Ploche ONE: Mir-30b, down-regulované v rakoviny žalúdka, podporuje apoptózu a potláča rast nádorových zacielením inhibítor aktivátora plazminogénu-1

abstraktné

Pozadie

rakovina žalúdka je jedným z väčšina bežných nádorových ochorení na celom svete. Vznikajúce dôkazy ukázali, že microRNA (miRNA) sú spojené s rozvojom nádoru a progresie. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že H. pylori
infekcia bola schopná indukovať pozmenenej expresie Mir-30b v žalúdočných epiteliálnych bunkách. Avšak, len málo je známe o potenciálnej úlohe MIR-30b u rakoviny žalúdka.

Metódy

Analyzovali sme expresiu Mir-30b v žalúdočných rakovinových bunkových línií a ľudských nádorových tkanív žalúdka. Skúmali sme vplyv MIR-30b napodobňuje k apoptóze buniek karcinómu žalúdka in vitro pomocou prietokovej cytometrie (FCM) a testy kaspasy 3/7 činnosti. Nude myší model s xenoštěpem bol použitý na určenie, či MIR-30b sa podieľa na tumorigenezi rakoviny žalúdka. Cieľom MIR-30B bol identifikovaný analýzou bioinformatiky, luciferázového testu a Western blot. Nakoniec sme vykonali analýzu korelácie medzi Mir-30b a jeho cieľovej expresie v karcinómu žalúdka.

Výsledky

MIR-30b bol významne down-regulovaný v rakovinových bunkách žalúdku a ľudských nádorových tkanív žalúdka. Nevykonalo expresie MIR-30b podporoval apoptózu buniek karcinómu žalúdka in vitro, a mier-30b by mohli významne inhibovať karcinogenity rakoviny žalúdka tým, že zvyšuje podiel apoptózy nádorových buniek in vivo. Okrem toho, inhibítor aktivátora plazminogénu 1 (PAI-1) bol identifikovaný ako potenciálny cieľ MIR-30b, a úroveň Mir-30b bola nepriamo úmerná PAI-1 expresie v karcinómu žalúdka. Okrem toho, umlčanie PAI-1 bol schopný phenocopy účinok MIR-30b nadmernú expresia na reguláciu apoptózy rakovinových buniek a nadmerná expresia PAI-1 by mohol potlačiť účinok podporujúci bunkovej apoptózy MIR-30b, čo ukazuje, PAI-1 je potenciálne podieľa na Mir-30b-indukovanej apoptózy v rakovinových bunkách.

Záver

MIR-30b môžu fungovať ako nové tumor supresorového génu pri rakovine žalúdka zacielením PAI-1 a reguláciu apoptózy rakovinové bunky. MIR-30b by mohli slúžiť ako potenciálny biomarker a liečebný cieľ proti rakovine žalúdka

Citácia :. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) MIR-30b, down-regulované v rakoviny žalúdka, podporuje apoptózu a potláča rast nádorových zacielením inhibítor aktivátora plazminogénu 1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10,1371 /journal.pone.0106049

Editor: Gerolamo Condorelli, Federico II University of Naples, Italy, Taliansko

Prijaté: 7. mája 2014; Prijaté: 28. júla 2014; Uverejnené: 29.srpna 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát: Text. autori potvrdzujú, že všetky údaje súvisiace závery sú plne k dispozícii bez obmedzenia. Všetky relevantné údaje sú v papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto práca bola podporená Národnej prírodnej Science Foundation Číny (No. 81202310), vedecké inovácie Research Foundation tretieho Vojenskej lekárskej univerzity (No. 2009XQN20). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka spôsobí zhruba 738 tisíc úmrtí na celom svete ročne, a to bolo uznané ako treťou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia u mužov [1]. Včasná diagnóza a liečba viedli k výborným očakávania pre dlhodobé prežitie a dobrou prognózou, zatiaľ čo výhľad pre pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka je stále zlá. Rovnako ako ostatné rakoviny, vývoj rakoviny žalúdka je považovaná za multifaktoriálne. Helicobacter pylori (H. pylori)
infekcie bola uznaná za dôležitý spúšťač rakoviny žalúdka [2]. Hoci mnoho genetické a epigenetické zmeny boli zaznamenané u rakoviny žalúdka, molekulárnej mechanizmus je základom rozvoja rakoviny žalúdka zostáva nejasný.

