PLoS ONE: Exome Sequencing Tunnistaa Varhainen mahakarsinoo- kuin alkuvaiheessa edennyt mahasyöpä

tiivistelmä

mahakarsinoo- on yksi tärkeimmistä syistä syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti. Varhainen toteaminen ja hoito johtaa erinomaisen ennusteen potilailla, joiden mahalaukun syöpä (EGC), kun taas ennustetta potilaita, joilla on edennyt mahasyöpä (AGC) on edelleen heikko. On epäselvää egcs ja AGC ovat erillisiä yksiköitä vai egcs ovat alkuvaiheissa AGC. Suoritimme koko exome sekvensointi neljä näytettä potilailta, joilla EGC ja vertasivat tuloksia tarkoin AGC. Sekä egcs ja AGC, yhteensä 268 geenejä yleisesti mutatoitunut ja riippumatonta mutaatiota lisäksi löydettiin egcs (516 geenit) ja AGC (3104 geenejä). Korkeampi taajuus C > G siirtymät havaittiin suoliston-tyypin verrattuna hajanainen-tyypin karsinoomien ( P
= 0.010). DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
ja UNC5C
geenit toistuvasti mutatoituneet egcs ja voi olla mukana varhaisessa karsinogeneesissä.

Citation: Kang G Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY, Lee J, et al. (2013) Exome Sekvensointi tunnistaman varhaisessa mahakarsinoo- kuin alkuvaiheessa edennyt mahasyöpä. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10,1371 /journal.pone.0082770

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 27 lokakuu 2013; Julkaistu: 23 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Kang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Research Foundation of Korea (2012-P4KR 003) ja Samsung Biomedical Research Institute avustus (# SBRI-SP1B20111). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: KW työskentelee Pfizer Inc kuitenkaan tämä ei muuta tekijän sitoutuminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mikään muu kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

mahakarsinoo- (GC) on heterogeeninen sairaus, jossa on useita ympäristön etiologies, vaihtoehtoisia väyliä syövän ja ei ole tunnettuja korkean taajuuden onkogeenistä perturbation [1], [2], [3]. Lauren luokitus on osoittautunut hyödylliseksi arvioitaessa luonnon historiasta GC, etenkin esiintyvyys trendejä, ennusteeseen viittaavia korrelaatiot ja etiologic esiasteiden [4]. Lauren luokitellaan mahalaukun adenokarsinooman osaksi suoliston ja levittää mukainen morfologisia ominaisuuksia kasvaimen [4], [5], [6]. Suoliston-tyyppinen karsinoomien uskotaan syntyvän pitkään jatkuneesta atrofinen gastriitti liittyy H. pylori
ja suoliston metaplasiaa [7]. Diffuusi-tyypin GC eivät liity suoliston metaplasia ja saattavat johtua yksisoluiset mutaatioita normaalin maharauhanen [4], [8], [9].

GC on yksi tärkeimmistä syistä syöpää liittyvä kuolleisuus kaikkialla maailmassa. Varhainen toteaminen ja hoito johtaa erinomainen ennuste potilaille varhainen mahalaukun syöpä (EGC), kun taas ennustetta potilaita, joilla on edennyt mahasyöpä (AGC) on edelleen heikko. On kuitenkin epäselvää egcs ja AGC ovat erillisiä yksiköitä tai ovat samat kasvain etenevien aikaista vaiheissa [10]. Molekyyli allekirjoitukset erottaa EGC välillä AGC ovat tärkeitä auttaa huomaamaan uusien ennustetekijöitä merkkejä ja mahdollisia terapeuttisia kohteita.

Äskettäin exome sekvensointi 22 [11] ja 15 [12] AGC näytteet osoittivat usein inaktivoivat mutaatiot soluadheesion ja chromatin-remontin geenejä, ja geneettiset muutokset erosivat keskuudessa alaryhmien ositettu Epstein-Barrin virus (EBV) tai H. pylori
infektio ja mikrosatelliittien epävakaus (MSI) tila. Tutkimaan edelleen geneettisten muutosten taustalla GC, suoritimme koko exome sekvensointi neljässä Hyväksytty paria EGC ja normaalia kudosta, ja vertasimme tuloksia niillä, AGC.

