PLOS ONE: miR-30b, regulada no câncer gástrico, promove a apoptose e suprime Tumor Crescimento alvejando Plasminog�io Activator Inhibitor-1

Abstract

Fundo

O câncer gástrico é um dos a maioria das doenças malignas comuns em todo o mundo. Algumas evidências tem mostrado que microARNs (miARNs) estão associados com o desenvolvimento e progressão do tumor. Nossos estudos anteriores revelaram que H. pylori
foi capaz de induzir a expressão alterada de miR-30B em células epiteliais gástricas. No entanto, pouco se sabe sobre o papel potencial do miR-30b no câncer gástrico.

Métodos

Analisamos a expressão de miR-30b em linhas celulares de cancro gástrico e tecidos de câncer gástrico humano. Foi examinado o efeito de imita o miR-30B na apoptose de células de cancro gástrico in vitro por citometria de fluxo (FCM) e ensaios de caspase-3/7 de actividade. modelo de murganho de xenoenxerto nu foi usada para determinar se o miR-30b está envolvido na tumorigénese do cancro gástrico. O alvo de miR-30b foi identificado por análise de bioinformática, ensaio de luciferase e Western blot. Finalmente, foi realizada a análise de correlação entre o miR-30b e sua expressão alvo no cancro gástrico.

Resultados

miR-30b foi significativamente regulada em células cancerosas gástricas e tecidos de câncer gástrico humano. expressão forçada de miR-30b promoveu a apoptose de células de cancro gástrico, in vitro, e miR-30b pode inibir significativamente a tumorigenicidade de cancro gástrico, aumentando a proporção de apoptose de células cancerosas in vivo. Além disso, do activador de plasminogénio inibidor-1 (PAI-1) foi identificada como o alvo potencial de miR-30b, e o nível de miR-30b foi inversamente correlacionada com a expressão de PAI-1 no cancro gástrico. Além disso, o silenciamento de PAI-1 foi capaz de fenocópia o efeito de sobre-expressão de miR-30b na regulação da apoptose de células cancerosas, e a sobre-expressão de PAI-1 pode suprimiu o efeito de promover a apoptose das células por miR-30b, indicando PAI-1 é potencialmente envolvidos na apoptose induzida por miR-30B em células cancerosas.

Conclusão

miR-30b pode funcionar como um gene supressor de tumor no cancro gástrico romance por segmentação de PAI-1 e regulação da apoptose de células cancerosas. miR-30b poderia servir como um potencial biomarcador e alvo terapêutico contra o câncer gástrico

Citation:. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) miR-30b, regulada no câncer gástrico, promove a apoptose e suprime Tumor Crescimento alvejando Plasminog�io Activator Inhibitor-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10.1371 /journal.pone.0106049

editor: Gerolama Condorelli, Federico II Universidade de Nápoles, Itália, Itália |

Recebido: 07 de maio de 2014; Aceito: 28 de julho de 2014; Publicação: 29 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.202.310), Innovation Foundation Investigação Científica da Terceira Universidade Médica Militar (No. 2009XQN20). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico provoca cerca de 738.000 mortes no mundo por ano, e tem sido reconhecida como a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em homens [1]. diagnóstico precoce e tratamento levaram a excelentes expectativas para a sobrevivência a longo prazo e bom prognóstico, enquanto as perspectivas para pacientes com câncer gástrico avançado continua a ser pobre. Como outros tipos de câncer, o desenvolvimento de câncer gástrico é pensado para ser multifatorial. Helicobacter pylori (H. Pylori)
infecção tenha sido reconhecida como um importante desencadeador do câncer gástrico [2]. Embora muitas alterações genéticas e epigenéticas foram relatados no câncer gástrico, o mecanismo molecular subjacente ao desenvolvimento de câncer gástrico permanece obscuro.

microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes que posttranscriptionally regulam a expressão do gene. miARNs maduro pode ligar-se especificamente a 3 'UTR do ARNm celular alvo, por sua vez provocando a degradação do mRNA ou a inibição da tradução [3], [4]. miARNs actuam como reguladores chave em uma ampla variedade de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação celular, apoptose, metabolismo, e a transdução de sinal [5], [6]. Demonstrou-se que 50% dos miARNs estão frequentemente situados em regiões genómicas ou associados ao cancro em locais frágeis [7]. Evidências crescentes têm mostrado que miARNs aberrantes expressão correlaciona-se com vários cancros humanos e indica que miARN pode funcionar como oncogenes ou genes supressores de tumores [8] - [10]. Recentemente, um número substancial de miARNs desregulados incluindo miR 106b 25-aglomerado, o miR-21, o miR-218, miR-7, e miR-335 foram identificados como moduladores do crescimento celular, apoptose, migração, ou invasão de cancro gástrico desenvolvimento [11] - [15]. Estes achados sugerem os miRNAs podem desempenhar um papel crucial na patogênese do câncer gástrico.

Os nossos estudos anteriores revelaram que H. pylori
foi capaz de induzir a expressão alterada de miRNAs em células epiteliais gástricas, incluindo miR-155, miR-146a e miR-30b, miRNAs podem funcionar como novos reguladores negativos para afinar H. pylori
inflamação induzida [16], [17]. Além disso, foi demonstrado que o miR-146a pode desempenhar um papel potencial no desenvolvimento de cancro gástrico, através da modulação da proliferação e apoptose das células cancerosas gástricas [18]. Notavelmente, também encontramos miR-30b poderia regular o processo de autofagia durante H. pylori
persistem infecção, contribuindo assim para a persistência de H. pylori
infecções [19]. No entanto, o papel de miR-30b no cancro gástrico é ainda em grande parte desconhecida.

inibidor do activador do Plasminogénio tipo 1 (PAI-1) é o principal inibidor da protease de serina de tecido do tipo (t-PA) e do tipo uroquinase ( u-PA) e activador do plasminogénio, por conseguinte, desempenha um papel importante no sistema plasminogénio-plasmina [20]. Estudos anteriores têm mostrado PAI-1 é um factor de prognóstico pobre em vários tumores comuns, e está associada a invasão e metástase [21] do cancro. Recentemente, vários grupos também descobriram que o PAI-1 pode promover o crescimento do tumor por meio da inibição de apoptose das células. Por exemplo, a adição de um tipo selvagem estável de PAI-1 para a linha de células de cancro da próstata humano PC-3, a linha celular de leucemia promielocítica humana HL- 60 e até mesmo células não tumorais, resultou numa inibição significativa de apoptose [22] . Quando injectadas subcutaneamente em ratinhos nus com PAI-1 sobre-expressam as células de fibrossarcoma de murídeo, os tumores foram rapidamente estabelecido, enquanto que o PAI-1 de células deficientes em tinha uma tumorigenicidade suprimida [23]. Outro relatório mostrou que a inibição farmacológica de genética e de PAI-1 em linhas celulares tumorais humanas HT-1080 (, A549, HCT-116 e MDA-MB-231) aumento da apoptose espontânea, e curiosamente, implantado PAI-1 knockdown HT- 1080 células para PAI-1 camundongos knockout resultou na diminuição da tumorigênese e sobrevivência prolongada em comparação com ratos de controlo [24]. Estes estudos fornecem evidências importantes que PAI-1 exerce um papel protetor contra a apoptose de células tumorais.

No presente estudo, descobrimos que miR-30b foi significativamente regulada em células cancerosas gástricas e tecidos tumorais. A expressão ectópica de miR-30b poderia promover a apoptose de células de cancro gástrico, in vitro, e miR-30b pode inibir significativamente a tumorigenicidade de cancros gástricos em modelo de ratinho nu de xenoenxerto. Além disso, o PAI-1 foi identificado como os potenciais alvos de miR-30b, e miR-30b podem induzir a apoptose e suprimir o crescimento do tumor através da repressão da expressão de PAI-1. Nossos resultados sugerem que miR-30b pode funcionar como um gene supressor de tumor romance em câncer gástrico e pode ser um alvo potencial terapia para câncer gástrico.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo animal Ethical and Experimental Comitê da Terceira Universidade médica Militar. Todas as cirurgias animal foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. O estudo envolvendo amostras de tecido foi aprovado pelo Conselho de Revisão Ética na Terceira Universidade Médica Militar, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes antes da participação.

