojant SGC-7901 ląsteles. Pasaulis-Control "ir Pasaulis-30b-tranfected SGC-7901 ląstelės buvo švirkščiamas po oda arba užpakalinės šono pačių nuogas pelių. Pelės buvo stebimi stebėjimo svetimo transplantanto augimo 4 savaites. Buvo nustatyta, kad PPN-30b įvežimas į SGC-7901 ląstelių leido žymiai sumažinti naviko apimtį dydžio (3a paveiksle ir 3B), ir augliai, gautų iš miR-30b elgiamasi SGC-7901 ląstelių išaugo lėčiau palyginti su kontroliniu grupė per visą naviko augimo laikotarpiu (pav 3C, kairiajame skydelyje). Kai augliai buvo nuimta, vidutinis tūris navikų, gautų iš Mir-30B imituoja grupėje buvo tik 27,87% didesnis nei Mir-kontrolinės grupės (Fig.3C, tiesa skydelis P pervežimas < 0,01). Navikai buvo nuimami 26 dienų iš dviejų pusių Uţpakalinio krašto tos pačios pelės, apoptozės in situ buvo matuojamas pagal Tünel. Kaip parodyta 3D paveikslas, naviko skyriai MIR-30B imituoja elgiamasi ksenoimplantai eksponavo žymiai padidinti TUNEL teigiamų ląstelių. Šie rezultatai tvirtai teigė, kad PPN-30b įvedimas gali slopinti skrandžio vėžio augimą skatinant apoptozės vėžinių ląstelių.

PAI-1 yra kandidatas taikinio geno miR-30b

Jei dar įvertinti funkcija miR-30b, svarbu nustatyti, kuris priimančiosios mRNR yra reguliuojamas pagal miR-30b. Mūsų ankstesniame tyrime, mes išnagrinėjo iRNR išraiška profilį penkių porų pirminių navikų audiniuose, skrandžio vėžiu sergantiems pacientams ir atitiko ne navikų audiniuose, naudojant mikrogardeliq. Visiškai, mes nustatėme, 303 aktyvinama genus (fold pokyčius > 2 P
< 0,05), skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su ne navikų audiniuose (duomenys neparodyti). Atsižvelgiant į downregulated išraišką PPN-30b skrandžio vėžio, mes sutelktas į genus, rodančių padidėjo išraiškas sąrašo ir atrinko 30 geriausių padidėjo genų skrandžio vėžiu, tada nustatoma, jei šie genai buvo potencialūs taikiniai PPN-30b naudojant prognozavimo algoritmą , TargetScan. Įdomu tai, mes nustatėme, kad PAI-1 genas, kuris buvo aktyvinama į microarray (3,83 karto, P
= 0,04), gali būti tikėtina taikinio geno miR-30b (4a pav.) Tiesiogiai spręsti, ar Pasaulis-30b jungiasi prie 3'-UTR tikslinių mRNR, mes pastatytas liuciferazės ataskaitų vektorius, kuriuose yra spėjamą MIR-30b jungimosi vietų per 3'-UTR. Kaip nurodyta 4B paveiksle, mes nustatėme, kad ženkliai sumažės liuciferazės veiklos ( P
< 0,01) po contransfection iš liuciferazės ataskaitos vektorių ir Pasaulis-30B imituoja. Priešingai, ne iš liuciferazės pokytis buvo stebimas ląstelių, transfekuotų su mutantas 3'-UTR konstruoja. Šis rezultatas vėliau buvo patvirtinta pagal GFP represinėse eksperimentams. Kaip parodyta 4c ir 4d pav, GFP fluorescencija buvo gerokai sumažintas ląstelėse transfektuotose GFP ataskaitos vektorių, turinčių privalomų svetaines ir Pasaulis-30B imituoja, o nebuvo GFP fluorescencijos pokytis ląstelių transfektuotose mutantas vektoriaus ir Pasaulis-30B imituoja. Be to, padidėjusi miR-30B į AGS ir HGC-27 ląstelių lėmė žemyn reguliuoti baltymų lygius PAI-1 (4E pav). Kartu paėmus, Minėti duomenys rodo, kad "PAI-1 yra potencialus taikinys miR-30b ir Pasaulis-30b gali žemyn reguliuoti tikslinę baltymų.