Materiaalit ja menetelmät

näytteen valmistus

Tumor ja ei-neoplastisia mahalaukun kudokset kerättiin gastrectomy yksilöitä. Tämä tutkimus tehtiin sen jälkeen, kun hyväksynnän Institutional Review Board of Samsung Medical Center, ja kaikki potilaat antoivat tietoon suostumus ennen leikkausta. Kasvaimen näytteiden massat olivat > 4 cm brutto tarkastus, ja pinnan limakalvon kustakin kasvain hankittiin. Sen jälkeen upottamisen OCT media, kudos leikattiin ja H &E värjättyä. Näytteitä > 90% kasvain pitoisuus valittiin DNA on uutettu Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) ja käsiteltiin RNaasi A: poistamaan jäljellä RNA. DNA myös uutettu pariksi vaikuta mahalaukun kudoksesta, joka saatiin etäällä kasvaimen päällä ja vahvistettu olevan kasvaimettomina. MSI analysoitiin viisi NCI markkereita, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Läsnäolo EBV havaittiin EBV-koodattu RNA in situ
hybridisaation kuten edellä on kuvattu, ja ainoastaan ​​tapauksissa vahvan signaalin sisällä lähes kaikki kasvaimen solutumien pidettiin positiivisina [14]. Muita yksityiskohtia varten EGC näytteet annetaan taulukossa 1.

Exome rikastamiseen ja sekvensointi

Exome rikastus (SureSelect Human Kaikki eksoni Kit, Agilent Technologies) ja Illumina sekvensointi kirjastot valmistettiin valmistajan ohjeet. Lyhyesti, 3 ug genomista DNA: ta leikattiin kanssa Covaris S2 järjestelmään; DNA-fragmentit lopussa korjattu, pidentää A- perusta 3', liitettiin pariksi-end adapterit ja monistetaan (neljä sykliä). Exome sisältävä sovitin-liitettiin kirjastojen hybridisoitiin 24 tuntia biotinyloidun oligo-RNA syötit ja rikastettu streptavidiini-konjugoitua magneettisia helmiä. Lopulliset kirjastot olivat edelleen monistettiin 11 PCR syklit ja alistettiin Illumina sekvensointi yhdelle kaistalle HiSeq 2000 sekvensserin kanssa kohdennetun insertin koko ~180 bp. Kaikki sekvensointi ajettiin pariksi-end 65-emäsparin lukee ja suoritettiin Ilumina n vakioyhteyskäytäntöä. Keskimäärin ~136.3 miljoonaa puhtaus suodattamatonta lukee tuotettiin kullekin näytteelle. Keskimääräinen prosenttiosuus kahtena lukee johtuen PCR ja optisia esineitä on 0% meidän tietokokonaisuus, ja ~123.7 miljoonaa ainutlaatuisesti kartoitettu lukee saatiin jokaisesta näytteestä. Keskimäärin 69,1% ja lukee kunkin näytteen oli vähintään 50% limityksellä minkään kohdealueella ± 100 bp SureSelect koko exome syötti kirjasto. Kohdealueilla Kunkin näytteen sekvensoitiin keskisyvyys on 113,7 ×, jossa ~98.8%: n kohdealueilla katettu ≥1 ×, ~94.3% ≥10 x, ~82.4% ≥30 x, ~70.8% ≥50 x, ~66.4% ≥60 x, ~62.2% ≥70 x, ~58.2% ≥80 x, ~54.4% ≥90 x ja ~50.8% ≥100 x. Yksityiskohtaiset yhteenvedot raakadatan laatu on kuvattu taulukossa S1. Vertailun vuoksi samaa algoritmia (SMART), käytetään edellisen aineisto AGC näytteiden [11], levitettiin näiden tietojen tunnistamiseksi somaattisten yhden nukleotidin muunnelmia ja insertioita /deleetioita (indeleitä) muutokset lyhyestä lukea sekvenointitulosten. Tietojoukko on talletettu Euroopan nukleotidi- Archive ja voi tutustua osoitteessa http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.