Os espécimes de tecido

No total, tecidos com cancro gástrico e tecidos não tumorais adjacentes foram obtidos a partir de doentes com cancro gástrico primário submetidos a gastrectomia radical na Southwest Hospital, Terceira Military Medical University, China, e as características clinicopatológicas de doentes com cancro gástrico são resumidos na Tabela 1. Após a remoção cirúrgica, os tecidos foram congelados imediatamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. O estudo foi aprovado pelo conselho de ética revisão no Terceiro Universidade Médica Militar, e o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes antes da participação.

linhas de células e cultura de células

Todas as linhas de células utilizadas neste estudo foram obtidos a partir de Xangai Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), os humanos gástricas celulares de cancro linhas AGS foi cultivada em meio F12 de Ham médio (Hyclone) com 10% de soro fetal de bovino (FBS), outras linhas celulares de cancro gástrico MKN45 , HGC-27, BGC-823, a SGC-7901 e de rim embrionário humano (HEK) 293 células foram cultivadas em DMEM (Hyclone) com FBS a 10%, todos eles foram mantidas numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _{2 em 37 ° C tal como anteriormente descrito.}

RT-PCR quantitativo

O ARN total foi extraído com o reagente de Trizol (Invitrogen), seguido por uma transcrição reversa, utilizando ensaios TaqMan miARN (Ambion), com pequeno U6 RNA nuclear como uma referência normalizada interno. reacções de qRT-PCR foram realizadas usando os seguintes parâmetros: 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 30 s. análises de qRT-PCR para o ARNm de PAI-1 foram realizadas utilizando kits de PrimeScript de RT-PCR (Takara), como os seguintes parâmetros: 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 5 s e 72 ° C durante 30 s. O nível de ARNm de β-actina foi utilizado como um controlo interno. As sequências dos iniciadores utilizados estão apresentados na Tabela 2.

Northern blot

de tamanho reduzido ARN foi isolado utilizando o kit de isolamento de ARN miRvana (Ambion). Três pares de amostras clínicas foram escolhidos aleatoriamente a partir dos 21 pacientes para análise de Northern blot subsequente. Northern blot foi realizada de acordo com o procedimento padrão como descried anteriormente [17]. As sondas de oligonucleótido anti-sentido de ADN utilizado para detectar o miR-30b e U6 snRNA foram como se segue: o miR-30b (5'-AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') e U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3')

transfecção celular.

imita miR-30b, mexidos miR-controle, quimicamente modificados duplex miR-30b (agomir), quimicamente modificados mexidos miR-controle, PAI-1 siRNA, ou controle de siRNA negativo foram adquiridos de GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., China). PAI-1 (Serpine1) Human cDNA ORF Clone foi comprado de Origene (OriGene Technologies, Beijing, China). As transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.

ensaio celular por apoptose FCM

células SGC-7901 ou HGC-27 foram semeadas em placa de 12 poços a uma adequada densidade e cultivadas a 30% de confluência após 24 h. Em seguida, as células foram transfectadas com imita o miR-30B ou miR-controlo, e o meio foi substituído por DMEM isento de soro durante 48 h. Para o experimento de co-transfecção com o miR-30b e PAI-1 expressando vector, as células SGC-7901 foram transfectadas com miR-controlo ou miR-30B imita, e, em seguida, com PAI-1 humano de ADNc ORF Clone vector (indicado como PAI-1) ou vector vazio 24 h mais tarde. 24 h após a transfecção vector, o meio foi substituído por DMEM isento de soro durante mais 24 h. Finalmente, as células foram aplicados à análise de apoptose. Para a análise de FCM, um kit de anexina V-FITC Detection apoptose I (BD Pharmingen) foi utilizado, em seguida, analisados ​​por citometria de fluxo (BD FACSCantoTM II).

