Plos ONE: Exome zaporedja Prepozna Zgodnje želodca karcinom kot zgodnji fazi Napredno Rak želodca

Povzetek

želodca karcinom je eden od glavnih vzrokov umrljivosti, povezane z rakom po celem svetu. Zgodnje odkrivanje in zdravljenje vodi odlično prognozo pri bolnikih z zgodnjim rakom želodca (EGC), medtem ko je prognoza bolnikov z napredovalim rakom želodca (AGC) ostaja slaba. Nejasno je, ali so EGCS in AGCS različni subjekti ali EGCS so na začetku faze AGCS. Izvedli smo celo exome zaporedja štirih vzorcih bolnikov z EGC in rezultate primerjali s tistimi iz AGCS. V obeh EGCS in AGCS je bilo skupno 268 genov pogosto mutiral in neodvisni mutacije so dodatno na voljo v EGCS (516 genov) in AGCS (3104 genov). Višja frekvenca C > G prehodi so opazili v črevesju tipa v primerjavi z razpršeno tipa karcinoma ( P
= 0,010). DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
in UNC5C
geni so ponavljajoče mutiral v EGCS in lahko sodelujejo v začetku rakotvornost

Navedba. Kang G , Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY Lee J., et al. (2013) Exome sekvenciranje Prepozna Zgodnje želodca karcinom kot zgodnji fazi Napredno želodca raka. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10,1371 /journal.pone.0082770

Urednik: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapur

Prejeto: 17. julij 2013; Sprejeto: 27. oktober 2013; Objavljeno: 23. december 2013

Copyright: © 2013 Kang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprla z nepovratnimi sredstvi iz National Research Foundation Koreje (2012-P4KR 003) in donacijo Samsung Biomedical Research Institute (# SBRI-SP1B20111). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi. KW je zaposlen s Pfizer Inc. Vendar to ne spremeni avtorja spoštovanje vsi Plos ONE politike se o izmenjavi podatkov in materialov. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo druge konkurenčne interese.

Uvod

želodca karcinom (GC) je heterogena bolezen s številnimi okoljskimi etiologij, alternativnih poti rakotvornosti in ni znano, visoke frekvence onkogenih motnje [1], [2] [3]. Razvrstitev Lauren se je izkazala za koristno pri ocenjevanju naravno zgodovino GC, zlasti v zvezi s pojavnostjo trendov, clinicopathologic korelacije in etiološke predhodnimi sestavinami [4]. Lauren razvrščeni želodčni adenokarcinom v črevesju in razpršeno po morfoloških značilnosti tumorja [4] [5] [6]. Črevesne tipa karcinomov so verjeli, da se pojavijo sekundarno zaradi kronične atrofični gastritis, povezane s H. pylori
in črevesne metaplazijo [7]. Difuzna-tipa sta GK niso povezane z intestinalno metaplazijo in lahko izhajajo iz enoceličnih mutacij v normalnih želodčnih žlez [4], [8], [9].

GC je eden od glavnih vzrokov za cancer- povezane smrtnosti po svetu. Rezultati zgodnjega odkrivanja in zdravljenja v odlično prognozo pri bolnikih z zgodnjim rakom želodca (EGC), medtem ko je prognoza bolnikov z napredovalim rakom želodca (AGC) ostaja slaba. Vendar pa ni jasno, ali so EGCS in AGCS različni subjekti ali so enaki tumor napreduje od začetka do poznejših fazah [10]. Molekulske podpisi razlikovanja EGC od AGC so pomembni za pomoč identifikacija novih prognostičnih označevalcev in potencialnih terapevtskih ciljev.

Pred kratkim exome zaporedja na 22 [11] in 15 [12] AGC vzorci so pokazali pogoste inaktivirajočo mutacije v celično adhezijo in kromatin-preoblikovanje genov in genetskih sprememb razlikovala med podskupinah z virusom Epstein-Barr (EBV) ali H stratificirano. pylori
okužbo in mikrosatelitno nestabilnost (MSI) stanje. Za nadaljnje raziskovanje genskih sprememb osnovnih GCS, smo izvedli celo exome zaporedja v štirih ujema parov EGC in normalnega tkiva, in rezultate primerjali s tistimi iz AGCS.

