PLoS ONE: Exome Sekos Identifikuoja Ankstyvas Skrandžio vėžys taip anksti išplitusiu skrandžio vėžiu

Anotacija

Skrandžio vėžys yra viena iš pagrindinių priežasčių vėžio susijusio mirtingumo visame pasaulyje. Ankstyvas ir gydymas lemia puikią prognozę pacientams su ankstyvos skrandžio vėžiu (EGC), o pacientams, sergantiems išplitusiu skrandžio vėžiu (AGC) prognozės išlieka prasta. Neaišku, ar egcs ir AGCs yra skirtingi subjektai ar egcs yra pradžioje etapai AGCs. Mes atlikome visą exome seka iš keturių mėginių iš pacientų, sergančių EGC ir palyginti rezultatus su tais, iš AGCs. Abiem egcs ir AGCs, iš 268 genų viso buvo dažniausiai mutavo ir nepriklausomi mutacijos buvo papildomai rasti egcs (516 genų) ir AGCs (3104 genų). Didesnis dažnis C > G perėjimai buvo pastebėtas žarnyno tipo, palyginti su difuzinis tipo karcinomos ( P
= 0,010). DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 parsisiųsti ir UNC5C
genai periodiškai mutavo į egcs ir gali būti įtraukti į ankstyvą kancerogenezėje

nurodomoji dalis:. Kanas G , Hwang tualetas, Ar I. Wang K Kang SY Lee J et al., (2013) Exome sekos Identifikuoja Ankstyvas Skrandžio vėžys taip anksti išplitusiu skrandžio vėžiu. PLoS ONE 8 (12): e82770. Doi: 10,1371 /journal.pone.0082770

redaktorius: Patrickas Tan kunigaikštis-Singapūro nacionalinio universiteto Graduate medicinos mokyklos, Singapūras

Įstojo: 17 liepa 2013; Priėmė: Balandis 27, 2013 m Paskelbta 23 d, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Kang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijos iš nacionalinio mokslinių tyrimų fondo Korėjos (2012-P4KR 003) ir "Samsung" biomedicinos tyrimų institutas dotacijos (# SBRI-SP1B20111). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų. KW dirba Pfizer Inc. Tačiau tai nekeičia autoriaus laikytis visi PLoS ONE politika dalijimosi duomenimis ir medžiagų. Autoriai pareiškė, kad jokių kitų konkuruojančių interesų egzistuoja.

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra nevienalytė liga su keliais aplinkos etiologies, alternatyvių keliai kancerogenezėje ir nėra žinoma aukšto dažnio onkogeninių sutrikdymo [1], [2], [3]. Lauren klasifikacija buvo naudinga vertinant gamtos istoriją GC, ypač atsižvelgiant į paplitimo tendencijas, clinicopathologic koreliacijų ir etiologinis prekursorių [4]. Laura klasifikuojami skrandžio adenokarcinoma į žarnyno ir difuzinis pagal morfologinius požymius naviko [4], [5], [6]. Žarnų tipo karcinoma yra manoma, kad atsiranda antrinė lėtinio atrofinį gastritas, susijusių su H. pylori parsisiųsti ir žarnyno metaplazija [7]. Difuzinė tipo GCS nėra susijęs su žarnyno metaplazijos ir gali kilti iš vieno ląstelių mutacijų normalus skrandžio liaukų [4], [8], [9].

GC yra viena iš pagrindinių priežasčių vėžį visame pasaulyje susijusį mirtingumą. Ankstyva diagnostika ir gydymo rezultatai puikios prognozės pacientams su ankstyvos skrandžio vėžiu (EGC), kadangi pacientams, sergantiems išplitusiu skrandžio vėžiu (AGC) prognozės išlieka prasta. Tačiau neaišku, ar egcs ir AGCs yra skirtingi subjektai arba yra tas pats navikas progresuoja iš anksti stadijose [10]. Molekuliniai parašai skiriamųjų EGC iš AGC yra svarbu padėti identifikuoti naujų prognostinių žymenų ir galimą terapinį tikslus.