Caspase-Glo 3/7 Ensaio

a actividade da caspase-3/7 foi detectada usando a caspase-Glo 3/7 Assay (Promega). Adicionar 100 ul da caspase-Glo 3/7 reagente para placa de 96 poços de paredes brancas, misturar suavemente o conteúdo dos poços, e, em seguida, os poços incubar à temperatura ambiente durante 30 min. A luminescência foi detectada usando o GloMax-96 microplacas Luminómetro (Promega).

ensaios de tumorigenicidade em ratinhos nus

Os ratos utilizados neste experimento foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos. Viável mimics- miR-30b e células SGC-7901-controlo transfectadas miR (1 × 10 ^{6) foram suspensos em 100 ul de PBS e em seguida injectado por via subcutânea em ambos os lados do flanco posterior da mesma fêmea BALB /c atímicos ratinho nu com 4 a 6 semanas de idade como descrito anteriormente [25]. O crescimento do tumor e da condição, incluindo a saúde geral e comportamento dos ratinhos foram examinados de três em três dias, durante 4 semanas. Os murganhos de tumor beared não exibiram sinais de desconforto ou dor, tais como a perda de peso ou alterações comportamentais, assim todos os ratos foram sacrificados por CO _{2 asfixia no dia 28 pós-injecção. O volume do tumor (V) foi monitorizado por medição do comprimento (L) e a largura (W) com pinças e calculada com a fórmula (L x W 2) x 0,5.}}

coloração TUNEL

Os tumores foram colhidos no dia 26, e fixadas em solução de formaldeído a 10%, em seguida, embebidas em parafina. Secções (5 mm de espessura) que foram desparafinizadas e reidratadas foram coradas com hematoxilina e eosina. células tumorais apoptóticas foram coradas pelo método in situ mediada por desoxinucleotidiltransferase dUTP nick rotulagem extremidade terminal (TÚNEL), utilizando um kit de detecção in situ a morte celular (POD; Roche Diagnostics Co.). O controlo negativo foi submetido à mesma coloração para TUNEL sem TdT. As imagens foram coletadas com auxílio de microscópio com × 200 ampliação.

Construção de plasmídeos

A construção de vários vectores relatório luciferase para o alvo miR-30b foi realizada como descrito anteriormente [16], [26] e a construção contendo a região de sementes mutante foi gerado como um controlo. As sequências dos oligonucleótidos utilizados são mostrados na Tabela 2.

de ensaio de luciferase e GFP repressão experiências

células HEK-293 foram semeadas em placas de 96 poços a 5000 células por poço no dia antes da transfecção. As células foram transfectadas com cada vector repórter da luciferase do pirilampo, de controlo de luciferase de Renilla vector, pRL-TK (Promega), e imita o miR-30B ou miR-controle (GenePharma). O ensaio de luciferase foi realizada utilizando o sistema de ensaio de repórter duplo de luciferase (Promega).

Para as experiências de GFP repressão, células HEK-293 foram semeadas em placa de 12 poços a 1 × 10 ^{5 por poço a dia antes da transfecção e, em seguida, foram co-transfectadas com os imitadores de miR-30B ou miR-controlo com vários vectores repórter GFP. As células foram submetidas a análise citométrica de fluxo, e os dados foram analisados ​​utilizando o software CellQuest Pro.}

Western blot

As células tratadas foram lavadas com PBS gelado e depois lisadas através de um tampão de lise celular (Perfurar). Após centrifugação a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C, a concentração de proteína foi medida pelo kit de ensaio de proteína BCA (Pierce). Os lisados ​​de proteína celular foram separadas em 12% SDS em gel de poliacrilamida desnaturada e, em seguida, transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite seco sem gordura em solução salina tamponada com Tris, pH 7,4, contendo 0,05% de Tween 20, e foram incubadas com anticorpos primários para o PAI-1 (1:1000, Abcam) e β-actina (1:1000 , Santa Cruz) a 4 ° C durante a noite, respectivamente. As membranas foram lavadas e incubadas com anticorpos conjugados com peroxidase de rábano (1:5000 secundárias, Santa Cruz) de acordo com as instruções do fabricante. A proteína de interesse foi visualizada usando substrato ECL transferência de Western (Pierce) e Sistema de Documentação Chemidoc XRS Gel (BioRad).

