Финансирование:. Это исследование была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (2012-P4KR 003) и грант Samsung Biomedical Research Institute (# SBRI-SP1B20111). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:. KW нанят Pfizer Inc. Тем не менее, это не меняет приверженность автора к все политики PLoS ONE на данных и материалов совместного использования. Авторы заявили, что не существует никаких других конкурирующих интересов.
В последнее время секвенирование экзома в 22 [11] и 15 [12] АРУ образцы показали частые инактивирующие мутации в клеточной адгезии и хроматином ремоделирования генов, а также генетические изменения отличались между подгруппами стратифицированных вирусом Эпштейна-Барр (EBV) или H. пилори Подготовка проб обогащение ExoME и секвенирование Соматическая изменения в EGCS Сравнение между ГКЦ и AGC Обсуждение
инфекции и микросателлитная нестабильность (MSI) статус. Для дальнейшего изучения генетических изменений, лежащих в основе ШС, мы провели весь секвенирование экзома в четырех согласованных пар ГКЦ и нормальной ткани, и сравнили результаты с теми, от АРУ.
Материалы и методы
<р> Опухоль и неопухолевых желудка ткани собирали из образцов гастрэктомии. Настоящее исследование было проведено после согласования с Советом по институциональному обзору Samsung Medical Center, и все пациенты дали письменное информированное согласие до операции. Для получения образцов опухолей, массы были и соли 4 см на валовой инспекции, а поверхность слизистой оболочки от каждой опухоли было закуплено. После того, как вложения в ОКТ средах, ткань была вырезана и H &Amp; E окрашивают. Образцы &Гт содержание опухоли 90% были выбраны для экстракции ДНК с Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, США) и обрабатывали РНКазой А, чтобы удалить остатки РНК. ДНК также извлечены из спаренных непораженной ткани желудка, который был получен на расстоянии от опухоли и подтверждено, без опухолей. MSI анализировалась с пятью маркерами NCI, как описано ранее [13]. Наличие EBV была обнаружена EBV-закодированы РНК Ситу
гибридизации, как описано выше, и только случаи с сильным сигналом в течение почти всех ядер опухолевых клеток считались положительными [14]. Дополнительные детали для образцов ГКЦ представлены в таблице 1.
<р> ExoME обогащение (SureSelect Human All Экзон Kit, Agilent Technologies) и библиотеки секвенирования Illumina были получены в соответствии с заводом-изготовителем инструкции. Вкратце, 3 мкг геномной ДНК стриженый с системой Covaris S2; фрагменты ДНК конца восстановлены, расширены с 'A' основанием на 3'-конце, лигировали с парно-концевых переходников и амплифицируют (четыре цикла). ExoME содержащих лигированную с адаптером библиотеки гибридизовали в течение 24 ч с биотинилированным приманок олиго-РНК и обогащенный стрептавидином, конъюгированным с магнитными гранулами. Окончательные библиотеки были дополнительно усилены через 11 циклов ПЦР и подвергали Illumina секвенирования на одной дорожке секвенсера HiSeq 2000 с целевым размером вставки из ~180 п.о.. Все секвенирование проводили с парными 65-ВР читает и проводили в соответствии со стандартным протоколом Ilumina в. В среднем, ~136.3 млн чистота фильтрованного чтений были сгенерированы для каждого образца. Средний процент дубликата считывает из-за ПЦР и оптические артефакты были в наборе данных 0%, а ~123.7 млн однозначно сопоставляются чтений были получены для каждого образца. В среднем, 69,1% от чтения в каждом образце, по крайней мере, 50% перекрытие с любом районе ± 100 пар оснований в SureSelect целую библиотеку ExoME приманки. Целевые регионы в каждом образце секвенировали на средней глубине 113,7 × с ~98.8% целевых областей покрыты ≥1 ×, ~94.3% ≥10 ×, ~82.4% ≥30 ×, ~70.8% ≥50 ×, ~66.4% ≥60 ×, ~62.2% ≥70 ×, ~58.2% ≥80 ×, ~54.4% ≥90 × и ~50.8% ≥100 ×. Подробные резюме сырого качества данных описаны в таблице S1. Для сравнения, тот же алгоритм (SMART), используемый в предыдущем наборе данных образцов AGC [11], был применен к этим данным для идентификации соматических вариаций однонуклеотидных и вставки /делеции (вставкам) Переоборудование из данных секвенирования короткого чтения. Набор данных на хранение в Европейском Нуклеотидного архив и могут быть доступны на http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.
