PLoS ONE: Exome sekvenciranje Identificira Rani karcinom želuca kao ranoj fazi Advanced želučani Cancer

Sažetak pregled

Želučani karcinom je jedan od glavnih uzroka smrtnosti od raka povezanih širom svijeta. Rano otkrivanje i liječenje vodi izvrstan prognozu u bolesnika s ranim rakom želuca (EGC), dok je prognoza bolesnika s uznapredovalim rakom želuca (AGC) ostaje siromašan. Nejasno je da li EGCs i AGCs su zasebni entiteti ili da li EGCs su na početku faze AGCs. Proveli smo cijeli exome slijed od četiri uzorka od bolesnika s EGC i usporedili rezultate s onima iz AGCs. U oba EGCs i AGCs ukupno 268 gena obično su mutirane i neovisni mutacije dodatno naći u EGCs (516) i geni AGCs (3104 gena). Visoka učestalost C > G prijelaza zabilježeno je u crijevnoj tipa u odnosu na difuzno tipa karcinoma ( P pregled = 0,010). DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 pregled i UNC5C pregled geni opetovano su mutirani u EGCs i mogu biti uključeni u ranoj karcinogeneze pregled

Izvor:. Kang G , Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY, Lee J., et al. (2013) Exome sekvenciranja Identificira Rani karcinom želuca kao ranoj fazi Advanced rak želuca. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10,1371 /journal.pone.0082770 pregled

Urednik: Patrick Tan, Duke-National University Singapur Graduate Medical School, Singapur pregled

Primljeno: 17. srpnja 2013; Prihvaćeno: 27. listopada 2013; Objavljeno: 23. prosinca 2013 pregled

Copyright: © 2013 Kang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija je podržan od strane grant od National Research Foundation Koreje (2012.-P4KR 003) i donacija Samsung Biomedical Research Institute (# SBRI-SP1B20111). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

suprotstavljenih interesa. KW je zaposlen Pfizer Inc. Međutim, to ne mijenja autora pridržavanje svi PLoS ONE pravila o dijeljenju podataka i materijala. Autori su izjavili da ne postoje drugi suprotstavljeni interesi. Pregled

Uvod pregled

Želučani karcinom (GC) je heterogena bolest s više etiologija okoliša, alternativnih puteva karcinogeneze i bez poznata visoke frekvencije onkogenim perturbacija [1], [2], [3]. Klasifikacija Lauren je dokazano korisna u procjeni prirodni tijek GC, osobito s obzirom na incidencije trendove, kliničko korelacija i etioloških prekursora [4]. Lauren klasificirani želučane adenokarcinom u crijeva i difuzne prema morfološkim obilježjima tumora [4], [5], [6]. Crijevna tipa karcinoma Smatra se da će nastati sekundarno kronični atrofični gastritis povezan s H. pylori pregled i intestinalne metaplazije [7]. Difuzno tip GCS nisu povezani s intestinalne metaplazije, a može nastati iz jedne stanice mutacija unutar normalnih želučanih žlijezda [4], [8], [9]. Pregled

GC je jedan od glavnih uzroka cancer- vezane smrtnosti u svijetu. Rano otkrivanje i liječenje rezultira izvrsnom prognozom za pacijente s početkom rakom želuca (EGC), dok je prognoza bolesnika s uznapredovalim rakom želuca (AGC) i dalje loša. Međutim, nije jasno je li EGCs i AGCs su zasebni entiteti, ili su isti tumor napreduje od početka do naprednih stadija [10]. Molekularni potpisi se razlikuju EGC od AGC su važni za pomoć identifikaciju novih prognostičkih biljega i potencijalnih terapijskih ciljeva. Pregled

Nedavno exome sekvenciranje u 22 [11] i 15 [12] AGC uzorci pokazali su česte inaktivaciju mutacije u stanične adhezije i kromatina-pregradnja gene, a genetskim izmjenama razlikovali među podskupinama stratificiran prema Epstein-Barrov virus (EBV) ili H. pylori
infekcija i stanja mikrosatelitne nestabilnosti (MSI). Kako bi se dodatno istražiti genetičkih promjena temeljne GCS, proveli smo cijeli exome sekvenciranje u četiri podudarnih parova EGC i normalnog tkiva, i usporedili rezultate s onima iz AGCs. Pregled