Neseniai exome sekos iš 22 [11] ir 15 [12] AGC mėginiai parodė, dažnai kenksmingumo mutacijos ląstelių sukibimą ir chromatino-remodeling genus, o genetiniai pakitimai skyrėsi tarp pogrupių skirstyta pagal Epstein-Barr viruso (EBV) arba H. Helicobacter pylori infekcija ir
Mikrosatelitinis nestabilumas (MSI) statusą. Toliau tirti genetinius pakitimus pagrindines GCS, mes atliekame visą exome seka keturių suderintų porų EGC ir normalaus audinio, ir palyginti rezultatus tiems iš AGCs.

Medžiagos ir metodai

Mėginio paruošimas

naviko ir ne navikiniai skrandžio audiniai buvo surinkti iš pašalintas skrandis egzempliorių. Šis tyrimas buvo atliktas po to, kai iš institucinių ekspertizės valdyba Samsung Medical Center patvirtinimo, o visi pacientai davė parašyta informuotas sutikimas prieš operaciją. Dėl navikų mėginiuose, mases buvo > 4 cm bruto patikrinimo ir paviršiaus gleivinė iš kiekvienos naviko buvo įsigyta. Po nusėdimo iš UŠT žiniasklaida, audinys buvo supjaustyti ir "H & El tamsintas. Mėginiai > 90% naviko turinys buvo atrinkti DNR ekstrahavimo su Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) ir veikiama RNaze A pašalinti likusį RNR. DNR taip pat buvo ekstrahuojamas iš suporuotas nepaliesto skrandžio audinio, kuris buvo gautas toli nuo auglio vietą ir patvirtinus, kad navikas be. MSI buvo analizuojami su penkiais NCI žymenų kaip aprašyta anksčiau [13]. Iš EBV buvimas buvo aptikta EBV koduotas RNR situ
hibridizacijos kaip aprašyta anksčiau, ir tik bylas su stipriu signalu per beveik visi naviko ląstelių branduoliuose buvo laikomas teigiamu [14]. Papildoma informacija apie EGC pavyzdžių pateikiami 1 lentelėje

Exome sodrinimas ir sekos

Exome praturtėjimas (SureSelect Žmogaus Visi Exon komplektas, Agilent Technologies) ir ILLUMINA sekos bibliotekos parengta pagal gamintojo instrukcijos. Trumpai, 3 mikrogramų genominės DNR buvo šlyties jėgos, su Covaris S2 sistemos; DNR fragmentai buvo galutinio remontuoti, pratęsti su "A" bazė ant 3 'gale, susiūta su suporuotas-end adapteriai ir sustiprina (keturių ciklų). Exome, kurių sudėtyje yra adapteris-susiūta bibliotekas buvo kryžminosi 24 h su Biotinilintų oligo-RNR jaukų ir praturtintas avidino konjuguoto magnetinių rutuliukų. Galutiniai bibliotekos buvo papildytas per 11 PGR ciklų ir taikomos ILLUMINA sekos vienos juostos į HiSeq 2000 sequencer su tikslingai įterpti dydžio ~180 bp. Visi sekos buvo paleisti su suporuotas pabaigoje 65-BP skaito ir buvo atlikta pagal Ilumina standartinio protokolo. Vidutiniškai ~136.3 mln grynumas filtruojami skaito buvo sukurtas kiekvienam mėginiui. Vidutinis procentas egzemplioriais skaito dėl PGR ir optiniai artefaktai buvo 0% mūsų duomenų rinkinio ir ~123.7 mln unikaliai priskirti skaito buvo gautas kiekvieno mėginio. Vidutiniškai 69,1% nuo skaito kiekviename mėginyje buvo ne mažiau kaip 50% susimaišys su tikslinio regiono ± 100 bp į SureSelect visa exome masalas bibliotekoje. Tiksliniuose regionuose kiekviename mėginyje buvo sekos prie vidutinis gylis 113,7 ×, su ~98.8% tikslinių regionų, kuriems ≥1 x, ~94.3% ≥10 ×, ~82.4% ≥30 ×, ~70.8% ≥50 ×, ~66.4% ≥60 ×, ~62.2% ≥70 ×, ~58.2% ≥80 ×, ~54.4% ≥90 × ir ~50.8% ≥ 100 ×. Išsamios santraukos neapdorotų duomenų kokybės aprašyti S1 lentelėje. Palyginimui, tas pats algoritmas (SMART), naudojamas ankstesnio rinkinį iš AGC pavyzdžių [11], buvo taikomas šių duomenų nustatyti somatinių vieno nukleotido variantus ir intarpai /trynimus (indels) pakeitimai nuo trumpo skaityti sekos duomenis. Duomenų rinkinys buvo deponuotas Europos nukleotidų archyvą ir gali būti prieinama http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.