A análise estatística

Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (SD) a partir de pelo menos três experiências independentes. O teste t de Student foi aplicado para analisar as diferenças entre os grupos. A relação entre o nível de miR-30b e PAI-1expression foi analisada utilizando a correlação de Pearson. A análise estatística foi realizada com o software SPSS (versão 17). As diferenças estatísticas foram declarados significativa em P Art < 0,05. dados estatisticamente significativos são indicadas por asteriscos ( P Art < 0,05 (*), P
. < 0,01 (**)

Resultados

Redução da expressão de miR-30b em linhas celulares de cancro gástrico humano e amostras de tecido de GC

Para determinar o papel de miR-30b na patogénese do cancro gástrico, foram analisados ​​os níveis de miR-30B em várias células de cancro gástrico, incluindo HGC-27, AGS, BGC-823 e SGC-7901. Como mostrado na Figura 1A, a expressão de miR-30b foi significativamente regulada para baixo em quatro linhas celulares em comparação com um grupo de cinco tecidos gástricos não tumorais ( P
<.. 0,01)

A expressão de miR-30b foi posteriormente examinada em 21 GC emparelhado e tecidos gástricos não tumorais adjacentes através quantitativa TaqMan-PCR em tempo real (qRT-PCR) Como mostrado na Figura 1B, a diminuição de miR-30b foi encontrado em 18 dos 21 pacientes (85,7%) em comparação com os tecidos não tumorais correspondentes. Além disso, o diagrama de dispersão mostrou que o miR-30b foi significativamente regulada para baixo em amostras de cancro gástrico contra mucosa gástrica normal, com uma redução média 6,28 vezes ( P
= 0,002) (Figura 1C). Para validar os dados de expressão adquiridos de qRT-PCR, 3 de todos os 21 pares de amostras foram aleatoriamente escolhido para determinar o nível de miR-30b utilizando o parafuso do Norte. Encontramos também a consistente redução da expressão de miR-30b no câncer gástrico em comparação com os tecidos gástricos não tumorais (Figura 1D). Estes resultados sugerem que a expressão de miR-30b é frequentemente sub-regulada no cancro gástrico e talvez envolvidos no desenvolvimento do cancro gástrico.

A sobre-expressão de miR-30b aumenta a apoptose de células de cancro gástrico

Uma das característica do cancro é a sua capacidade para escapar apoptose [27], de modo que examinou o efeito de miR-30b em células de cancro gástrico apoptose. SGC-7901 ou células HGC-27 foram transfectadas com imita miR-30b ou mexidos miR-controle, e a validade do miR-30b expressão ectópica foi confirmada por qRT-PCR (Figura 2A). Em seguida, o efeito de miR-30b sobre a apoptose de SGC-7901 ou células HGC-27 foi avaliada por ensaios de citometria de fluxo de análise (FCM) e caspase-3/7 de actividade. Tal como mostrado na Figura 2B e 2C, encontramos a proporção de células em apoptose foi significativamente aumentada em SGC-7901 ou HGC 27 células transfectadas com imita o miR-30B, em comparação com as células de controlo transfectadas miR (16,08% relação
8,25% para as células SGC-7901, e 17,83% contra
10,87% para as células HGC-27). Além disso, aumento significativo na actividade da caspase-3/7 foi encontrada na SGC-7901 ou HGC-27 as células transfectadas com o miR-30b em comparação com os transfectantes de miR-controlo ( P
< 0,01, Figura 2D). Acima resultados revelam que a sobre-expressão de miR-30b pode promover a apoptose de câncer gástrico in vitro.

miR-30b suprime tumorigenicidade e promove células da apoptose in vivo

Para determinar ainda se miR-30b é envolvidos na tumorigênese do câncer gástrico, foi utilizado nu mouse modelo de xenotransplante. Porque descobrimos que miR-30b desempenhou um papel mais significativo na promoção da SGC-7901 apoptose das células de HGC-27 células in vitro, nós explorar o papel do miR-30b na tumorigênese do câncer gástrico utilizando células SGC-7901. miR-controlo-e-miR-30b células transfectadas SGC-7901 foram injectadas subcutaneamente em cada flanco posterior dos mesmos ratinhos nus. Os ratinhos foram seguidos por observação do crescimento do xenoenxerto, durante 4 semanas. Verificou-se que a introdução de miR-30B em células SGC-7901 conduziram a uma redução significativa no tamanho do volume do tumor (Figura 3A e 3B) de células, e tumores derivados de miR-30b tratada SGC-7901 cresceram mais lento em comparação com o controle grupo durante todo o período de crescimento do tumor (Figura 3C, painel esquerdo). Quando os tumores foram colhidos, o volume médio dos tumores derivados do grupo que imita o miR-30b foi apenas 27,87% do que no grupo de miR-controlo (Figura 3C, painel da direita, P
< 0,01). Os tumores foram colhidos no dia 26 a partir de dois lados do flanco posterior do mesmo rato, apoptose in situ foram medidos pelo método TUNEL. Tal como mostrado na Figura 3D, a partir de secções de tumor imita o miR-30B xenoenxertos tratados apresentaram um aumento significativamente em células positivas TUNEL. Estes resultados sugerem fortemente que a introdução de miR-30b poderia inibir o crescimento do cancro gástrico, promovendo apoptose de células cancerosas.