materijali i postupci

Priprema uzoraka pregled

tumora i ne-maligne želučani tkiva prikupljeni su od gastrektomije primjeraka. Ova studija je provedena nakon odobrenja od Institutional Review Board Samsung Medical Center, a svi pacijenti dali pismeni informirani pristanak prije operacije. Za uzorke tumora, mase su > 4 cm na bruto inspekcije, a površina sluznica iz svakog tumora je nabavljena. Nakon usađivanja u OCT medijima, tkivo je izrezati i H &E obojeni. Uzorci > 90% sadržaj tumora su odabrane za dobivanje DNA sa Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i obrađena RNAzom A da se ukloni preostali RNA. DNA također je izvađen iz uparenim nepromijenjen želučanog tkiva, koja je dobivena su udaljena od mjesta tumora i potvrđeno da se bez tumora. MSI analizirana s pet NCI markera kao što je ranije opisano [13]. Prisutnost EBV se detektira EBV-kodirana RNK in situ hibridizacije pregled, kao što je prethodno opisano, a samo one slučajeve s jakim signalom unutar gotovo sve stanične jezgre tumorskih smatrani su za pozitivne [14]. Dodatne pojedinosti za uzorke EGC su u Tablici 1. pregled

Exome obogaćivanje i sekvenciranje pregled

Exome obogaćenje (SureSelect Human sve Egzon Kit, Agilent Technologies) i Illumina sekvenciranja knjižnice su pripravljeni prema proizvođačeve upute. Ukratko, 3 ug genomne DNA je presječena s Covaris S2 sustava; DNA fragmenti su na kraju popravio, proširena sa 'A' baze na 3 'kraju, veže s upareni-end adapteri i pojačan (četiri ciklusa). Exome koji sadrži adapter-ligiran biblioteke su hibriđizirani tijekom 24 sati s biotiniliranim oligo-RNA mamaca i obogaćen s streptavidinom konjugiranim magnetske kuglice. Konačni knjižnice su dodatno pojačani kroz 11 PCR ciklusa i podvrgnuti Illumina sekvenciranja na jednoj traci od sekvencer HiSeq 2000 sa ciljanom veličinom insert iz ~180 bp. Sva sekvenciranja su pokrenuti s uparenim kraju 65 bp čita i provodi se u skladu Ilumina standardnog protokola. U prosjeku, ~136.3 milijuna čistoća filtriran čita se generira za svaki uzorak. Srednja postotak duplikatu čita zbog PCR i optičkih artefakata je bila 0% u našem skupu podataka, a ~123.7 milijuna jedinstveno mapirati čita dobiveni su za svaki uzorak. U prosjeku, 69,1% od čita u svakom uzorku je imao najmanje 50% preklapanja s bilo ciljane regije ± 100 bp u SureSelect cijeli exome mamac knjižnici. Ciljani regije u svakom uzorku su sekvencirani da prosječnom dubinom od 113,7 ×, uz ~98.8% od ciljanih područja pokrivena ≥1 ×, ~94.3% ≥10 x, ~82.4% ≥30 x, ~70.8% ≥50 ×, ~66.4% ≥60 x, ~62.2% ≥70 x, ~58.2% ≥80 x, ~54.4% ≥90 x i ~50.8% ≥100 ×. Detaljne sažetke sirove kvalitete podataka opisani su u tablici S1. Za usporedbu, isti algoritam (SMART), a koristi se u prethodnom setu podataka uzoraka AGC [11], primijenjen je na tim podacima i identificirati somatske jednog nukleotida varijacije i umetanja /delecija (indels) Promjene iz sekvenciranja podataka kratko pročitati. Skup podataka je pohranjena u Europskoj Nukleotidni arhivu i može se pristupiti na http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850. pregled

Mutacije otkriven exome sekvenciranje su dodatno ovjeren od strane PCR i Sanger sekvenciranje. Ukratko, primeri su dizajnirani pomoću Primer3 softvera (http://frodo.wi.mit.edu), te niz navedene su u tablici S3. PCR-umnoženi proizvodi su zatim sekvencionirani upotrebom BigDye Terminator v3.1 ciklus sekvencioniranja Kit i ABI 3700 automatiziranog sekvencera (tnom City, CA, USA). Pregled