Materiali in metode

Priprava vzorca

Tumor in ne-neoplastične želodca tkiva so bili zbrani iz želodca osebkov. Sedanja Študija je bila izvedena po odobritvi revizijski odbor institucionalne Samsung Medical Center, in vsi bolniki so dali pisno obveščena privolitev pred operacijo. Za vzorce tumorskih so mase > 4 cm na bruto pregledu površina sluznica iz vsakega tumorja je nabavljeno. Po vključitvijo v medijih ČDO smo tkivo reši in H &E obarvali. Vzorci > 90% vsebnost tumor bili izbrani za ekstrakcijo DNA z Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, ZDA) in zdravljeni z RNazo A, da odstranimo preostalo RNA. DNA je bila vzeta tudi iz seznanjene neprizadeti želodčnega tkiva, ki je bilo pridobljeno oddaljena od mesta tumorja in potrjeno, da je tumor brez. MSI smo analizirali s petimi NKI označevalci, kot je prej opisano [13]. Prisotnost EBV je zaznal, EBV kodiran RNA in situ
hibridizacije kot je opisano prej, in le na primere, s močan signal v skoraj v vseh jeder tumorskih celic pozitiven, [14]. Dodatne informacije o vzorcih EGC so navedene v tabeli 1.

smo pripravili Exome obogatitev (SureSelect Human Vse Exon Kit, Agilent Technologies) in Illumina zaporedja knjižnice

obogatitev Exome in zaporedja
glede na proizvajalca navodila za uporabo. Na kratko, 3 ig genomske DNA strižejo s sistemom Covaris S2; DNA fragmenti so bili ob koncu popraviti, razširjena z "A" baze na 3'-koncu, ligirali z paru-end adapterji in dopolnjena (štiri cikle). Exome vsebujejo-adapter ligiramo knjižnice hibridiziramo 24 ur z biotiniliranih oligo-RNA vabe in obogaten s Streptavidin konjugirano magnetne kroglice. Končni knjižnice smo nadalje pomnožili z 11 ciklov PCR in izpostavljena Illumina sekvenciranja na enem pasu v sekvencer HiSeq 2000 s ciljno velikostjo vstaviti v ~180 bp. Vse sekvenciranje je teči s seznanjeno koncu 65-bp bere in je bila izvedena v skladu s standardnim protokolom Ilumina je. V povprečju ~136.3 milijonov čistost, filtriran glasi so bili ustvarjeni za vsak vzorec. Povprečni odstotek dvojnika bere zaradi PCR in optični artefaktov je v podatkovnem nizu 0% in ~123.7 milijonov enolično preslikajo odčitkov Dobimo za vsak vzorec. V povprečju 69,1% od bere v vsakem vzorcu je bilo vsaj 50% prekrivanja s katero koli ciljno območje ± 100 bp v SureSelect celotno exome vabe knjižnici. Ciljne regije v vsakem vzorcu je bilo razvrstiti, da povprečne globine 113,7 x, z ~98.8% prizadetih regij pokriva ≥ 1 ×, ~94.3% ≥10 ×, ~82.4% ≥30 ×, ~70.8% ≥ 50 x, ~66.4% ≥60 ×, ~62.2% ≥70 ×, ~58.2% ≥80 ×, ~54.4% ≥90 × in ~50.8% ≥ 100 ×. Podrobni povzetki surovega kakovosti podatkov so opisani v Tabeli S1. Za primerjavo, isti algoritem (SMART), ki se uporablja v prejšnjem CCD z AGC vzorcev [11], je bila uporabljena za te podatke, da prepoznajo somatskih različic single-nukleotidnih in vstavljanje /izbrise (indels) predelav iz podatkov zaporedja kratka branje. Nabor podatkov je bil deponiran v Evropski nukleotida arhiv in je na voljo na http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.

Mutacije s exome sekvenciranja odkrite so bile nadalje potrjeni s PCR in Sanger sekvenciranje. Na kratko, se primerji namenjeni uporabi Primer3 programske opreme (http://frodo.wi.mit.edu), in sekvence so navedeni v tabeli S3. Za PCR, pomnoženi izdelki so bili nato sekvenco uporabo BigDye Terminator V3.1 cikla sekvenciranje in za ABI 3700 avtomatiziran sekvencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA).

Rezultati

somatsko spremembe v EGCS

skupno je bilo ugotovljenih 2.389 somatske mutacije v štirih EGC vzorcev, od tega 1117 zgodili v kodiranje regije ali bistvenih spletnih mestih (627 missense, 32 nesmiselne, 10 bistveno spoja mesto, 169 indels in 279 sinonim) (Slika 1 in tabeli 2 in S2). Ena GC z MSI-high je imela 727 non-tihe mutacije tudi neusklajenost popravila genov ( MSH6
in MSH3
), ker trije mikrosatelitnih hlevu (MSS) vzorci so imeli v povprečju 37, A razlika približno 20-krat. V nonsynonymous do sinonim razmerja v raka MSS večinoma višja kot pri MSI-visoke raka, vendar razlika ni bila statistično značilna. C > T in G > A prehodi so najpogostejša mutacija (61%) v EGCS, in ni bilo bistvenih razlik v posameznih spremembami baznih parov med Msi visoke in MSS raka (Slika 2A in preglednica S4). Od 784 genov vzrejo niso tihe mutacije, je bilo 13 mutirala v dveh ali več vzorcev. Med njimi so bili geni za katere je znano, da sodelujejo pri želodčnem rakotvornosti ( TP53
) in poročali v katalogu somatskih mutacij v raka (COSMIC), da se mutiran v GK ( DYRK3, MCM10, PCDH17
in UNC5C
) (tabela 3). Genov, izbranih za potrditev, PCDH17
mutacija najverjetneje ne potrdi metodo Sanger zaradi nizkih frekvencah mutirani alel (tabela S3). Zanimivo je, da difuzna tipa EGC z MSI-high, An EGFR
(c.2224G > A, p.V742I) a. Je bila ugotovljena mutacija