PAI-1 é um gene alvo candidato de miR-30b

Para avaliar ainda mais a função de miR-30b, é importante para determinar quais os ARNm do hospedeiro estão a ser regulados por miR-30b. No nosso estudo anterior, examinou-se o perfil de expressão de ARNm em cinco pares de tecidos tumorais primários de doentes com cancro gástrico e combinados tecidos não tumorais utilizando microarrays. Totalmente, encontramos 303 genes regulados positivamente (prega mudança > 2, P
< 0,05) em tecidos de cancro gástrico em comparação com os tecidos não tumorais (dados não apresentados). Considerando a expressão subregulado de miR-30b no câncer gástrico, enfocamos a lista de genes que mostram aumento das expressões e selecionou os 30 melhores aumento genes no cancro gástrico, então, determinado se esses genes eram potenciais alvos de miR-30b, utilizando o algoritmo de previsão , TargetScan. Curiosamente, verificou-se que o PAI-1 gene que foi regulada positivamente em micromatriz (3,83 vezes, P
= 0,04) pode ser um gene alvo provável de miR-30b (Figura 4A). Para abordar directamente se o miR-30b liga-se a 3'-UTR do ARNm alvo, construímos os vectores de luciferase de relatórios que contêm o putativo locais dentro 3'-UTR ligação miR-30b. Como mostrado na Figura 4B, observou-se uma redução acentuada na actividade da luciferase ( P
< 0,01) após contransfection de vectores de relatório luciferase e imita o miR-30B. Em contraste, não foi observada nenhuma alteração da luciferase em células transfectadas com as construções mutantes 3'-UTR. Este resultado foi posteriormente confirmada por experimentos GFP repressão. Tal como mostrado na Figura 4C e 4D, a GFP de fluorescência foi significativamente reduzida em células transfectadas com vectores de relatório GFP contendo sítios de ligação e imita o miR-30B, ao passo que não houve nenhuma alteração de fluorescência da GFP em células transfectadas com o vector mutante e miR-30B imita. Além disso, a sobre-expressão de miR-30b em AGS e células HGC-27 resultou na diminuição da regulação dos níveis de proteína de PAI-1 (Figura 4E). Tomados em conjunto, os dados acima sugerem que a PAI-1 é um potencial alvo de miR-30b, e miR-30b pode regular negativamente a proteína alvo.

correlação inversa entre miR-30b e PAI-1 na expressão gástrica tecidos de cancro e linhas celulares de cancro

Considerando que o miR-30b é sub-regulada no cancro gástrico, e foi relatado que a PAI-1 de proteína em tecidos de cancro gástrico é significativamente maior do que nos tecidos não tumorais [ ,,,0],28], foi realizada a análise de correlação entre o miR-30b e PAI-1 expressão em linhas celulares de cancro gástrico e tecidos com câncer gástrico. Como mostrado na Figura 5A superior, nível de proteína de PAI-1 foi a mais baixa em células AGS entre as cinco linhas de células gástricas. Em contraste, nível de miR-30b foi a maior da AGS, em comparação com outras linhas de células (Figura 5A inferior). Subsequentemente, examinámos o PAI-1 e miR-30b expressão em 21 conjuntos de cancro gástrico e tecidos não tumorais adjacentes. Descobrimos que 81% (17/21) dos cancros gástricos exibido mais elevados de PAI-1 mRNA em comparação com tecidos normais. Em contraste, o miR-30b era comumente regulada em 18 de 21 tumores. Usando a análise de correlação de Pearson, observamos uma significativa correlação inversa entre miR-30b e PAI-1 mRNA (Figura 5B, R
= -0,6475, P
= 0,0123). Os resultados acima sugerem que a expressão de miR-30b está inversamente correlacionada com a expressão de PAI-1 no cancro gástrico, e expressão aumentada de PAI-1 em cancro gástrico pode ser um resultado de uma redução da expressão de miR-30b.