Rezultati

somatske promjene u EGCs Netlogu

u ukupno, 2.389 somatske mutacije su identificirani u četiri EGC uzoraka, od kojih je 1.117 dogodile u kodiranju regije ili bitnih mjesta obrade (627 misscnsc, 32 besmislene, 10 bitna Mjesto spoja, 169 indels i 279 sinonimi) (slika 1 i tablicama 2 i S2). Jedan GC sa MSI-high imala 727 non-tihe mutacije, uključujući mismatch popravak gena ( MSH6 pregled i MSH3 pregled), a tri mikrosatelitne stabilan (MSS) uzorci imali prosjek od 37, razlika od otprilike 20 puta. U nonsynonymous za sinonim omjerima u raka rukopisnim obično biti veća nego u MSI visokom raka, ali ta razlika nije statistički značajna. C > T i G > A prijelazi su najčešći mutacija (61%) u EGCs, i nije bilo značajne razlike u pojedinim promjena parova baza između MSI visoke i rukopisnim raka (slika 2a i Tablica S4). Za 784 gena koji nosi non-tihe mutacije, 13 su bili mutirani u dva ili više uzoraka. Među njima su geni koje je poznato da se uključe u želučanoj karcinogeneze ( TP53 pregled), a objavljeno u Katalogu somatske mutacije u Raku (svemirskom) koji će se mutirati u GCS ( DYRK3, MCM10, PCDH17 pregled i UNC5C pregled) (Tablica 3). Gena odabranih za provjeru, PCDH17 pregled mutacija vjerojatno nije ovjeren od strane Sanger metodom zbog niskih frekvencija mutanata alela (Tablica S3). Zanimljivo je da je u difuzna tipa EGC sa MSI-high, EGFR pregled (c.2224G > A, p.V742I). Mutacija je identificiran pregled

Usporedba EGC i AGC Netlogu

Za usporedbu rezultata na EGC s onima AGCs, dvije nedavno objavljene sekvenciranja podaci cijeli exome korišteni su [11], [12]. Wang i sur pregled. otkrivena 164 non-tih i 48 sinonim mutacije u prosjeku u 22 AGC uzoraka s 116 × prosječna dubina pokrivenosti [11]. Zang i sur pregled. otkrivena u prosjeku 50 ne-tih i 16 sinonim somatskih mutacija u 15 uzoraka AGC sa 96 × prosječna dubina pokrivenosti [12]. U izravnom odnosu između četiri EGCs i 37 AGCs, nije bilo značajne razlike u broju vrsta mutacije (slika 1). Pojedine baze par promjena u EGCs bio je sličan prethodnom izvješću Wang i sur
. [11], što pokazuje izrazito veći broj C > T i G > prijelaza u oba MSS i MSI-visokim tumora (slika 2a i Tablica S4). Zanimljivo, C > G prijelazi bili su češći u crijevnoj tipa nego u difuzna tipa GCS u svim uzorcima rukopisnim, što je uključivalo tri EGCs i 18 AGCs (Wilcoxon rank zbroj test, P pregled = 0,010) (slika 2B i Tablica S4). pregled

u 37 AGC i 4 EGC uzoraka, non-tihe mutacije (missense, gluposti, bitno Mjesto spoja i indels) su pronađene u 3,372 i 784 gena, respektivno. U oba EGCs i AGCs, 268 geni su često mutirani; BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI pregled i TP53 pregled, geni su mutirani u najmanje dva uzorka EGC i ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22 pregled i TTN
gena, kao i ostali, bili su značajno povezani s AGCs s lažnim stopu otkrića < 0,2 [11], [12] (slika 3). Funkcionalna zapažanje analize pomoću DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) ispitati gene pronađene preklapanje između dva uzorka seta pokazala je da su znatno obogaćeni uvjeti uključeni aktin obvezujući, citoskelet, projekciju stanica i stanica-stanica spoj (Tablica S5). pregled

Rasprava pregled

Iako je cijeli exome sekvenciranje je prijavljen za 37 AGC uzoraka [11], [12], nije bilo takva studija za procjenu ranog karcinogeneze na genetskoj razini. Kako bi istražili kompletan repertoar somatskih mutacija u EGCs, proveli smo cijeli exome slijed od četiri uparenih uzoraka EGC i našao različita i zajedničke genetske potpise između EGCs i AGCs koji mogu identificirati gene koji su uključeni u ranoj karcinogeneze i naknadnog napredovanja. Pregled

epitelne karcinome često imaju promjenjivu mutacija spektara koji upućuju na određene podražaje mutagenih [15], [16]. Na primjer, visoke stope A &C i C > T prijelazi su kod jednjaka adenokarcinoma i suncu izloženim melanoma, odnosno, što ukazuje da ta mutacija mogu pripisati gastroezofagealni refluks i UV izloženosti [15], [17]. Prethodna genoma širom sekvencioniranje studija u dva želuca adenokarcinoma pokazala česte C > i T > A promjene u odnosu na normalne genoma [18]. Evo, našli smo česte C > G prijelaze u intestinalni tipa karcinoma u odnosu na difuznu tipa GCS nakon isključenja MSI-visokim GCS. Naša jedinstvena za promatranje jamči da buduće studije za definiranje specifičnih etiologija koji potencijalno pridonosi razumijevanju složenih i slabo razumije molekularnih puteva crijevna tipa GCS. Pregled