Primerjava med EGC in AGC

Za primerjavo naših rezultatov na EGC s tistimi AGCS sta bila uporabljena dva nedavno objavljeni podatki zaporedja celotno exome [11], [12]. Wang et al
. Zaznali 164 non-tih in 48 sinonim mutacije v povprečju v 22 AGC vzorcev z 116 × povprečna pokritost globine [11]. Zang et al
. zazna povprečno 50 non-tih in 16 sinonim somatskih mutacij v 15 AGC vzorcih z 96 x povprečna pokritost globine [12]. V neposredni primerjavi med štirimi EGCS in 37 AGCS, ni bilo bistvenih razlik v številu tip mutacije (slika 1). Posamezne baza par sprememb v EGCS bili podobni predhodnim poročilom, ki ga Wang et al
. [11], kar kaže na izrazito večje število C > T in G > A prehode tako v MSS in MSI-visokih tumorjev (Slika 2A in preglednica S4). Zanimivo je, da C > so G prehodi pogostejši v črevesju tipa kot difuzna tipa GK v vseh vzorcih MSS, ki je vključevala tri EGCS in 18 AGCS (Wilcoxonov rang test vsota, P
= 0,010) (Slika 2B in tabela S4).

v 37 AGC in 4 EGC vzorcev, so odkrili brez tihe mutacije (missense, nonsense, bistveno spoja na mestu in indels) pri 3.372 in 784 genov, oz. V obeh EGCS in AGCS bilo 268 genov pogosto mutirani; BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI
in TP53
geni so mutirali v najmanj dveh EGC vzorcev, in ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22
in TTN
geni, pa tudi drugi, so statistično pomembno povezane z AGCS z lažno stopnjo odkrivanja < 0,2 [11], [12] (slika 3). Funkcionalna analiza označevanje igrali David (http://david.abcc.ncifcrf.gov), da preuči gene najdemo prekrivanje dveh vzorcih nizov je pokazala, da je bistveno, obogatene pogoji vključeni vezavo aktina, skeleta, mobilni projekcijo in celica-celica križišča (tabela S5).

Pogovor

Čeprav je bila celotna exome zaporedja poročali pri 37 AGC vzorcev [11], [12], je bil taka študija ne da oceniti zgodnje rakotvornost na genski ravni. Raziskati celoten repertoar somatskih mutacij v EGCS, smo izvedli celo exome zaporedje štirih parnih EGC vzorcev, in ugotovila, ločene in skupne genske podpisov med EGCS in AGCS, ki se lahko identificirajo genov, ki sodelujejo v začetku kancerogenosti in kasnejše napredovanje.

epitelijsko raka pogosto spremenljivo mutacija Spectra, ki kaže na določene mutagenih dražljaje [15], [16]. Na primer, visoke stopnje A > C in C > so v požiralnika adenokarcinomov soncu izpostavljeni melanomi, oz opazili T prehodi, kar kaže, da so te mutacije pripisati gastroezofagealni refluks in izpostavljenosti ultravijoličnim [15], [17]. Prejšnja genoma vsej študija zaporedja v dveh želodčnih adenokarcinomov pokazala pogoste C > A in T > A sprememb v primerjavi z običajnimi genomov [18]. Tukaj smo ugotovili, pogosto C > G prehode v karcinomov intestinalnega tipa v primerjavi z razpršeno tipa GCS po izključitvi MSI-visokih GK. Naša edinstvena dokumentacije potrebni za opazovanje prihodnje študije opredeljujejo posebne etiologijo, ki lahko prispeva k razumevanju kompleksnih in slabo razumljen molekularnih poteh črevesnih tipa GK.