Mutaatiot havaita exome sekvensointi edelleen validoitu PCR ja Sangerin sekvensoinnilla. Lyhyesti, alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer3-ohjelmisto (http://frodo.wi.mit.edu) ja sekvenssit on lueteltu taulukossa S3. PCR-monistetut tuotteet sekvensoitiin sitten käyttämällä BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, ja ABI 3700 automaattisen sekvensserin (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Tulokset

somaattinen muutokset egcs

yhteensä 2389 somaattiset mutaatiot tunnistettiin neljän EGC näytettä, joista 1117 tapahtunut koodaavat alueet tai olennaisen silmukointikohdista (627 missensemutaatio, 32 hölynpölyä, 10 olennaista silmukointikohtaemäsasemasta, 169 indeleitä ja 279 synonyymi) (kuvio 1, ja taulukoissa 2 ja S2). Yksi GC MSI-korkea oli 727 ei-hiljaisia ​​mutaatioita lukien mismatch korjaus geenit ( MSH6
ja MSH3
), kun taas kolme mikrosatelliitti vakaa (MSS) näytteet oli keskimäärin 37, joka on ero oli noin 20-kertainen. Nonsynonymous-to-synonyymi suhdeluvut MSS syövät olivat korkeampia kuin MSI korkea syöpä, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. C > T ja G >: A siirtymät olivat yleisimpiä mutaatio (61%) vuonna egcs, ja ei ollut merkitsevää eroa yhden emäsparin muutokset välillä MSI-korkea ja MSS syöpiä (kuvio 2A ja taulukossa S4). 784 geenejä, joissa on ei-hiljaisia ​​mutaatiota, 13 mutatoitiin kaksi tai useampia näytteitä. Näihin sisältyvät geenit, joiden tiedetään olevan mukana mahasyövän ( TP53
) ja raportoitu Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer (COSMIC) olisi mutatoitunut GC ( DYRK3, MCM10, PCDH17
ja UNC5C
) (taulukko 3). Geeneistä valittu validointi, PCDH17
mutaatio todennäköisesti ole vahvistanut Sangerin menetelmällä, koska matalien taajuuksien mutantti alleeli (taulukko S3). Mielenkiintoista on, diffuusi-tyyppinen EGC MSI-korkea, joka on EGFR
(c.2224G > A, p.V742I) mutaatio tunnistettiin.

Vertailu EGC ja AGC

vertailua meidän tuloksia EGC niiden kanssa AGC kahdessa äskettäin julkaistussa koko exome sekvensointi tietoja käytettiin [11], [12]. Wang et al
. havaittu 164 ei-hiljainen ja 48 synonyymi mutaatiot keskimäärin 22 AGC näytteitä 116 × keskimääräinen kattavuus syvyys [11]. Zang et al
. havaittu keskimäärin 50 ei-äänetön ja 16 synonyymejä somaattiset mutaatiot 15 AGC näytteitä 96 × keskimääräinen kattavuus syvyys [12]. Verrataan suoraan näiden neljän egcs ja 37 AGC, ei ollut merkittävää eroa määrä mutaation tyyppi (kuvio 1). Yksittäinen emäsparin muutokset egcs olivat samanlaisia ​​aiemman raportin Wang et al
. [11], osoittaa selvästi suurempi määrä C > T ja G >: A siirtymät sekä MSS ja MSI-korkea kasvaimet (kuvio 2A ja taulukossa S4). Mielenkiintoista, C > G siirtymät olivat yleisempiä suoliston-tyyppinen kuin diffuusi-tyyppinen GC kaikissa MSS näytteet, johon kuului kolme egcs ja 18 AGC (Wilcoxonin summa testi, P
= 0,010) (kuvio 2B ja Taulukko S4).