<р> Мутации, обнаруженные ExoME секвенирования были дополнительно подтверждена с помощью ПЦР и Sanger секвенирования. В кратком изложении, праймеры конструируют с использованием программного обеспечения Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu), а последовательности перечислены в таблице S3. В ПЦР-амплификации продукты секвенировали с использованием v3.1 Cycle Sequencing Kit BigDye Terminator и ABI 3700 автоматизированного секвенатора (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Результаты
<р> в общей сложности 2,389 соматические мутации были идентифицированы в четырех образцах ГКЦ, из которых 1117 произошли в области кодирования или существенных сайтов сплайсинга (627 миссенс, нонсенс 32, 10 существенный сайт сплайсинга, 169 вставкам и 279 синонимами) (Рисунок 1, и таблицы 2 и S2). Один GC с MSI высокой была 727 не-молчащие мутации, в том числе генов репарации несоответствие ( MSH6
и MSH3
), в то время как три микросателлитных стабильных (ПСС) образцы имели в среднем 37 и разница приблизительно в 20 раз. В несинонимичными к синонимами отношени в раковых заболеваний ПСС как правило, выше, чем у MSI-высокой рака, но различие не было статистически значимым. C > T и G > А переходы были наиболее распространенной мутацией (61%) в ЭСК, и не было никаких существенных различий в единичных изменений пар оснований между MSI-высоким и ПСС рака (рис 2A и Таблица S4). 784 генов, несущих без молчащие мутации, 13 мутировали в двух или более образцах. К их числу относятся гены, как известно, участвуют в желудочном канцерогенезе ( TP53
) и представлены в каталоге соматической мутации в раковых заболеваний (COSMIC), чтобы мутировать в ГКС ( DYRK3, MCM10, PCDH17
и UNC5C
) (Таблица 3). Из генов, отобранных для проверки, PCDH17
мутация была, скорее всего, не подтверждено методом Sanger из-за низких частот мутантного аллеля (таблица S3). Интересно, что в диффузного типа ГКЦ с MSI-высокий, элемент EGFR
(c.2224G > A, p.V742I). Мутация была выявлена
<р> Для сравнения наших результатов по ГКЦ с таковыми АРУ, были использованы два недавно опубликованных данных секвенирования целом ExoME [11], [12]. Ван и др
. обнаружено 164 не бесшумной и 48 синонимичные мутации в среднем в 22 образцах AGC с 116 × средней глубины покрытия [11]. Занг и др
. обнаружено в среднем 50 не бесшумной и 16 синонимичных соматических мутаций в 15 образцах AGC со средней глубиной 96 × покрытия [12]. При прямом сравнении между четырьмя ЭСК и 37 АРУ, не было никаких существенных различий в количестве типов мутаций (Рисунок 1). Отдельные изменения базовых пар в ЭСК были аналогичны предыдущему отчету Ванга и др
. [11], показывая отчетливо большее количество C &GТ; T и G &Гт А переходы в обоих ПСС и MSI-высоких опухолей (Рисунок 2A и Таблица S4). Интересно, что C > G переходы были более распространены в кишечном типа, чем в ШС диффузного типа во всех образцах ПСС, в которую входили три EGCS и 18 АРУ (Вилкоксона критерий суммы рангов, P
= 0,010) (рис 2B и таблица S4).