microRNA (miRNA) sú malé nekódujúca RNA, ktorá posttranscriptionally regulujú génovú expresiu. Zrelých miRNA môže špecificky viazať na 3 'UTR cieľovej bunkovej mRNA v poradí spúšťania degradácii mRNA alebo inhibíciu translácie [3], [4]. miRNA pôsobiť ako kľúčové regulátory v celej rade biologických procesov, vrátane vývoja, diferenciácie buniek, apoptózu, metabolizmus, a signálne transdukcie [5], [6]. Bolo preukázané, že 50% miRNA sa často nachádza v rakovinou spojené s oblasťou genómu alebo v nestabilných miestach [7]. Stále viac dôkazov ukazuje, že aberantne miRNA expresie koreluje s rôznymi ľudských nádorov, a naznačuje, že miRNA môže fungovať ako onkogény alebo tumor-supresorových génov [8] - [10]. V poslednej dobe značný počet deregulovaných miRNA vrátane MIR-106b-25 klastra, MIR-21, MIR-218, MIR-7, a mier-335 boli identifikované ako modulátory bunkového rastu, apoptózy, migrácia a invázia v karcinómu žalúdka vývoj [11] - [15]. Tieto zistenia naznačujú, že miRNA môže hrať kľúčovú úlohu v patogenéze rakoviny žalúdka.

Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že H. pylori
infekcia bola schopná indukovať zmenené expresie miRNA v žalúdku epitelové bunky vrátane MIR-155, mier-146a a mier-30b, môže miRNA fungujú ako nové negatívne regulátory doladiť H. pylori
indukovaná zápalu [16], [17]. Navyše sme preukázali, že mier-146a môže zohrávať potenciálnu úlohu v rozvoji rakoviny žalúdka tým, že moduluje proliferáciu a apoptózu buniek karcinómu žalúdka [18]. Pozoruhodne, sme tiež zistené, MIR-30b by mohli regulovať proces autofagie počas H. pylori
pretrvávajú infekciu, čo prispieva k pretrvávaniu H. Pylori
infekcie [19]. Avšak úloha Mir-30b v karcinómu žalúdka, je stále do značnej miery neznáma.

inhibítor aktivátora plazminogénu 1 (PAI-1), je hlavným inhibítorom serínovej proteázy z tkanivového typu (t-PA) urokináza a typu ( u-PA), aktivátor plazminogénu, a preto hrá dôležitú úlohu v plazminogén-plazmín systému [20]. Predchádzajúce štúdie ukázali, PAI-1 je zlý prognostický faktor v niekoľkých spoločných nádorov, a je spojená s rakovinou invázie a metastáz [21]. V poslednej dobe sa veľa skupín tiež zistili, že PAI-1 môžu podporovať rast nádorov inhibíciou bunkovej apoptózy. Napríklad prídavok stabilný divokého typu PAI-1 v ľudskom bunková línia rakoviny prostaty PC-3, ľudské promyelocytovej leukémie bunková línia HL-60 a dokonca aj non-tumoru bunky, malo za následok výrazné inhibíciu apoptózy [22] , Po podkožnej aplikácii do holých myší s PAI-1 expresiou myší bunky fibrosarkómu, nádory boli rýchlo stanovené, zatiaľ čo PAI-1 bunky s deficitom mala potlačenou tumorigeničnosti [23]. Ďalšia správa ukázala, že, genetické a farmakologická inhibícia PAI-1 v ľudských nádorových bunkových línií (HT-1080, A549, HCT-116 a MDA-MB-231) sa zvýšila spontánny apoptózy, a je zaujímavé, že implantované PAI-1 porazený HT- 1080 buniek na PAI-1 knockout myší viedlo k zníženiu tumorigenezi a predĺženie prežitia v porovnaní s kontrolnou myšou [24]. Tieto štúdie poskytujú významné dôkazy, že PAI-1 vykazuje ochrannú úlohu proti nádorových buniek apoptózou.

V súčasnej štúdii sme zistili, že mier-30b bol významne down-regulované buniek karcinómu žalúdka a nádorových tkanivách. Ektopická expresia MIR-30b by mohli podporovať apoptózu žalúdočné nádorové bunky in vitro, a mier-30b by mohli významne inhibovať karcinogenity karcinómov žalúdka v modeli nahých myší xenoimplantátu. Okrem toho, PAI-1 bol identifikovaný ako potenciálne ciele Mir-30b a mier-30b môžu indukovať apoptózu a potláča rast nádoru potlačením expresie PAI-1. Naše zistenia naznačujú, že mier-30b môžu fungovať ako nové tumor supresorového génu rakoviny žalúdka a môže byť potenciálny terapiou cieľ pre rakovinu žalúdka.

materiáloch a metódach

Prehlásenie etika

Všetky pokusov na zvieratách boli schválené Animal etickú a experimentálne výboru tretieho Vojenskej lekárskej univerzity. Všetky zviera Operácia bola vykonávaná v pentobarbitalu sodného narkóze, a boli vykonané všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia. Štúdie zahŕňajúce tkanivových vzoriek bola schválená Ethics Review Board na tretiu Vojenskej lekárskej univerzity, a písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých pacientov pred účasťou.

vzorky tkaniva

V celkom žalúdočné rakovinové tkanivá a priľahlé non-nádorového tkaniva boli získané od pacientov s primárnou rakovinou žalúdka po radikálnej gastrektómii na Southwest Hospital, tretie vojenské lekárskej univerzity, Číne, a patologickým charakteristiky pacientov s rakovinou žalúdka sú zhrnuté v tabuľke 1. po chirurgickom odstránení, tkanivá boli zmrazené ihneď v tekutom dusíku a skladované pri -80 ° C. Štúdia bola schválená etickou komisiou etika na tretiu Vojenskej lekárskej univerzity a informovaný súhlas bol získaný od všetkých pacientov pred účasťou.