37 AGC ja 4 EGC näytteitä, ei-hiljaisia ​​mutaatioita (missensemutaatio, nonsense, olennaista silmukoitumiskohta ja indeleitä) havaittiin 3372 ja 784 geenejä, tässä järjestyksessä. Sekä egcs ja AGC, 268 geenit olivat yleisesti mutatoitunut; BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI
ja TP53
geenit mutatoitiin vähintään kaksi EGC näytettä, ja ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22
ja TTN
geenejä, samoin kuin muut, liittyivät merkittävästi AGC on väärä löytö määrä < 0,2 [11], [12] (kuva 3). Toiminnalliset merkintä analyysin avulla DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) tutkia geenien löytyi päällekkäisiä näytteen sarjaa paljasti, että merkittävästi rikastettu ehdot sisältyvät aktiini sitova, tukirankansa, solu projektio ja solu-solu risteykseen (taulukko S5).

keskustelu

Vaikka koko exome sekvensointi on raportoitu 37 AGC näytteitä [11], [12], ei ole tällaista tutkimusta arvioida varhain karsinogeneesiin geneettisellä tasolla. Tutkia täydellinen ohjelmistoon somaattisten mutaatioiden egcs teimme koko exome sekvensointi neljästä pariksi EGC näytettä, ja löysi erillisiä ja yhteisiä geneettisiä allekirjoituksia egcs ja AGC, jotka voivat tunnistaa geenien alussa syövän synnyn ja myöhempi edistyminen.

epiteelisyövissä usein muuttuva mutaatio spektri osoittaa erityisille mutageeninen ärsykkeille [15], [16]. Esimerkiksi korkeat A > C ja C > T siirtymät havaittiin ruokatorven adenokarsinooman ja auringonoton ihosyövän, vastaavasti, mikä viittaa siihen, että nämä mutaatiot johtuvat refluksitaudin ja ultravioletti altistumisen [15], [17]. Aiempi genominlaajuisten sekvensointi tutkimuksessa kaksi mahalaukun adenokarsinooman osoitti usein C > A ja T > muutoksia verrattuna normaaliin genomien [18]. Täällä, löysimme usein C > G siirtymien suoliston-tyypin karsinoomien verrattuna hajanainen-tyypin GC, jolle ei MSI-korkea GC. Ainutlaatuinen havainto optio tulevissa tutkimuksissa määritellä erityisiä etiologia joka mahdollisesti edistää ymmärrystä monimutkaisia ​​ja huonosti molekyylitason reitit suoliston-tyyppinen GC.

kautta vertaileva analyysi, tunnistimme 268 päällekkäisiä geenejä ei-hiljaisia ​​mutaatioita jaettua sekä egcs ja AGC (kuva 3). Noin kolmasosa ei-hiljainen mutaatiot egcs jaetaan AGC ja 8% ei-hiljaisia ​​mutaatioita löytyy AGC jaetaan egcs. Aiemmassa tutkimuksessa geenien ilmentymisen analyysi osoitti, että suurin osa muutoksista liittyy egcs säilytetään AGC ja edelleen ilmentyminen muuttuu kuluneeksi siirtyminen EGC AGC [10]. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että EGC edustaa varhaisessa molekyyli- vaiheessa AGC, ja yleisesti mutatoitunut geenien tärkeä rooli etenemistä EGC AGC. Me vahvisti, että TP53
on useimmin mutatoitunut geeni GC, jossa TP53
mutaatioita löydettiin puolessa EGC ja kaksi kolmasosaa AGC näytteitä. Niistä päällekkäisiä geenit, AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A
ja RPL22
olivat selityksin kuten onkogeenien, kun taas ATM, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2
ja TP53
olivat tuumorisuppressorigeeneille Sangerin Gene Census (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census). Niistä Cancer Census geenit, ensin tunnistaneet EGFR
mutaatio (c.2224G > A, p.V742I) on diffuusi-tyyppinen EGC MSI-korkea. Tuoreessa tutkimuksessa 63 MSI-korkea GC, EGFR
mutaatio ei havaittu suoralla sekvensoinnilla kinaasidomee- (eksonit 18, 19, 20 ja 21) [19]. Sama V742I mutaatio on raportoitu potilaalla, jolla kohdun limakalvon syöpä ja joka glioomasolulinjaa [20], [21]. Kliinistä merkitystä tämän harvinaisen mutaation on validoitu lähitulevaisuudessa.

