PLoS One: Exome szekvenálása azonosítja Korai gyomorrák korai stádium előrehaladott gyomorrákban

absztrakt katalógusa

gyomorrák egyik fő oka a rákkal kapcsolatos halálozás világszerte. A korai felismerés és kezelés következtében kiváló kórjóslatát korai gyomorrák (EGC), míg a betegek prognózisát előrehaladott gyomorrák (AGC) továbbra is alacsony. Nem világos, hogy EGCs és AGCS különálló egységek, vagy EGCs az elején szakaszában AGCS. Végeztünk egész exome szekvenálása négy mintát betegek EGC és az eredményeket összehasonlítottuk azokkal származó AGCS. Mindkét EGCs és AGCS, összesen 268 gént általában mutálódott, és független mutációkat Továbbá találtunk EGCs (516 gének) és AGCS (3104 gének). A nagyobb gyakorisággal C > G átmenetek figyeltek bél típusú, mint a diffúz típusú carcinoma ( P katalógusa = 0,010). A DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 katalógusa és UNC5C katalógusa gének visszatérően mutált EGCs és szerepe lehet a korai kialakulásában. Katalógusa

Citation: Kang G Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY, Lee J., et al. (2013) Exome szekvenálása azonosítja Korai gyomorrák korai stádium előrehaladott gyomorrákban. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10,1371 /journal.pone.0082770 katalógusa

Szerkesztő: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore katalógusa

Beérkezett: július 17, 2013; Elfogadva: október 27, 2013; Megjelent: december 23, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Kang és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány támogatott a támogatást a Nemzeti Kutatási Alapítvány Korea (2012-P4KR 003) és a Samsung Biomedical Research Institute támogatás (# SBRI-SP1B20111). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: KW alkalmazottja Pfizer Inc. Ez azonban nem változtat azon a szerző betartása minden PLoS One politikák adatok megosztása és anyagok. A szerzők kijelentették, hogy nincs más versengő érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető katalógusa

A gyomor carcinoma (GC) egy heterogén betegség, több környezeti eredetűek, alternatív utak carcinogenezis és nincs ismert nagyfrekvenciás onkogén perturbáció [1], [2], [3]. A Lauren osztályozás hasznosnak bizonyult értékelésében természetrajza GC, különös tekintettel a előfordulási trendek, a klinikopatológiai összefüggések és etiológiai prekurzorok [4]. Lauren sorolt ​​gyomor adenokarcinóma be intesztinális és diffúz szerint morfológiai jellemzői a tumor [4], [5], [6]. Bél típusú carcinoma úgy véljük, hogy a másodlagos a krónikus sorvadásos gyomorhurut kapcsolódó H. pylori katalógusa és intestinalis metaplasia [7]. Diffúz típusú GC nem jár az intestinalis metaplasia és eredhet egysejtű mutációk normális gyomormirigyben [4], [8], [9]. Katalógusa

GC egyik fő oka a rákkal összefüggő halálozás világszerte. A korai felismerés és kezelés eredményeként a kiváló betegek prognózisa a korai gyomorrák (EGC), míg a betegek prognózisát előrehaladott gyomorrák (AGC) továbbra is alacsony. Azonban nem világos, hogy EGCs és AGCS különálló egységek, vagy azonos tumor halad a korai előrehaladott stádiumaiban [10]. A molekuláris aláírások megkülönböztető EGC származó AGC fontos, hogy segítse azonosítása újabb prognosztikai markerek és potenciális terápiás célpontokat.

Nemrégiben exome szekvenálás 22 [11] és 15 [12] AGC minták azt mutatták, gyakori inaktiváló mutációt sejtadhéziós és a kromatin-remodelling gének és a genetikai eltérések különbözött között alcsoportok rétegezni Epstein-Barr vírus (EBV) vagy H. pylori fertőzés és
mikroszatellit-instabilitás (MSI) állapotát. Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a genetikai elváltozások hátterében GC végeztünk teljes exome szekvenálás négy egyező pár EGC és normális szövet, és összehasonlították az eredményeket származók AGCS. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

A minta előkészítése

tumoros és nem neoplasztikus gyomor szöveteket gyűjtöttünk gastrectomia példányok. Jelen vizsgálat során a jóváhagyás után az intézményi Review Board Samsung Medical Center, és minden beteg írásban beleegyezését a műtét előtt. A tumorminták tömegek voltak kitermeléssel 4 cm bruttó ellenőrzés, és a felületi nyálkahártya egyes tumor került beszerzésre. Miután beágyazás OCT média, a szövetet felvágjuk és H &E festett. A mintákat a > 90% tumor-tartalmat kiválasztott DNS extrahálására egy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), és kezeltük RNáz A távolítottuk el a maradék RNS-t. DNS-t is kivont párosított érintetlenül gyomor szövet, amelyet kapunk távol a tumor helyén, és megerősítették, hogy a tumor-mentes. MSI elemeztük öt NCI markerek a korábban leírt [13]. A jelenléte EBV detektáltuk EBV-kódolt RNS in situ
hibridizáció a korábban megadott, és csak Amennyiben erős jel belül szinte az összes tumor sejtmagok pozitívnak tekintettük [14]. Kiegészítő adatai EGC mintákat az 1. táblázat tartalmazza