<р> в 37 AGC и 4 образцах ГКЦ, не молчащие мутации (миссенс, нонсенс, эфирное сайт сплайсинга и вставкам) были обнаружены в 3,372 и 784 генов, соответственно. В обоих ЭСК и АРУ 268 генов часто мутируют; клавиши BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI
и TP53
гены мутировали по меньшей мере двух образцов ГКЦ, и ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22
и гены ТТН
, а также другие, были связаны с АРУ с ложной скоростью открытия &л; 0,2 [11], [12] (рисунок 3). Функциональный анализ аннотаций с использованием DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov), чтобы исследовать гены, найденные совпадения между двумя наборами образцов показало, что значительно обогащенные термины включали актин связывание, цитоскелет, проекции клеток и межклеточной соединение (таблица S5).
<р> Хотя весь секвенирование экзома было сообщено в течение 37 образцов AGC [11], [12], не было такого исследования, чтобы оценить раннюю канцерогенез на генетическом уровне. Для того, чтобы изучить полный репертуар соматических мутаций в ЭСК, мы провели весь секвенирование экзома четырех парных образцов ГКЦ, и нашли четкие и общие генетические сигнатуры между ЭСК и АРУ, которые могут идентифицировать гены, участвующие в ранней канцерогенеза и последующей прогрессии.
<Р> эпителиального рака часто имеют переменную спектры мутации, указывающие на конкретных мутагенных стимулов [15], [16]. Например, высокий уровень A &° С и C > наблюдались Т-переходы в пищеводу аденокарциномы и подвергающихся воздействию солнечных лучей меланом, соответственно, предполагая, что эти мутации связаны с гастроэзофагеальной рефлюксной и ультрафиолетового облучения [15], [17]. Предыдущее исследование секвенирования генома в двух желудка аденокарциномы показали частые C &Гт А и Т &Гт А изменения по сравнению с нормальными геномами [18]. Здесь мы нашли частое C &G Гт переходы в карцином кишечного типа по сравнению с диффузного типа ШС после исключения MSI-высоких ШС. Наши уникальные наблюдения гарантирует, будущие исследования, чтобы определить конкретные этиологию, что потенциально способствует пониманию сложных и малоизученными молекулярных путей ГКС кишечного типа.
<Р> С помощью сравнительного анализа, мы выявили 268 перекрывающихся генов с не молчащих мутаций общих обоими ЭСК и АРУ (рисунок 3). Около одной трети из не-молчащих мутаций в ЭСК являются общими с АРУ и 8% не-молчащих мутаций, обнаруженных в АРУ используются совместно с ЭСК. Предыдущее исследование с анализа экспрессии генов показал, что большинство изменений, связанных с ЭСК сохраняются в АРУ и дальнейшие изменения экспрессии знак перехода от Г.К.Ц. к АРУ [10]. В целом, эти результаты указывают на то, что EGC представляет собой раннюю стадию молекулярной АРУ, и часто мутировавшие гены играют важную роль в прогрессии от ГКЦ к АРУ. Мы вновь подтвердили, что TP53
является наиболее часто мутированным геном в ШС, с TP53
мутации найдены в половине ГКЦ и две трети образцов АРУ. Среди перекрывающихся генов, AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A
и RPL22
были аннотированный, как онкогенов, в то время как ATM, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2 <бр> и TP53
были гены-супрессоры по Сэнгера Gene переписи (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census~~HEAD=pobj). Из генов переписи рака, мы сначала определили EGFR
мутации (c.2224G > A, p.V742I) в диффузной типа EGC с MSI-высоко. В недавнем исследовании на 63 MSI-высокой ШС, EGFR
мутация не была обнаружена путем прямого секвенирования домена киназы (экзоны 18, 19, 20 и 21) [19]. Та же мутация V742I сообщалось у пациентов с раком эндометрия и в клеточной линии глиомы [20], [21]. Клиническая значимость этой редкой мутации должно быть подтверждено в ближайшем будущем.