aptiktų exome sekos mutacijos toliau buvo patvirtinta PGR ir sekos Sanger. Trumpai tariant, gruntai yra skirtos naudoti primer3 programinę įrangą (http://frodo.wi.mit.edu) ir sekos yra išvardytos S3 lentelėje. PGR-amlifikuoti produktai buvo tada sekos naudojant BigDye Terminatorius v3.1 Cycle Sequencing Kit ir ABI 3700 automatizuotą sekwencer (taikoma BIOSYSTEMS, Foster City, CA, JAV).

Rezultatai

Somatinių pakitimai egcs

iš viso 2,389 somatinės mutacijos buvo nustatyta keturių EGC mėginių, iš kurių 1117 įvyko kodavimo regionus arba esminius kirpimo vietų (627 missense, 32 nesąmonė, 10 svarbu sudurti svetainę, 169 indels ir 279 sinonimas) (1 pav ir 2 lentelėse ir S2),. Vienas GC su MSI aukštos turėjo 727 ne tylus mutacijas įskaitant neatitikimas remonto genų ( MSH6 parsisiųsti ir MSH3
), o trijų mikrosatelitiniai stabilus (MSS) mėginiai buvo pasikeista 37 Vidutiniškai, skirtumas maždaug 20 kartų. Į nonsynonymous iki sinonimas rodiklius, MSS vėžio linkę būti didesnis nei MSI aukščio vėžio, tačiau skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas. C > T ir G > A perėjimai buvo labiausiai paplitusi mutacija (61%) į egcs, ir nebuvo reikšmingo skirtumo vieno pagrindo poros pokyčių tarp MSI didelis ir MSS vėžio (2a pav ir lentelė S4). Iš 784 genų slėpimas ne tylus mutacijas, 13 buvo mutavo į dvi ar daugiau mėginių. Apėmė genai žinomiems dalyvauja skrandžio kancerogenezėje (, TP53
) ir pranešė somatinių mutacijų katalogas vėžiu (COSMIC) turi būti mutavo į GCS ( DYRK3, MCM10, PCDH17 parsisiųsti ir UNC5C
) (3 lentelė). Iš genų atrinktų patvirtinimo PCDH17
mutacija buvo labiausiai tikėtina, nepatvirtina Sanger metodą, nes žemų dažnių mutanto alelio (lentelė S3). Įdomu tai, kad išplitęs tipo EGC su MSI aukštas, naudojant , EGFR
(c.2224G > A p.V742I). Mutacija buvo nustatyta

Palyginimas tarp EGC ir AGC

palyginti mūsų rezultatų EGC su tų AGCs, buvo naudojami du neseniai paskelbti visą exome sekos duomenys [11], [12]. Wang ir kt
. aptikta 164 ne tylus ir 48 sinonimas mutacijas vidutiniškai 22 AGC mėginių su 116 × vidutinis padengimo gylio [11]. Zang, ir kt
. aptikta vidutiniškai 50 ne tyli ir 16 sinonimais somatinių mutacijų 15 AGC pavyzdžių su 96 × vidutinis padengimo gylio [12]. Tiesiogiai lyginant tarp keturių egcs ir 37 AGCs, nebuvo didelio skirtumo tarp mutacijų rūšis (1 paveikslas) numerius. Pavieniai bazė pora pokyčiai egcs buvo panašus į ankstesnės ataskaitos Wang ir kt pervežimas. [11], rodo ryškiai didesnis skaičių C > T ir G > A perėjimai tiek MSS ir MSI aukštų navikų (2a pav ir lentelė S4). Įdomu tai, kad "C > G perėjimai buvo labiau paplitęs žarnyno tipo nei difuzinis tipo GKS visose MSS pavyzdžių, tarp kurių trys egcs ir 18 AGCs (Vilkoksono rangas suma testus, P
= 0,010) (2B pav ir lentelė S4 ").