Vaikka esiintyvyys toistuvien mutaatioiden egcs oli suhteellisen alhainen, 13 geenit mutatoitiin vähintään kaksi näytettä, ja oli hyvin vähän synonyymejä, introni- ja /tai transloitumatonta mutaatioita. Näistä 13 geenit, DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
ja UNC5C
voi olla spesifinen alkuvaiheessa GC, mikä viittaa mahdolliseen rooliin varhaisessa karsinogeneesissä. Meidän sarja, PCDH17
esiintyy mutaatioita suoliston-tyyppinen GC kanssa MSS, joista yksi EBV-positiivinen näyte. Edellinen maailmanlaajuinen genomista analyysejä peräsuolen ja haiman syöpää paljasti myös missensemutaatioita joissakin jäsenet PCDH
(protocadherin) subfamilies [22], [23]. Kuitenkin mutaatiot havaittu omassa egcs by Illumina sekvensointi ei vahvistanut Sangerin sekvensoinnilla, luultavasti siksi, että mutantti alleeli taajuudet olivat hyvin alhaiset. UNC5C
kuuluu toiminnallinen riippuvuus reseptorin perhe, jonka jäsenet jakavat kyky indusoida apoptoosia ilman niiden ligandit [24], [25]. Poikkeava metylaatio tämä geeni on raportoitu aikana mahasyövän, ja tämä metylointi katosi kehittyneimmissä GC [26]. Jäljellä geenit, niiden toiminnallinen merkitystä GC jää epäselväksi.

Menetys funktion Soluadheesiomolekyylien lisää kykyä syöpäsolujen hyökätä ympäröivään kudokseen, ja toimintahäiriö chromatin-remontin kompleksi edistää kromosomi epävakautta, joka ajaa tuumorigeneesiä [27]. Yksikään EGC näytteissä proteiini-muuttamatta mutaatioita kromatiinin-remodeling geenejä löytyy AGC, kuten ARID1A, MLL3, PBRM1
ja MBD2
[11], [12], mikä viittaa chromatin muutos tapahtuu myöhään etenemistä GC.

Kaiken Tutkimuksemme osoittaa, että EGC ja AGC yhteisiä somaattisista mutaatioista, ja AGC liittyy ylimääräisiä kumulatiivinen geneettisiin muutoksiin solun tarttumiseen ja chromatin-remodeling geenejä. Molekyyli allekirjoitukset erottaa EGC välillä AGC ovat tärkeää auttaa tunnistamaan uusia ennustetekijöitä markkereita ja potentiaalisia terapeuttisten kohteiden. Suuremmat tutkimuksia tarvitaan määrittämään biologinen merkitys toistuvasti mutatoitujen geenien egcs.

tukeminen Information
Taulukko S1.
Yhteenveto koko exome sekvensointi tilastot neljä paria mahalaukun näytteistä.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s001
(PDF) B Taulukko S2.
Luettelo kaikista somaattisten mutaatioiden alussa mahasyövistä tunnistaa exome sekvensoinnilla.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s002
(XLS) B Taulukko S3.
Alukkeet Sangerin sekvensointia, alleelin taajuus ja vahvistustulokset.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s003
(PDF) B Taulukko S4.
vertailu somaattisen pistemutaatio spektrin mahasyövistä kasvaimen valtion ja histologinen tyyppi.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s004
(PDF) B Taulukko S5.
DAVID polku analyysi 268 päällekkäisten geenien välillä aikaisin ja kehittyneet mahasyövistä.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s005
(XLS) B

• PLoS ONE: kustannustehokkuuden analyysi arviointi Endoskooppisen Surveillance mahasyövän varten populaatiot Low Intermediate Risk
• PLoS ONE: liikuntaa ja Sedentaarisia käyttäytymistä suhteessa Ruokatorven ja mahalaukun syövistä NIH-AARP kohortti