Bunkové línie a bunková kultúra

Všetky bunkové línie použité v tejto štúdii boli získané od Shanghai Type Culture Collection čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína), ľudské žalúdočné nádorových bunkových línií AGS sa kultivovali v Ham F12 (Hyclone), médium s 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS), iné žalúdočné rakovina bunkové línie MKN45 , HGC-27, BGC-823, SGC-7901 a ľudské embryonálne obličky (HEK) 293 bunky boli kultivované v DMEM (Hyclone), 10% FBS, všetky boli udržiavané vo vlhkom inkubátore s obsahom 5% CO _{2 na 37 ° C, ako bolo popísané vyššie.}

Kvantitatívny RT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná TRIzolu činidla (Invitrogen), nasleduje reverznej transkripcie za použitia TaqMan miRNA testov (Ambion), s malým U6 jadrové RNA ako vnútorná referencia normalizované. QRT-PCR reakcie boli vykonané za použitia nasledujúcich parametrov: 95 ° C po dobu 2 minúty a následne 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd a 60 ° C počas 30 s. QRT-PCR analýzy pre mRNA PAI-1, boli vykonané za použitia PrimeScript RT-PCR kitu (Takara), as nasledujúcimi parametrami: 95 ° C počas 30 sekúnd a následne 40 cyklov 95 ° C počas 5 s, 60 ° C po dobu 5 sekúnd a 72 ° C počas 30 s. Hladina mRNA beta-aktínu bola použitá ako vnútorná kontrola. Sekvencie primérov použitých sú uvedené v tabuľke 2.

Northern blot

miniatúrne RNA bola izolovaná s použitím RNA Isolation Kit Mirvana (Ambion). Tri páry klinických vzoriek boli náhodne vybrané z 21 pacientov pre následnú analýzu Northern blot. Northern blot bola vykonaná podľa štandardného postupu, aký je popísaný skôr [17]. Antisencie sondy DNA oligonukleotidové použitá na detekciu Mir-30b a U6 snRNA boli nasledovné: Mir-30b (5'-AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') a U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3')

transfekciu buniek.

MIR-30b napodobňuje, miešaná mir-kontrolu, chemicky modifikované MIR-30b duplex (agomir), chemicky modifikované miešaná MIR-Control, PAI-1 siRNA alebo siRNA ako negatívna kontrola boli zakúpené od GenePharma (Shanghai GenePharma Co. , Ltd., Čína). PAI-1 (Serpine1) Human cDNA ORF Klon bol zakúpený od Origen (Origen Technologies, Peking, Čína). Transfekcia boli vykonané za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podľa protokolu výrobcu.

apoptózu buniek Test podľa FCM

SGC-7901 alebo HGC-27 bunky boli schovať na 12-jamkové doštičky v vhodným hustota a pestované do 30% zhlukovania po 24 hodinách. Potom boli bunky transfekovány s Mir-30b napodobňuje alebo MIR-riadenie, a medium bolo nahradené DMEM bez séra po dobu 48 hodín. Pre čo-transfekčního experimentu s Mir-30b a PAI-1 exprimujúce vektor, SGC-7901 bunky boli transfekovány s Mir-regulácia alebo MIR-30b napodobenín, a potom s PAI-1 ľudskej cDNA ORF klonovanie vektora (uvedené ako PAI-1) alebo prázdny vektor o 24 hodín neskôr. 24 hodín po transfekciu vektorom, bolo médium nahradené DMEM na ďalších 24 hodín bez séra. Nakoniec boli bunky použité pre analýzu apoptózy. FCM analýzy, čo je sada annexin V-FITC Apoptóza detekcia I (BD Pharmingen) sa použije, potom boli analyzované pomocou prietokovej cytometrie (BD FACSCantoTM II).