atvirkštinė koreliacija tarp mir-30b ir PAI-1 išraiškos skrandžio vėžio audiniai ir vėžio ląstelių linijas,

Atsižvelgiant į tai, kad ir miR-30b yra žemyn reguliuojama skrandžio vėžio, ir, buvo pastebėta, kad PAI-1 baltymo skrandžio vėžio audiniuose yra žymiai didesnis negu ne-navikų audiniuose [ ,,,0],28], mes atliko koreliacinę analizę tarp miR-30b ir PAI-1 išraiškos skrandžio vėžio ląstelių linijų ir skrandžio vėžio audiniuose. Kaip parodyta 5a pav viršuje, PAI-1 baltymo lygis buvo žemiausias AGS ląstelėje tarp penkių skrandžio ląstelių linijų. Priešingai, PPN-30b lygis buvo didžiausias AGS, palyginti su kitomis ląstelių linijas (pav 5A apačioje). Vėliau, mes nagrinėjami PAI-1 ir miR-30B ekspresiją 21 rinkinių skrandžio vėžio ir gretimų ne-navikų audiniuose. Mes nustatėme, kad 81% (17/21) skrandžio vėžio rodomas didesnes PAI-1 mRNR palyginti su sveikų audinių. Priešingai, PPN-30b buvo dažniausiai žemyn reguliuojama 18 iš 21 auglių. Naudojant Pearsono koreliacijos analizę, mes nustatėme reikšmingą atvirkštinę koreliaciją tarp miR-30b ir PAI-1 mRNR (5b pav R
= -0,6475 P
= 0.0123). Pirmiau pateikti rezultatai rodo, kad Pasaulis-30b išraiška yra atvirkščiai koreliuoja su PAI-1 išraiškos skrandžio vėžio, ir sustiprintas PAI-1 išraišką skrandžio vėžio gali būti sumažintas Pasaulis-30b išraiškos rezultatas.

PAI-1 potencialiai dalyvauja Pasaulis-30b sukeltos apoptozė

toliau tirti, ar PAI-1 dalyvauja Pasaulis-30b-skatinamas apoptozės, mes pirmą kartą išbandė jei PAI-1 išraiškos triukšmo slopinimo gali turėti panaši apoptozė skatinimo poveikį, kaip Pasaulis-30b raiškos. SGC-7901 ląstelės buvo pernešta su PAI-1 siRNA ar neigiamos kontrolės RNR (NC) 48 h, kaip parodyta 6a paveikslas, iRNR lygiai PAI-1 gali būti gerokai sumažintas jo siRNA. Vėliau PAI-1 siRNR rodomas akivaizdžių padidėjimą apoptozės norma SGC-7901 ląstelių (pav 6B, 6C), palyginti su miR-kontrolė. Visų pirma, PAI-1 siRNR galėjo phenocopy miR-30b raiškos poveikį apoptozės reguliavimo vėžio ląstelių (pav 6B, 6C). Vienas tipiškas dot sklypas buvo parodyta 6D pav. Be to, mes taip pat išnagrinėjo, ar PAI-1 gali panaikinti skatinti apoptozę iki miR-30b poveikį. SGC-7901 ląstelės buvo pernešta su miR kontrolės arba Pasaulis-30B imituoja 24 h, o po to transfekciją su PAI-1 Žmonių kDNR ORF klonas vektoriaus (nurodyta kaip PAI-1) arba tuščio vektorių. Kaip parodyta pav 6E-g, o PAI-1 ekspresija atsirado akivaizdaus slopinimas miR-30b-sukeltos apoptozės poveikio. Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad "PAI-1 potencialiai dalyvauja Pasaulis-30b-skatinamas apoptozės.