37 AGC ir 4 EGC pavyzdžių, ne tylus mutacijos (missense, nesąmonė, svarbu sudurti svetainės ir indels) buvo aptikta 3,372 ir 784 genų, atitinkamai. Abiem egcs ir AGCs, 268 genai dažniausiai mutavo; BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI parsisiųsti ir , TP53
genai mutavo bent dviem EGC mėginių ir ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22 parsisiųsti ir TTN
genai, taip pat kiti, buvo reikšmingai susijęs su AGCs su netikru atradimas norma < 0,2 [11], [12] (3 pav.) Funkcinis anotacija analizė naudojant David (http://david.abcc.ncifcrf.gov) ištirti genų nerasta sutapimų tarp dviejų imčių rinkinių parodė, kad žymiai pagerinta terminai įtraukti aktino įrišimas, citoskeleto, ląstelių projekciją ir ląstelių ląstelių jungties (lentelė S5).

Diskusijos

Nors visa exome sekos buvo pranešta apie 37 AGC pavyzdžių [11], [12], buvo toks tyrimas siekiant įvertinti anksčiau kancerogenezės ne genetinio lygio. Ištirti visą repertuarą somatinių mutacijų egcs, mes atliekame visą exome seka keturių suporuotas EGC mėginių, ir nustatė skirtingas ir bendras genetines parašus tarp egcs ir AGCs, kad gali nustatyti genus pradžioje kancerogenezėje ir vėliau progresavimą.

epitelinių vėžio dažnai turi kintamą mutacija spektrų nukreipta į konkrečių mutageninių dirgiklius [15], [16]. Pavyzdžiui, aukšti tempai A > C ir C > T perėjimai pastebėta stemplės adenokarcinomos ir saulės veikiamos melanomos, atitinkamai, tai rodo, kad šios mutacijos yra priskirtinas gastroezofaginio refliukso ir ultravioletinių poveikio [15], [17]. Ankstesnis genomo sekos tyrimas dviem skrandžio adenokarcinomos parodė dažną C > A ir T > A pakeitimus, palyginti su įprastais genomų [18]. Čia, mes nustatėme, dažnai C > G perėjimus žarnyno tipo karcinoma, palyginti su difuzinis tipo GKS nuo atskirties MSI aukštų GCS. Mūsų unikalus stebėjimo garantuoja, ateities studijos nustatyti konkrečias etiologiją, kad potencialiai prisideda prie suvokti sudėtingas ir prastai supranta molekulinės keliai žarnyno tipo GKS.

Per lyginamosios analizės, mes nustatyti 268 persidengiančių genus su ne tylus mutacijų bendrų abiejų egcs ir AGCs (3 paveikslas). Apie trečdalis iš ne tylus mutacijų egcs dalijamasi su AGCs ir 8% ne tylus mutacijų rasti AGCs dalijamasi su egcs. Ankstesnis tyrimas su genų raiškos analizė parodė, kad pokyčių, susijusių su egcs dauguma būtų saugomi AGCs ir toliau ekspresijos pokyčiai pažymėti perėjimą nuo EGC į AGC [10]. Apskritai, šie rezultatai rodo, kad EGC atstovauja anksti molekulinė etapą AGC, o dažniausiai mutavo genai vaidina svarbų vaidmenį perėjimo iš EGC į AGC. Mes dar kartą patvirtino, kad , TP53
yra dažniausiai mutavo genas GCS, su, rasti pusėje EGC ir du trečdaliai AGC mėginių TP53
mutacijos. Tarp sutampančių genų AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A parsisiųsti ir RPL22
buvo komentuojami kaip onkogenų, o , Bankomatas, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2
ir , TP53
buvo auglys slopintuvas genų pagal į Sanger Gene surašymą (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census~~HEAD=pobj). Vėžio surašymo genų, mes pirmą kartą nustatė EGFR
mutacija (c.2224G > A p.V742I) į difuzinio tipo EGC su MSI aukštas. Neseniai tyrimą dėl 63 MSI aukštos GCS EGFR
mutacija nebuvo aptikta tiesioginio sekvenavimo kinazės domeno (egzonų 18, 19, 20 ir 21) [19]. Tas pats V742I mutacija buvo pranešė, kad pacientui, sergančiam endometriumo vėžio ir į gliomos ląstelių linijos [20], [21]. Klinikinė reikšmė šios retos mutacijos turi būti patvirtinta, kad artimiausioje ateityje.