PAI-1 é potencialmente envolvidos na miR-30b induzida por apoptose

Para investigar se a PAI-1 está envolvido na apoptose miR-30b-promovido, primeiro testado se o silenciamento de expressão de PAI-1 pode ter o semelhante promovendo apoptose efeito que a sobre-expressão de miR-30b. células SGC-7901 foram transfectadas com ARNsi de PAI-1 ou ARN de controlo negativo (CN) durante 48 h, como mostrado na Figura 6A, os níveis de ARNm de PAI-1 pode ser significativamente reduzida por sua siARN. Subsequentemente, o PAI-1 siRNA exibida óbvios aumentos na taxa de apoptose em células SGC-7901 (Figura 6b, 6c), em comparação com o miR-controlo. Notavelmente, o PAI-1 foi capaz de siRNA fenocópia o efeito de sobre-expressão de miR-30b na regulação da apoptose de células de cancro (Figura 6B, 6C). Um exemplo representativo de gráfico de pontos foi mostrado na Figura 6D. Em seguida, nós também examinou se PAI-1 poderia revogar o efeito de promover a apoptose por miR-30b. células SGC-7901 foram transfectadas com miR-controlo ou miR-30B imita durante 24 horas, e seguido por transfecção com PAI-1 humano de ADNc do clone ORF vector (indicado como PAI-1) ou vector vazio. Como mostrado na Figura 6E-G, o que sobre-expressam de PAI-1 resultou na supressão óbvio sobre o efeito de apoptose induzida por miR-30b. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que o PAI-1 é potencialmente envolvidos na apoptose miR-30b-promovido.

Discussão

Embora a desregulamentação miRNAs tem sido observada em tecidos de câncer gástrico e linhas celulares, o mecanismo molecular exato pelo qual miRNAs modular o processo de desenvolvimento de neoplasias ainda não está totalmente elucidada. Até à data, uma série de pequenos RNAs tem sido relatado para funcionar como oncogenes no desenvolvimento do cancro gástrico [29], [30], no entanto miARNs agindo como genes supressores de tumor têm de ser mais investigada.

Aqui, nós mostrou miR-30b foi regulada em células cancerosas gástricas e tecidos tumorais. Os nossos dados também indicam que overxepression de miR-30b poderia melhorar a apoptose de células de cancro gástrico in vitro e in vivo, e miR-30b foi capaz de suprimir o crescimento do tumor de cancro gástrico in vivo. Foram caracterizados mais de PAI-1 como um alvo potencial de miR-30b, e a expressão de miR-30b foi inversamente correlacionada com a expressão de PAI-1 no cancro gástrico. Além disso, o PAI-1 é potencialmente envolvidos na apoptose induzida por miR-30b. Acima descobertas sugerem miR-30b pode actuar como um supressor de tumor novo através da regulação da apoptose de células de cancro no cancro gástrico.

miR-30b é um membro da família de miR-30, que está associada com o desenvolvimento de muitos tipos de cancros. No entanto, o papel de miR-30b na tumorigénese é controversa. miR-30b foi relatado para ser regulada no cancro da próstata [31], bexiga tumor invasivo [32], cancro da tiróide anaplásico [33], câncer de esôfago [34], e cancro do pulmão [35], enquanto que a expressão aumentada de miR- 30b foi identificada em meduloblastoma [36] e mesotelioma maligno [37]. Além disso, o miR-30b foi identificado como um dos preditores independentes para sobrevida livre de recidiva do carcinoma hepatocelular [38]. Desde miR-30b era ou sobre-regulada ou reduzido em diferentes tipos de câncer, podemos tirar uma conclusão que o miR-30b podem desempenhar diferentes papéis como um oncogene ou um gene supressor de tumor em vários tipos de câncer.