S primerjalno analizo smo identificirali 268, ki se prekrivajo genov z ne-tihe mutacije v skupni rabi obe EGCS in AGCS (slika 3). Približno ena tretjina ne-tihe mutacije v EGCS se delijo s AGCS in 8% ne-tihe mutacije, ugotovljenih v AGCS se delijo s EGCS. Prejšnja študija z analizo izražanja genov je pokazala, da je večina sprememb, povezanih z EGCS ostane v AGCS in nadaljnje spremembe izraz označuje prehod iz EGC na AGC [10]. Na splošno so ti rezultati kažejo, da EGC predstavlja zgodnji molekularno stopnjo AGC, in pogosto mutirani geni igrajo pomembno vlogo pri napredovanju od EGC do AGC. ponovno potrdili smo, da je TP53
je najbolj pogosto mutirani gen v GK, z TP53
najdemo v polovici EGC in dve tretjini AGC vzorcev mutacije. Med prekrivajočih genov, AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A
in RPL22
so označeni kot onkogeni, ker ATM, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2
in TP53
so zaviralnih genov, ki jih je Sanger gene popis (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census~~HEAD=pobj). Genov Rak popisa, smo najprej prepoznali EGFR
mutacija (c.2224G > A, p.V742I) v difuzni tip EGC z MSI-high. V nedavni študiji o 63 MSI-high GK, EGFR
mutacija ni bila odkrita neposredno zaporedja kinaze domene (eksonih 18, 19, 20 in 21) [19]. Enako V742I mutacije so poročali pri bolniku z rakom endometrija in v glioma celične linije [20], [21]. Treba Klinični pomen te redke mutacije mora biti potrjena v bližnji prihodnosti.

Čeprav je razširjenost ponavljajočih se mutacij v EGCS razmeroma nizka, 13 geni so mutirali v najmanj dveh vzorcih, in je imel zelo malo sinonim, intronskih in /ali neprevedena mutacije. Med temi 13 genov, lahko DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
in UNC5C
je specifična za zgodnji fazi GC, kar kaže na morebitno vlogo v zgodnji rakotvornost. V naši seriji, PCDH17
mutacije v črevesnih tipa GK z MSS, vključno z enim EBV-pozitiven vzorec. Prejšnji globalne genomske analize debelega črevesa in trebušne slinavke raka je pokazala tudi missense mutacije v nekaterih članov PCDH
(protocadherin) poddrużin [22], [23]. Vendar pa mutacije odkrite v naših EGCS z Illumina sekvenciranje niso potrdile Sanger sekvenciranja, verjetno zato, ker so bili mutant alelov frekvence zelo nizka. UNC5C
spada v družino funkcionalno odvisnost receptorjev, katere člani delijo sposobnost, da povzroči apoptozo v odsotnosti njihovih ligandov [24], [25]. Odstopajoča metilacija tega gena so poročali v teku želodčne karcinogeneze, kar metilacije izginil visoko razvitih GK [26]. Za preostale genov, njihovo funkcionalno ustreznost v GC ostaja nejasna.

Izguba funkcije v celičnih adhezijskih molekul povečuje sposobnost tumorskih celic, da napadejo okoliška tkiva in motnje v-kromatina preoblikovanje kompleks spodbuja kromosomsko nestabilnost, ki poganja tumorigeneze [27]. Nobeden od naših EGC vzorcev je bilo, spreminjanje beljakovin mutacije najdemo v AGCS-kromatina preoblikovanje genov, kot je ARID1A, MLL3, PBRM1
in MBD2
[11], [12], ki kažejo kromatina sprememba zgodi pozno v napredovanje GC.

na splošno je naša raziskava kaže, da EGC in AGC delijo skupne somatskih mutacij, in AGC je povezano z dodatnimi kumulativne genskih sprememb v celični adhezijo in-kromatina preoblikovanje genov. Molekulske podpisi razlikovanja EGC od AGC so pomembne za pomoč pri identifikaciji novih prognostičnih označevalcev in potencialne terapevtske cilje. Večje študije so potrebne za določitev biološko pomen za periodično mutiranih genov v EGCS.

Podpora Informacije
Tabela S1.
Povzetek statistike celotno exome zaporedja štirih parov želodca vzorcev
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s001
(PDF)
Tabela S2.
Seznam vseh somatskih mutacij v zgodnjih raka na želodcu, ki jih exome sekvenciranja
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s002
(XLS)
Tabela S3.
premazi za Sanger sekvenciranje, pogostnosti alelov in rezultati validacije
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s003
(PDF)
Tabela S4.
Primerjava somatske točka mutacije spektrov v želodcu raka, ki ga države tumorja in histološki tip
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s004
(PDF)
Tabela S5.
DAVID analiza pot od 268 prekrivajočih genov med prvih in naprednih želodčnega raka
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s005
(XLS)

• Plos ONE: stroškovne učinkovitosti Analiza Ocenjevanje endoskopsko Nadzor za želodca raku za populacij z nizko do srednje Risk
• Plos ONE: telesni dejavnosti in Sedeči Vedenje v odnosu do požiralnika in želodca raka pri NIH-AARP kohorte v