Caspase-Glo 3/7 Assay

aktivita kaspázy-3/7 bola detekovaná pomocou testu kaspasy-Glo (Promega) 3/7. Pridať 100 ul kaspázy-Glo 3/7 činidlom pre biely stenami 96-jamkové doštičky, jemne premiešajte obsah jamiek, a potom inkubovať jamky pri izbovej teplote po dobu 30 minút. Luminiscencia bola detekovaná s použitím GloMax-96 Microplate Luminometer (Promega).

karcinogenity testy u nahých myší

Myši použité v tomto experimente boli udržiavané pri špecifických podmienkach bez patogénov. Životaschopné Mir-30b a mier-mimics- kontrolné transfekované SGC-7901 bunky (1 x 10 ^{6) boli suspendované v 100 ul PBS a potom sa vstrekuje subkutánne do obidvoch stranách zadného boku rovnakej samica Balb /c athymických nude myší po 4 až 6 týždňoch veku, ako bolo opísané skôr [25]. Rast nádoru a stav vrátane celkového zdravia a správanie myší boli skúmané každé tri dni po dobu 4 týždňov. Myši nádorové ložiskách nepreukazujú známky bolesti alebo utrpenia, ako je strata hmotnosti alebo zmien správania, takže boli všetky myši usmrtené CO _{2 zadusenia 28. deň po injekcii. Objem nádoru (V) bol monitorovaný meraním dĺžky (L) a šírka (W) s posuvným meradlom a vypočíta podľa vzorca (L x W 2) x 0,5.}}

TUNEL farbenie

nádory boli zozbierané po 26 dňoch, a fixované v 10% roztoku formaldehydu a potom uloží do parafínu. Sekcia (5 um hrubé), ktoré boli zbavené parafínu a rehydratované boli zafarbené hematoxylínom a eosínu. Nádorové bunky boli zafarbené apoptotické in situ metódou terminál deoxynucleotidyltransferase sprostredkovaná dUTP nick end značenie (TUNEL) za použitia in situ detekcie bunkovej smrti kit (POD; Roche Diagnostics Co.). Negatívna kontrola bola podrobená rovnakému farbenie na TUNEL bez TDT. Obrázky boli získané pomocou mikroskopu so zväčšením 200 x.

Konštrukcia plazmidov

Konštrukcia rôznych luciferázové správa vektorov za cieľ MIR-30b bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [16], [26] , a konštrukt obsahujúci mutantný oblasť semien bol vytvorený ako kontrola. Sekvencie oligonukleotidov použitých sú uvedené v tabuľke 2.

Luciferase Assay a GFP represie experimenty

HEK-293 bunky boli nasadené na 96-jamkové doštičky pri 5000 buniek na jamku v deň pred transfekcia. Bunky boli transfekovány s každým luciferázy svetlušiek reportérového vektora, Renilla kontrolné luciferázy vektora, prl-TK (Promega), a mier-30b napodobňuje alebo MIR-kontroly (GenePharma). Test luciferázy bolo vykonávané s použitím duálneho luciferázového reportérového testovacieho systému (Promega).

GFP represie experimenty, HEK-293 bunky boli nasadené na 12-jamkové doštičky pri 1 x 10 ^{5 za dobre deň pred transfekcia a potom boli kotransfekovány s Mir-30b napodobňuje alebo MIR-control s rôznymi GFP reportér vektorov. Bunky boli vystavené toku cytometrická analýza, a boli analyzované dát pomocou CellQuest Pro.}

Western blot

Ošetrené bunky boli premyté ľadovo chladným PBS a potom lyžovanie bunkového lyzačného pufra (Pierce). Po centrifugácii pri 12000 otáčkach za minútu počas 15 minút pri teplote 4 ° C, koncentrácia proteínu bola meraná pomocou BCA proteín kitu (Pierce). Proteínové lyzáty buniek boli separované v 12% SDS polyakrylamidovom gélu denaturujú a potom prenesené na polyvinylidendifluoridovou membránu. Membrány boli blokované 5% netučného sušeného mlieka v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku, pH 7,4, s obsahom 0,05% Tween 20, a boli inkubované s primárnymi protilátkami proti PAI-1 (1: 1000, abca) a p-aktínu (1: 1000 , Santa Cruz) pri 4 ° C cez noc, resp. Membrány boli premyté a inkubované s chrenovou sekundárnej protilátky konjugovanej s peroxidázou (1: 5000, Santa Cruz), podľa inštrukcií výrobcu. Požadovaný proteín boli vizualizované za použitia ECL Western blot substrátu (Pierce) a Chemidoc XRS Gel dokumentácie systém (BIORADE).