Diskusijos

Nors dereguliavimas miRNAs buvo pastebėta skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų atveju tiksli molekulinės mechanizmas, pagal kurį miRNAs moduliuoti Tumorigenesis procesas dar nėra visiškai ištirtas. Iki šiol iš miRNAs serija buvo pranešta, kad veiktų kaip onkogeno į skrandžio vėžio vystymąsi [29], [30], tačiau miRNAs veikia kaip navikas slopintuvas genų reikia toliau tirti.

Čia mes parodė Pasaulis-30b buvo žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ląstelių ir navikų audiniuose. Mūsų duomenys taip pat rodo, kad overxepression miR-30b galėtų pagerinti skrandžio vėžio ląstelių apoptozę in vitro ir in vivo, ir miR-30b galėjo slopinti auglio augimo skrandžio vėžio in vivo. Mes dar pasižymi PAI-1, kaip tapti taikiniu miR-30b, ir miR-30b išraiška buvo atvirkščiai koreliuoja su PAI-1 ekspresija skrandžio vėžio. Be to, PAI-1 yra gali būti susiję su miR-30b-sukeltas apoptozės. Aukščiau rezultatai rodo, miR-30b gali veikti kaip naują auglio slopinamojo, reguliuojant vėžio ląstelių skrandžio vėžio apoptozę.

miR-30b yra viena iš miR-30 šeimos, kuri yra susijusi su daugelio tipų kūrimo vėžio. Tačiau miR-30b vaidmuo Tumorigenesis yra prieštaringas. Pasaulis-30b buvo pranešta, kad žemyn reguliuojama prostatos vėžio [31], invazinės šlapimo pūslės auglio [32], anaplazinė skydliaukės vėžio [33], stemplės vėžio [34], ir plaučių vėžio [35], o sustiprinto išraiška miR- 30b buvo nustatytas meduloblastomos [36] ir piktybiniai mezoteliomą [37]. Be to, PPN-30b buvo įvardytas kaip vienas iš nepriklausomų prognostinius atkryčio be išlikimą kepenų ląstelių karcinoma [38]. Nuo Pasaulis-30b buvo arba iki reguliuojama arba sumažinti įvairių vėžio formų, galime daryti išvadą, kad Pasaulis-30b gali žaisti skirtingus vaidmenis kaip onkogeno ar auglio slopinamojo geno įvairių vėžio.

dabartinės studijų , mes nustatėme, kad Pasaulis-30b išraiška buvo žymiai sumažėjo skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų, palyginti su normaliomis skrandžio audinius. Suderinamas su mūsų išvada buvo nustatyta Pasaulis-30b būti žemyn išreiškė MicroRNA masyvo nuo 184 skrandžio vėžio ir 169 ne naviko gleivinės [39], ir Qiao kt nustatė, kad Pasaulis-30b buvo žemyn išreikštas skrandžio vėžio audinių ir skrandžio vėžio ląstelių linijas, AGS ir BGC-823 ląstelių [40]. Todėl Pasaulis-30b išraiška nuostoliai gali būti susijęs su patogenezę ir progresavimo skrandžio vėžio.