<Р> Хотя распространенность рецидивирующих мутаций в ЭСК была относительно низкой, 13 гены мутировали, по крайней мере, двух образцах, и было очень мало синонимами, интронные и /или нетранслируемые мутации. Среди этих 13 генов, DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
и UNC5C
могут быть специфическими для ранней стадии GC, что свидетельствует о возможной роли в раннем канцерогенеза. В нашей серии, PCDH17
мутации произошли в ШС кишечного типа с MSS, в том числе один EBV-положительные пробы. Предыдущие глобальные геномный анализ колоректального и рака поджелудочной железы также показало миссенс мутации в некоторых членов PCDH
(протокадгерина) подсемейства [22], [23]. Тем не менее, мутации, обнаруженные в наших ЭСК путем Illumina секвенирования не были подтверждены Sanger секвенирования, вероятно потому, что мутантный аллель частоты были очень низкими. UNC5C
принадлежит к семейству рецепторов функциональной зависимости, члены которой разделяют способность вызывать апоптоз в отсутствие их лигандов [24], [25]. Аберрантная метилирование этого гена было сообщено в процессе канцерогенеза желудка, и это метилирование исчез в высокоразвитых ГКС [26]. Для остальных генов, их функциональная значимость в GC остается неясным.
<Р> Потеря функции в молекул клеточной адгезии увеличивает способность опухолевых клеток к вторжению окружающих тканей, а также дисфункции в хроматином ремоделирования комплекс способствует хромосомной нестабильности, которая управляет туморогенез [27]. Ни один из наших образцов ГКЦ не было белка изменяющие мутации хроматином ремоделирования генов, обнаруженных в АРУ, такие как ARID1A, MLL3, PBRM1
и MBD2
[11], [12], подтверждая хроматина изменение происходит в конце прогрессии GC.
<р> в целом, наше исследование показывает, что ГКЦ и AGC имеют общие соматические мутации, и AGC связано с дополнительными кумулятивных генетических изменений в клеточной адгезии и хроматином ремоделирования генов. Молекулярные подписи, отличающие EGC от AGC имеют важное значение для выявления новых прогностических маркеров и потенциальных терапевтических мишеней. Более крупные исследования необходимы, чтобы определить биологическую значимость мутировавших генов рекуррентно в ЭСК.
Поддержка Информация
таблице S1.
Резюме статистики в целом секвенирование экзома для четырех пар образцов желудочного
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s001
(PDF)
Таблица S2.
Список всех соматических мутаций в начале рака желудка, выявленных ExoME секвенирования
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s002
(XLS)
Таблица S3.
Грунтовки для Sanger секвенирования, частоты аллели и результатов проверки
DOI: 10.1371. /journal.pone.0082770.s003
(PDF)
Таблица S4.
Сравнение соматической спектров точечной мутации рака желудка с помощью состояния опухоли и гистологического типа
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s004
(PDF)
Таблица S5.
DAVID пути анализ 268 перекрывающихся генов между ранней и передовых рака желудка
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s005
(XLS)
Исследование:микробы, вызывающие сердечные приступы
Влагалищные бактерии, способствующие преждевременным родам
Гигиена полости рта и тяжесть COVID-19 - связь
То, что вы едите, может изменить то, как антибиотики влияют на кишечник
PENTAX Medical собирает 125 долларов,
Новый инструмент для расшифровки микробиома кишечника
Сильный микробиом в раннем возрасте связан с меньшим количеством респираторных инфекций
В разных частях тела человека, в том числе в носу, есть колонии микроскопических бактерий. рот, кишечник и легкие. Коллективно эти бактерии известны как микробиота организма. Исследования показали,
Тип кишечных бактерий может увеличить риск рака кишечника
Новое исследование, представленное на конференции NCRI Cancer Conference 2019, показало, что люди с определенным типом бактерий в кишечнике могут иметь больше шансов заболеть раком кишечника.
Правильно ли указаны уровни микробов на этикетках коммерческих кефирных продуктов?
Микробиом кишечника - важная часть человеческого организма, как это стало совершенно очевидно из множества исследований, проведенных за последние несколько десятилетий. Международная научная ассоциаци