No estudo atual , descobrimos que a expressão de miR-30b foi significativamente diminuída nos tecidos de cancro gástrico e linhas de células em comparação com os tecidos normais gástricas. Consistente com nossa descoberta, miR-30b foi encontrado para ser down-expresso pela matriz microRNA de 184 cancros gástricos e 169 não-tumor mucosa [39], e Qiao et al descobriram que miR-30b foi down-expressa em tecidos de câncer gástrico e linhas celulares de cancro gástrico, as células AGS e BGC-823 [40]. Portanto, a perda de expressão de miR-30b pode ser associado com a patogênese e progressão do cancro gástrico.

A apoptose é um processo de morte celular que ocorre ordenados em condições fisiológicas e patológicas. Uma interrupção deste delicado equilíbrio pode levar ao desenvolvimento de cancro [27]. Agora, pouco se sabe sobre o efeito de miR-30b em apoptose em câncer. A expressão controversa de miR-30b sugere a complexidade da função de miR-30b. Recentemente, Li et al [41] verificaram que o miR-30b foi significativamente reduzida em resposta ao estímulo de stress oxidativo, e miR-30b poderia inibir a fissão mitocondrial e consequente apoptose. Pelo contrário, tem sido mostrado que o miR-30 pode inibir a auto-renovação e induzir a apoptose de células de mama de iniciação do tumor (BT-ICs) pelo silenciamento Ubc9 ITGB3 e [42]. evidências anteriores indicam que o miR-30 é um gene multi-funcional que pode inibir ou induzir a apoptose. No relatório actual, verificou-se a expressão ectópica de miR-30b poderia induzir a apoptose de células de cancro gástrico, in vitro, e a sobre-expressão de miR-30b podem inibir significativamente o crescimento tumoral no modelo de xenoenxerto de ratinho nu por induzir a apoptose das células de cancro gástrico in vivo. Acima achados sugerem que o miR-30b podem desempenhar o papel potencial no desenvolvimento do cancro gástrico, promovendo apoptose de cancro.

Para explorar o mecanismo molecular subjacente a função de miR-30b, é importante identificar o seu gene alvo. Recentemente, vários novos alvos de miR-30b foram confirmados incluindo p53 [43], como Delta-4 [44], e Snail1 [45]. No nosso estudo, PAI-1was identificado como um gene alvo de miR-30b no cancro gástrico. O PAI-1 é o principal inibidor do tPA e uPA e PAI-1 pode bloqueia a activação do plasminogénio. Tem sido bem documentado que a expressão de PAI-1 é mais elevada em cancro gástrico do que em tecidos de controlo, e de PAI-1 pode servir como um novo factor de prognóstico no cancro gástrico, prevendo menor sobrevivência [28], [46], [47 ]. Curiosamente, evidência recente mostra a actividade protumorigenic de PAI-1 pode ser através de uma função anti-apoptótica [22]. O nosso estudo mostrou que a expressão de miR-30b foi inversamente correlacionada com PAI-1 expressão em linhas celulares de cancro gástrico e tecidos tumorais, de PAI-1 sobre-expressão pode contrariar o efeito de promover a apoptose por miR-30b, e a expressão ectópica de miR-30b tinha semelhante efeito de promover a apoptose em comparação com silenciamento de PAI-1. Ele sugere que o eixo de miR-30b-PAI-1 pode estar envolvida no desenvolvimento de cancro gástrico. No entanto, a via de jusante é necessária para ser investigado.

O desenvolvimento de câncer gástrico é caracterizada por multi-factorial e processo de múltiplos estágios, e H. pylori
tem sido demonstrado que a causa principal do cancro gástrico. Relatórios recentes de nossa pesquisa e outros estudos têm destacado o papel regulador dos miRNAs no H. pylori
infecção e doenças associadas. miRNA é uma ponte potencial de H. pylori
infecção para gastrite crônica e câncer gástrico [16], [48], [49]. No que diz respeito a miR-30b, que podem ter multi-funções em H. pylori
infecção e H. pylori
doenças -associated. O nosso relatório anterior encontrou miR-30b foi capaz de regular o processo de autofagia, visando ATG12 e BECN1 durante H. pylori
persistem infecção [19].

• PLOS ONE: Células intratumoral IL-17-positivo de mastro são a fonte principal da IL-17 que é preditiva de sobrevida em pacientes com câncer gástrico
• PLOS ONE: Helicobacter pylori Promove epitelial-mesenquimal Transição em Câncer Gástrico por downregulating programada Protein Cell Death 4 (PDCD4)