Apoptozę yra užsisakyti ląstelių mirtis procesas, kuris vyksta fiziologinių ir patologinių būklių. Šio trapią pusiausvyrą sutrikimas gali sukelti vėžio [27] plėtros. Dabar yra mažai žinoma apie miR-30b poveikį apoptozę vėžio. Prieštaringas išraiška miR-30b rodo, kad PPN-30b funkcijos sudėtingumą. Neseniai Li et al [41] nustatė, kad Pasaulis-30b buvo gerokai sumažintas, reaguodama į oksidacinio streso stimuliacijos ir Pasaulis-30b gali slopinti mitochondrijų dalijimasis ir susijusiai apoptozę. Priešingai, tai buvo įrodyta, kad Pasaulis-30 gali slopinti savarankiškai atnaujinti ir sukelti apoptozę krūties navikų susidarymą ląstelėse (BT-ICS) pagal triukšmo slopinimo Ubc9 ir ITGB3 [42]. Virš įrodymai rodo, kad Pasaulis-30 yra daugiafunkcinis genų, kurie gali slopinti arba indukuoti apoptozę. Dabartiniame pranešime, mes nustatėme, negimdinis išraiška miR-30b galėtų sukelti skrandžio vėžio ląstelių apoptozę in vitro, ir raiška miR-30b galėtų reikšmingai slopina naviko augimą nuogas pelės svetimo transplantanto modelį, sukeliant skrandžio vėžio ląstelių apoptozę in vivo. Virš rezultatai rodo, kad Pasaulis-30b gali žaisti potencialų vaidmenį skrandžio vėžio vystymosi, skatinant apoptozės vėžio.

Jei tyrinėti molekulinė mechanizmo, lemiančio Pasaulis-30B funkciją, svarbu nustatyti savo tikslinę geną. Neseniai keletas naujų tikslų PPN-30b pasitvirtino įskaitant p53 [43], "Delta-kaip 4 [44], ir Snail1 [45]. Mūsų tyrime, PAI-1was identifikuojamos kaip taikinio geno miR-30b skrandžio vėžio. PAI-1 yra pagrindinis inhibitorius TPA ir ÚPA, ir PAI-1 gali blokuoja plazminogeno aktyvacijos. Ji buvo gerai dokumentuota, kad PAI-1 išraiška yra didesnė skrandžio vėžio nei kontrolės audinių ir PAI-1 gali būti kaip naujas prognostinis faktorius skrandžio vėžio, prognozuoti trumpesnį išgyvenamumą [28], [46], [47 ]. Įdomu tai, kad naujausi duomenys rodo protumorigenic aktyvumą PAI-1 gali būti per antiapoptotic funkciją [22]. Mūsų tyrimas parodė, kad Pasaulis-30b išraiška buvo atvirkščiai koreliuoja su PAI-1 išraiškos skrandžio vėžio ląstelių linijų ir navikų audiniuose, PAI-1 raišką galėtų neutralizuoti skatinant apoptozės iki miR-30b poveikį ir negimdinis išraiška miR-30b turėjo panašus skatinti-apoptozė poveikis, palyginti su triukšmo slopinimo PAI-1 išraiška. Tai rodo, kad Mir-30b-PAI-1 ašis gali būti įtraukti į skrandžio vėžio vystymąsi. Tačiau tolesnis kelias yra reikalingas būti toliau tiriami.

skrandžio vėžio vystymąsi pasižymi daugeliu veiksnių ir daugiapakopės procese, ir H. pylori
buvo įrodyta, kad pagrindinė priežastis, dėl skrandžio vėžio. Naujausi pranešimai mūsų mokslinių tyrimų ir kitų tyrimų išryškino reguliavimo vaidmenį miRNAs į H. Helicobacter pylori infekcija
ir susijusias ligas. Mirna yra potencialus tiltas iš H. pylori
infekcija lėtiniu gastritu ir skrandžio vėžio [16], [48], [49]. Dėl PPN-30B, jis gali turėti multi-funkcija H. pylori
infekcija ir h. pylori
-associated ligas. Mūsų ankstesnės ataskaitos rasti Pasaulis-30b galėjo reguliuoti autofagija procesą nukreipiant ATG12 ir BECN1 H metu. pylori
išlieka infekcijos [19].

• PLoS ONE: Intratumor IL-17-Teigiamas putliųjų ląstelių yra pagrindinis šaltinis IL-17 Tai Ar Nuspėjamasis išlikimo skrandžio vėžio Patients
• PLoS ONE: Helicobacter pylori Skatina epitelio-mezenchiminių perėjimas Skrandžio vėžio Downregulating programuota ląstelių mirtis Protein 4 (PDCD4)