Štatistická analýza

Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) z najmenej troch nezávislých experimentov. t testu študenta bola použitá na analýzu rozdielov medzi skupinami. Vzťah medzi úrovňou Mir-30b a PAI-1expression bola analyzovaná za použitia Pearsonovho korelácie. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou software SPSS (verzia 17). Štatistické rozdiely boli vyhlásené za významné pri P Hotel < 0,05 úrovni. Štatisticky významné údaje sú označené hviezdičkou ( P Hotel < 0,05 (*), P
. ≪ 0,01 (**)

Výsledky

znížila MIR-30b expresie v ľudských nádorových bunkových línií žalúdočných a vzoriek tkanív GC

na určenie role Mir-30b v patogenéze rakoviny žalúdka, sme analyzovali hladiny Mir-30B v rôznych buniek karcinómu žalúdka, vrátane HGC-27, AGS, BGC-823 a SGC-7901. Ako je znázornené na obrázku 1A, expresie MIR-30B bol významne down-regulované v štyroch bunkových líniách v porovnaní s bazénom piatimi nenádorových žalúdočné tkanív ( P Hotel < .. 0.01)

expresie MIR-30b bola ďalej skúmaná u 21 spárovaných GC a okolitom normálnom žalúdočných tkanivách prostredníctvom TaqMan kvantitatívnej real-time PCR (QRT-PCR) Ako je uvedené na obrázku 1B, bolo zistené, že pokles Mir-30B v 18 z 21 pacientov (85,7%) v porovnaní so zodpovedajúcimi nenádorových tkanív. Ďalej je rozptyl diagram ukazuje, že mier-30b bol významne down-regulované vo vzorkách s karcinómom žalúdka v porovnaní s normálnou žalúdočnú sliznicu, s priemerným poklesom 6,28-násobným ( P
= 0,002) (obr 1C). Ak chcete overiť dáta expresie získané z QRT-PCR, 3 všetkých 21 párov vzoriek boli náhodne vybral na stanovenie hladiny MIR-30b za použitia severnej skrutku. Tiež sme zistili, konzistentné znížená expresia MIR-30b u karcinómu žalúdka v porovnaní s non-nádorové žalúdočné tkanív (Obrázok 1D). Tieto výsledky naznačujú, že expresia MIR-30b je často down-regulovaný u karcinómu žalúdka a možno podieľa na vzniku rakoviny žalúdka.

Zvýšená expresia MIR-30b zvyšuje apoptózu buniek karcinómu žalúdka

Jeden punc rakoviny je jeho schopnosť obísť apoptózu [27], a tak sme skúmali vplyv Mir-30b na žalúdočné rakovinové bunky apoptózy. SGC-7901 alebo bunky HGC-27 boli transfekovány MIR-30b napodobňuje alebo miešaná Mir-kontrolu a platnosť Mir-30b ektopickej expresie bola potvrdená QRT-PCR (obrázok 2A). Potom účinok Mir-30B na apoptózy SGC-7901 alebo buniek HGC-27 bola hodnotená pomocou analýzy prietokovou cytometriou (FCM) a kaspasy 3/7 aktivity testoch. Ako je znázornené na obrázku 2B a 2C, sme zistili, je podiel apoptotických buniek bola významne zvýšená v SGC-7901 alebo HGC-27 buniek transfektovaných s Mir-30b napodobňuje v porovnaní s bunkami, kontrolných transfekciou MIR (16,08% v závislosti na
8,25% až SGC-7901 bunky, a 17,83% proti
10,87% do buniek HGC-27). Okrem toho sa zistilo, že významné zvýšenie aktivity kaspázy-3/7 v SGC-7901 alebo HGC-27 buniek transfektovaných s Mir-30b v porovnaní s Mir-kontrolné transfektanty ( P
< 0,01, obrázok 2D). Vyššie uvedené výsledky ukazujú, že zvýšená expresia MIR-30b môže podporovať apoptózu rakoviny žalúdka in vitro.

MIR-30b potláča tumorigeničnosti a podporuje apoptózu buniek in vivo

Ak chcete ďalej určiť, či MIR-30b je podieľajú na vzniku nádorov rakoviny žalúdka, bol použitý nude myší model s xenoštěpem. Pretože sme zistili, že mier-30b hrala významnejšiu úlohu pri podpore SGC-7901 buniek apoptózu ako HGC-27 buniek in vitro, budeme skúmať úlohu MIR-30b vo vzniku nádorov žalúdka rakoviny pomocou SGC-7901 bunky. Mir-riadiacimi a mier-30b-tranfected SGC-7901 bunky boli injikované subkutánne do jedného zadného boku rovnakých nahých myší. Myši boli sledované po dobu pozorovania rastu xenoimplantátu počas 4 týždňov. Bolo zistené, že zavedenie MIR-30b do SGC-7901 buniek viedlo k výraznému zníženiu veľkosti objemu nádoru (obrázok 3A a 3B), a nádory odvodené od MIR-30b spracuje SGC-7901 bunky rástli pomalšie v porovnaní s kontrolou skupina po celú dobu rastu nádoru (obrázok 3C, ľavý panel). Keď boli nádory zozbierané, priemerný objem nádorov odvodených zo skupiny, MIR-30b simuluje len 27,87% z toho v Mir-kontrolnej skupine (obrázok 3C, pravý panel, P Hotel &0,01). Nádory boli zozbierané po 26 dňoch od oboch stranách zadného boku rovnakej myši, apoptóza in situ boli merané metódou TUNEL. Ako je znázornené na obrázku 3D, nádorové rezy z MIR-30b napodobňuje liečených xenoimplantáty vykazovali významne zvýši v TUNEL pozitívnych buniek. Tieto výsledky silne navrhol, že zavedenie MIR-30b môžu inhibovať rast rakoviny žalúdka tým, že podporuje apoptózu rakovinových buniek.