Kroz komparativne analize, identificirali smo 268 preklapaju gene s ne-tihe mutacije zajedničkim obje EGCs i AGCs (Slika 3). Otprilike jedna trećina od ne-tihe mutacije u EGCs dijele s AGCs i 8% ne-tihe mutacije koje se nalaze u AGCs se dijele s EGCs. Prethodna studija genima, analiza je pokazala da se većina promjena povezanih s EGCs zadržana u AGCs, a daljnje promjene ekspresije označiti prijelaz iz EGC AGC [10]. Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da EGC predstavlja rani stadij molekularnu AGC, a najčešće mutirani geni igraju važnu ulogu u napredovanju od EGC AGC. potvrdili smo da TP53 pregled je najčešće mutirani gen kod GCS, s TP53 pregled mutacije pronađene u pola EGC i dvije trećine uzoraka AGC. Među preklapaju genima, AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A pregled i RPL22 pregled su označeni kao onkogeni, dok je bankomat, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2
i TP53 pregled su tumor supresorski geni po Sanger gene popisa (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census~~HEAD=pobj). Od raka popisnih gena, prvo smo identificirali EGFR pregled mutacija (c.2224G > A, p.V742I) u difuznom tipa EGC sa MSI-visoka. U nedavnom istraživanju na 63 MSI-visokom GCS, EGFR pregled mutacija nije pronađen izravnim sekvenciranje domene kinaze (eksona 18, 19, 20 i 21) [19]. Isto V742I mutacija je prijavljen u bolesnika s karcinoma endometrija i u stanična linija glioma [20], [21]. Klinički značaj ove rijetke mutacije treba validirati u bliskoj budućnosti. Pregled

Iako je učestalost rekurentnih mutacija u EGCs bio je relativno nizak, 13 geni su mutirani u najmanje dva uzorka, a imao je vrlo malo sinonimi, intronske i /ili neprevedenih mutacije. Među ovih 13 gena, DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 pregled i UNC5C pregled mogu biti specifične za ranoj fazi GC, što ukazuje na moguću ulogu u ranom karcinogeneze. U našoj seriji, PCDH17 pregled mutacija dogodila u intestinalni tipa GCS s MSS, uključujući jednu EBV-pozitivni uzorak. Prethodna globalne genomske analize debelog i gušterače raka je također otkrio misscnsc mutacije na nekim članovima PCDH
(protocadherin) podskupina [22], [23]. Međutim, mutacije otkrivene u našim EGCs po Illumina sekvenciranje nisu potvrđeni Sanger sekvenciranje, vjerojatno zato što su mutirani alel frekvencije bile su vrlo niske. UNC5C pregled pripada obitelji funkcionalne ovisnosti receptora, članovi koji dijele sposobnost da inducira apoptozu u odsutnosti njihovih liganada [24], [25]. Netipična metilacije ovog gena je prijavljen u tijeku želučane karcinogeneze, a to metilacije nestao u visoko razvijenim GCS [26]. Za preostalih gena, njihova funkcionalna važnost u GC ostaje nejasan. Pregled

Gubitak funkcije u molekula stanične adhezije povećava sposobnost stanica na prodiranja u okolna tkiva i disfunkciju kromatina remodeliranja kompleksa potiče kromosomske nestabilnosti koja pokreće tumorigenesis [27]. Nitko od naših uzoraka EGC imali mutacije proteina koji mijenjaju kromatina remodeliranja gene pronađene u AGCs, kao što su ARID1A, MLL3, PBRM1 Netlogu i MBD2 pregled [11], [12], sugerirajući kromatina modifikacija javlja kasno u progresiji GC. pregled

Sve u svemu, naša studija ukazuje na to da EGC i AGC dijele zajedničke somatske mutacije, i AGC je povezana s dodatnim kumulativne genetske promjene u stanične adhezije i gena kromatina-pregradnja. Molekularni potpisi se razlikuju EGC od AGC su važni kako bi se identificirali novi prognostički biljezi i potencijalne terapijske ciljeve. Potrebne su veće studije kako bi se utvrdilo biološki značaj opetovano mutiranih gena u EGCs. Pregled

popratne podatke pregled Tablica S1. pregled Sažetak cijeli exome statistike sekvencioniranja za četiri para uzoraka želuca pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s001 pregled (PDF) pregled Tablica S2. pregled Popis svih somatskih mutacija u ranim želučanog karcinoma identificirane exome sekvenciranje pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s002 pregled (XLS) pregled Tablica S3.
Primeri za Sanger sekvenciranje, frekvencije alela i rezultata validacije pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s003 pregled (PDF) pregled Tablica S4. pregled Usporedba somatske spektara točkaste mutacije u želučanog karcinoma od strane države tumora i histološka tipa pregled, doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s004 pregled (PDF) pregled Tablica S5. pregled DAVID analiza put od 268 preklapaju gena u između ranog i razvijenog želučanog karcinoma pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s005 pregled (XLS) pregled