Nors pasikartojančių mutacijų egcs paplitimas buvo gana žemas, 13 genai mutavo ne mažiau kaip du mėginius, ir turėjo labai mažai sinonimai intronic ir /ar neišverstas mutacijos. Tarp šių 13 genų DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 parsisiųsti ir UNC5C
gali būti skiriamas konkretus ankstyvoje stadijoje GC, tai rodo galimą vaidmenį anksti kancerogenezėje. Mūsų serijos PCDH17
mutacijos įvyko žarnyno tipo GKS su MSS, įskaitant vieną EBV-teigiamas mėginys. Ankstesnės pasauliniai genomikos tyrimai kolorektalinio ir kasos vėžio taip pat atskleidė missense mutacijas kai kuriose PCDH
(protocadherin) subfamilies [22] Nariai, [23]. Tačiau aptikti mūsų egcs pagal ILLUMINA sekos mutacijos nebuvo patvirtinta Sanger sekos, tikriausiai dėl to, kad mutantas alelių dažniai buvo labai mažas. UNC5C
priklauso funkcine priklausomybe receptorių šeimai, kurios nariai dalijasi gebėjimas sukelti apoptozę jų ligandų [24], [25] Nesant. Nukrypęs nuo normos, metilinimo šio geno buvo pastebėtas skrandžio kancerogenezėje žinoma, ir tai metilinimas dingo labai pažangiosios gcs [26]. Dėl likusių genų, jų funkcinė svarba GC lieka neaiškus.

praradimas funkcijos ląstelių adhezijos molekulių padidina vėžinių ląstelių sugebėjimą įsiveržti aplinkinių audinių, ir disfunkcija chromatino-remodeling kompleksas skatina chromosomų nestabilumo, kad diskai tumorigenezei [27]. Nė vienas iš mūsų EGC mėginių turėjo baltymų pakeisti mutacijos Chromatinas-remodeling genų rasti AGCs, pavyzdžiui, ARID1A, MLL3, PBRM1
ir MBD2
[11], [12], ir tai reiškia chromatino modifikacija įvyksta vėlai GC progresavimą.

Apskritai, mūsų tyrimas rodo, kad EGC ir AGC bendrų somatinės mutacijos ir AGC susijęs su papildomų kaupiamųjų genetinių pakitimų ląstelių sukibimą ir Chromatinas-remodeling genuose. Molekuliniai parašai skiriamųjų EGC iš AGC yra svarbu padėti nustatyti naujų prognostinius žymenis ir galimą terapinį tikslus. Didesnės tyrimai siekiant nustatyti biologinį reikšmingumą periodiškai mutavusių genų egcs.

Parama Informacija
S1 lentelėje.
santrauka visa exome sekos statistikos keturių porų skrandžio mėginius
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s001
(PDF)
lentelė S2.
Sąrašas visų somatinių mutacijų pradžioje skrandžio vėžio nustatytų exome sekos
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s002
(xls)
S3 lentelėje.
gruntai Sanger sekos, alelio dažnis ir patvirtinimo rezultatais
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s003
(PDF)
lentelė S4 ".
palyginimas somatinių mutacijų taškas spektrų skrandžio vėžio auglio valstybės ir histologinis tipas
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s004
(PDF)
S5 lentelėje.
DOVYDAS kelias analizė 268 sutampančių genų tarp ankstyvosios ir progresuojančios skrandžio vėžio
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s005
(xls)

• PLoS ONE: sąnaudų efektyvumo analizė vertinimas endoskopinis priežiūros skrandžio vėžio populiacijų su žemos arba vidutinės Risk
• PLoS ONE: Fizinis aktyvumas ir Sėdimas elgesį, dėl stemplės ir skrandžio vėžio NIH-AARP Cohort