PAI-1 je kandidátom cieľový gén MIR-30b

Ak chcete ďalej posúdiť funkcia MIR-30b, je dôležité určiť, ktoré hostiteľskej mRNA sú upravené MIR-30b. V našej predchádzajúcej štúdii sme skúmali expresiu mRNA profil v piatich párov primárnych nádorových tkanivách pacientov s rakovinou žalúdka a uzavreté nenádorových tkanív s použitím mikročipu. Úplne sme zistili, 303 upregulovány gény (rozkladací zmenu zlúčenina, 2, P Hotel &0,05) v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní s non-nádorového tkaniva (dáta nie sú uvedené). Vzhľadom k downregulated expresiu Mir-30b rakoviny žalúdka, sme sa zamerali na zozname génov, ktoré ukazujú zvýšené výrazy a vybrala TOP 30 zvýšenej gény rakoviny žalúdka, potom stanovené, či tieto gény boli potenciálnymi cieľmi MIR-30b pomocou algoritmu predikcie , TargetScan. Zaujímavé je, že sme zistili, že PAI-1 génu, ktorá bola up-regulovaná v čipe (3,83 krát, P
= 0,04), môže byť pravdepodobné, cieľový gén MIR-30b (obrázok 4A). Priamo na otázku, či MIR-30b sa viaže na 3'-UTR cieľových mRNA, sme konštruované Luciferase vektorov zostavy, ktoré obsahujú putativní väzobné miesta v rámci 3'-UTR MIR-30b. Ako je znázornené na obrázku 4B, sme zaznamenali výrazné zníženie aktivity luciferázy ( P Hotel &0,01) po contransfection luciferázy správy vektorov a mier-30b napodobňuje. Na rozdiel od toho žiadna zmena luciferázy bola pozorovaná v bunkách transfekciou mutantných 3'-UTR konštrukty. Tento výsledok bol potvrdený následne GFP represie experimenty. Ako je znázornené na obrázku 4C a 4D, GFP fluorescencie bola významne znížená v bunkách transfekciou GFP správy vektormi obsahujúcimi väzbové miesta a mier-30B mimiku, vzhľadom na to, že žiadna zmena fluorescencie GFP v bunkách transfekciou mutant vektora a mier-30b napodobňuje. Okrem toho, že nadmerná expresia Mir-30b v AGS a bunky HGC-27 viedla k down-regulácii hladín proteínových PAI-1 (obrázok 4E). Dohromady Vyššie uvedené dáta naznačujú, že PAI-1 je potenciálnym cieľom Mir-30b a mier-30b by mohli negatívne regulovať cieľový proteín.

inverzný korelácia medzi Mir-30b a PAI-1 expresie v žalúdku rakovinové tkanivá a bunkové línie karcinómu

Vzhľadom na to, že mier-30b je down-regulovaný u karcinómu žalúdka, a bolo publikované, že PAI-1 proteín v žalúdočných rakovinových tkanivách, je výrazne vyššia ako v nenádorových tkanív [ ,,,0],28], sme vykonali analýzu korelácie medzi Mir-30b a PAI-1 expresie v žalúdočných bunkových línií karcinómu a karcinómu žalúdka tkanív. Ako je znázornené na obrázku 5A hore, PAI-1 v krvi proteín bol najnižší v AGS bunke medzi piatimi žalúdočných bunkových línií. Na rozdiel od toho hladiny MIR-30b bol najvyšší v AGS, v porovnaní s inými bunkovými líniami (Obrázok 5A dole). Následne sme skúmali PAI-1 a Mir-30b expresiu v 21 sád rakovinou žalúdka a okolitom normálnom tkanív. Bolo zistené, že 81% (17/21) z karcinómov žalúdka zobrazená vyššia PAI-1 mRNA v porovnaní s normálnymi tkanivami. Na rozdiel od toho Mir-30b sa bežne down-regulované v 18 z 21 nádorov. Použitie porovnávacie analýzy Pearsonovho sme pozorovali významný inverzný koreláciu medzi Mir-30b a PAI-1 mRNA (obrázok 5B, R
= -0,6475, P
= 0,0123). Uvedené výsledky naznačujú, že mier-30b expresie je nepriamo úmerná PAI-1 expresie v karcinómu žalúdka, a zvýšenú PAI-1 expresie v karcinómu žalúdka môže byť spôsobené znížením expresie MIR-30b.

PAI-1 je potenciálne podieľa na Mir-30b-indukovanej apoptózy

Ak chcete ďalej skúmať, či PAI-1 sa podieľa na Mir-30b-podporované apoptózy, my najprv skúmal v prípade, že umlčanie PAI-1 expresie môže mať podobný apoptózu podporujúce účinok ako MIR-30b nadmernej expresie. SGC-7901 bunky boli transfekovány s PAI-1, siRNA alebo negatívne kontrolou (NC) RNA počas 48 hodín, ako je znázornené na obrázku 6A, hladiny mRNA PAI-1, môže byť významne znížená jeho siRNA. Následne PAI-1 siRNA zobrazená zjavné zvýšenie apoptotické sadzba v SGC-7901 buniek (Obr 6b, 6c), v porovnaní s Mir-kontrolou. Pozoruhodne, PAI-1 siRNA bol schopný phenocopy účinok nadmernej expresie Mir-30b na reguláciu apoptózy zhubných buniek (obrázok 6B, 6C). Jeden reprezentatívny príklad bodovom grafe bolo znázornené na obrázku 6D. Ďalej sme tiež skúmalo, či PAI-1 by mohla zrušiť účinok podporovať apoptózu MIR-30b. SGC-7901 bunky boli transfekovány s Mir-regulácia alebo MIR-30b napodobňuje po dobu 24 hodín, a následne transfekciu s PAI-1 ľudskej cDNA ORF klonu vektora (označené ako PAI-1) alebo prázdnym vektorom. Ako je znázornené na obrázku 6E-G, nadexprimující PAI-1 malo za následok zrejmé potlačenie o vplyve MIR-30b-indukovanej apoptózy. Dohromady, naše výsledky naznačujú, že PAI-1 je potenciálne podieľa na Mir-30b-podporované apoptózy.

Diskusia

Aj keď deregulácie miRNA bola pozorovaná v žalúdočných rakovinových tkanivách a bunkových líniách sa presný molekulárnej mechanizmus, ktorým miRNA modulujú proces vzniku nádorového ochorenia nie je doteraz úplne objasnený. K dnešnému dňu bola hlásená rad miRNA že by fungovali ako onkogén v rozvoji rakoviny žalúdka [29], [30], však miRNA pôsobiť ako tumor supresorových génov je potrebné ďalej vyšetrovať.

Tu sme ukázal, Mir-30b sa down-regulovaný v rakovinových bunkách žalúdku a nádorových tkanivách. Naše dáta ukázali, že tiež overxepression MIR-30b by mohlo zlepšiť apoptózu buniek karcinómu žalúdka in vitro a in vivo, a mier-30b bol schopný potlačiť rast nádoru rakoviny žalúdka in vivo. Ďalej vyznačujúci sa PAI-1 ako potenciálny cieľ MIR-30b, a expresie Mir-30b bola nepriamo úmerná PAI-1 expresie v karcinómu žalúdka. Okrem toho, PAI-1 sa môže týkať v Mir-30b-indukovanej apoptózy. Uvedené zistenia naznačujú, MIR-30b môže pôsobiť ako nádorový supresor nového tým, že reguluje apoptózu nádorové bunky karcinómu žalúdka.

MIR-30b je jedným z rodiny Mir-30, ktorý je spojený s rozvojom mnohých typov nádorov. Avšak úloha MIR-30b vo vzniku nádorov je sporná. MIR-30b bolo publikované, že down-regulovaný u karcinómu prostaty [31], invazívne nádor močového mechúra [32], rakoviny štítnej žľazy, anaplastický [33], rakoviny pažeráka [34], a rakovina pľúc [35], vzhľadom na to, zvýšenú expresiu spätných 30b bol identifikovaný v meduloblastómu [36] a malígny mezotelióm [37]. Okrem toho, mier-30b bol identifikovaný ako jeden z nezávislých prediktory bez návratu ochorenia, ktoré prežili, hepatocelulárneho karcinómu [38]. Vzhľadom k tomu, Mir-30b bol buď up-regulovaný alebo skrátila rôznych typov nádorového ochorenia, mohli by sme dospieť k záveru, že mier-30b môže hrať rôzne úlohy ako onkogén alebo tumor supresorového génu u rôznych druhov rakoviny.

V súčasnej štúdii , sme zistili, že mier-30b expresie v porovnaní s normálnymi tkanivami žalúdka významne znížila v žalúdočných rakovinových tkanivách a bunkových líniách. V súlade s naším zistením bolo zistené, že mier-30b, ktoré majú byť po-vyjadrený mikroRNA poľa od 184 karcinómov žalúdka a 169 nenádorových sliznice [39], a Qiao et al zistili, že mier-30b sa down-exprimovaný v žalúdku rakoviny tkaniva a žalúdočné rakovinové bunkové línie, AGS a BGC-823 bunky [40]. Preto strata expresie MIR-30b môže byť spojený s patogenézy a progresie karcinómu žalúdka.

Apoptóza je usporiadaná proces, bunkovú smrť, ktorý sa vyskytuje vo fyziologických a patologických podmienok. Narušenie tohto citlivej rovnováhy môže viesť k rozvoju rakoviny [27]. Teraz málo je známe o vplyve MIR-30b o apoptózy v nádorových ochorení. Kontroverzný expresie MIR-30B naznačuje, zložitosť funkcie MIR-30b. V poslednej dobe, Li et al [41] zistili, že mier-30b bola významne znížená v reakcii na stres stimuláciu oxidačné a mier-30b môže inhibovať štiepenie mitochondrií a následnú apoptózu. Naopak bolo preukázané, že mier-30 môže inhibovať samoobnovy a indukujú apoptózu prsných buniek nádor začatí (BT-IC), umlčením Ubc9 a ITGB3 [42]. Uvedené dôkazy naznačujú, že mier-30 je multifunkčný gén, ktorý môže inhibovať alebo indukovať apoptózu. V súčasnej správe, sme zistili, že ektopická expresia MIR-30b by mohli indukovať apoptózu buniek karcinómu žalúdka in vitro, a zvýšenú expresiu Mir-30b môže významne inhibovať rast tumorov u nahých myší modeli xenoimplantátu indukciou apoptózy buniek karcinómu žalúdka in vivo. Uvedené zistenia naznačujú, že mier-30b môžu zohrávať potenciálnu úlohu v rozvoji rakoviny žalúdka tým, že podporuje apoptózu nádorových ochorení.

K preskúmaniu molekulárnej mechanizmus je základom funkcie MIR-30b, je dôležité určiť jeho cieľový gén. V poslednej dobe niekoľko nové ciele MIR-30b boli potvrdené vrátane p53 [43], ako Delta-4 [44], a Snail1 [45]. V našej štúdii, PAI-1was identifikovaný ako cieľový gén Mir-30b v karcinómu žalúdka. PAI-1 je hlavný inhibítor tPA a UPA a PAI-1 môže blokuje aktiváciu plazminogénu. Bolo dobre zdokumentované, že expresia PAI-1 je u karcinómu žalúdka vyššia ako u kontrolných tkanív, a PAI-1 môže slúžiť ako nový prognostický faktor karcinómu žalúdka, predpovedanie kratšie prežitie [28], [46], [47 ]. Je zaujímavé, že nedávny dôkaz ukazuje protumorigenic aktivitu PAI-1 môže byť cez antiapoptotickým funkcie [22]. Naša štúdia ukázala, že mier-30b expresie bola nepriamo úmerná PAI-1 expresie v karcinómu žalúdka bunkových línií a nádorových tkanivách, PAI-1 nadmerná expresia by mohla pôsobiť proti účinku podporovať apoptózu MIR-30b, a ektopická expresia Mir-30b mali podobné propagáciu-apoptózu efekt v porovnaní s umlčanie PAI-1 expresiu. To naznačuje, že os MIR-30b-PAI-1 sa môže podieľať na vzniku rakoviny žalúdka. Avšak je potrebné v smere dráhy, ktoré majú byť ďalej skúmaná.

Rozvoj rakoviny žalúdka je charakterizovaný multi-faktoriálový a viacstupňového procesu, a H. pylori
Ukázalo sa, že hlavnou príčinou rakoviny žalúdka. Nedávne správy o našom výskume a ďalších štúdií ukázali regulačnú úlohu miRNA vo H. pylori
infekcie a súvisiacich ochorení. miRNA je potenciálny most zo H. pylori
infekcie chronickej gastritídy a rakoviny žalúdka [16], [48], [49]. Vzhľadom k MIR-30b, môže to mať multi-funkciu vo H. pylori
infekcie a H. pylori
-associated ochorenia. Naše predchádzajúce Správa zistila, MIR-30b bol schopný regulovať proces autofagie zacielením ATG12 a BECN1 počas H. pylori
pretrvávajú infekcie [19].

• Ploche ONE: Intratumor IL-17-Positive žírne bunky sú hlavným zdrojom IL-17, ktorá je prediktívne prežitia v žalúdočnej pacientov s rakovinou
• Ploche ONE: Helicobacter pylori podporuje epitelu-mezenchymálnych prechodu v rakoviny žalúdka podľa Downregulating Programovaná bunková smrť proteín 4 (PDCD4)