Exome dúsítás és szekvenálása

Exome feldúsulása (SureSelect Human Minden Exon Kit, Agilent Technologies), és Illumina szekvenálás könyvtárak szerint állítottunk elő, a gyártó utasítás. Röviden, 3 ng genomiális DNS-t elnyírt a Covaris S2 rendszer; A DNS-fragmentumokat végi javított, bővített egy "A" bázis a 3 'végén, ligáltuk páros végű adapterek és erősített (négy ciklus). Exome tartalmazó adapterrel ligált könyvtárak hibridizáljuk 24 órán biotinilezett oligo-RNS-csalik és dúsított sztreptavidinnel konjugált mágneses gyöngyök. A végső könyvtárak tovább erősödnek a 11 PCR ciklus, és alávetni Illumina szekvenálás az egyik sávban a HiSeq 2000 szekvenszer célzott betét mérete ~180 bp. Minden szekvenálást fut párosított-end 65-BP olvas és szerint végeztük Ilumina standard protokoll. Átlagosan ~136.3 millió tisztaság-szűrt leolvassa generáltunk minden egyes minta. Az átlagos százalékos kettős olvasás miatt PCR és optikai leletek 0% volt a mi adathalmaz és ~123.7 millió egyedi csatlakoztatott leolvasni kaptuk az egyes mintáknál. Átlagosan 69,1% -a beolvassa az egyes mintákban volt legalább 50% -os átfedésben a megcélzott régió ± 100 BP a SureSelect egész exome csali könyvtárban. A megcélzott régiók az egyes mintákban szekvenciáját, hogy egy átlagos mélysége 113,7 ×, a ~98.8% a megcélzott régiók fedett ≥1 ×, ~94.3% ≥10 ×, ~82.4% ≥30 ×, ~70.8% ≥50 ×, ~66.4% ≥60 ×, ~62.2% ≥70 ×, ~58.2% ≥80 ×, ~54.4% ≥90 × és ~50.8% ≥100 ×. Részletes összefoglalót a nyers adatok minőségének táblázat mutatja S1. Összehasonlításképpen, az ugyanazt az algoritmust (SMART), használták az előző adatbázisba AGC minták [11], alkalmazták ezeket az adatokat azonosítani szomatikus egyetlen nukleotid variációk és inszerciók /deléciók (indels) eltérések és a rövid olvasási szekvenálási adatok. Az adathalmaz már letétbe az Európai nukleotid Archive és érhető el http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850. katalógusa

A mutáció kimutatható exome szekvenálás voltak tovább validált PCR és szekvenálás Sanger. Röviden, primereket úgy vannak kialakítva, Primer3 szoftver segítségével (http://frodo.wi.mit.edu), és a szekvenciákat táblázatban felsorolt ​​S3. A PCR-amplifikált termékeket ezután szekvenáltuk alkalmazásával BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit és egy ABI 3700 automata szekvenátorral (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Eredmények

Szomatikus elváltozások EGCs katalógusa

a teljes, 2389 szomatikus mutációt azonosítottak a négy EGC mintákat, amelyek 1117 bekövetkezett kódoló régiók vagy alapvető illesztési helyek (627 missense, 32 nonszensz, 10 alapvető illesztési hely, 169 indels és 279 szinonim) (1. ábra és a 2. táblázatban és S2). Egy GC MSI magas volt 727, nem csendes mutációk beleértve mismatch repair gének ( MSH6 katalógusa és MSH3 katalógusa), mivel a három mikroszatellit stabil (MSS) minta volt átlagosan 37, a különbség körülbelül 20-szeres. A nonsynonymous-To-szinonim arányok az MSS rákok tendenciózusan magasabb, mint az MSI-magas a rák, de a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns. C > T és G > A átmenetek volt a leggyakoribb mutáció (61%), a EGCs, és nem volt szignifikáns különbség a egyetlen bázispár között változik MSI-magas és MSS rákok (2A ábra és táblázat S4). 784 gének hordozó nem-csendes mutációk, 13-at mutált két vagy több minta. Ezek közé tartozott a gének ismert, hogy részt vesz a gyomor karcinogenezis ( TP53 katalógusa), és leírták a katalógus szomatikus mutációk jelentősége a rákban (KOZMIKUS) a mutációval GC ( DYRK3, MCM10, PCDH17 katalógusa és UNC5C katalógusa) (3. táblázat). A gének kiválasztott érvényesítésre, PCDH17 katalógusa mutáció valószínűleg nem hitelesítette Sanger módszer, mert az alacsony frekvenciájú mutáns allél (táblázat S3). Érdekes, hogy a diffúz típusú EGC az MSI-magas, egy EGFR katalógusa (c.2224G > A, p.V742I) mutációt azonosítottak. Katalógusa

összehasonlítása EGC és az AGC katalógusa

az összehasonlítás az eredményeinket EGC azokkal AGCS, két nemrégiben megjelent egész exome szekvenálás adatokat használták [11], [12]. Wang és munkatársai katalógusa. észlelt 164 nem néma és 48 szinonim mutációk átlagosan 22 AGC minták 116 × átlagos lefedettség mélység [11]. Zang és munkatársai katalógusa. észlelt átlagosan 50 nem néma és 16 szinonim szomatikus mutációkat 15 AGC minták 96 × átlagos lefedettség mélység [12]. A közvetlenül összehasonlítani a négy EGCs és 37 AGCS, nem volt szignifikáns különbség a számát mutáció típusa (1. ábra). Az egyetlen bázispár változások EGCs hasonló volt a korábbi jelentés szerint Wang és munkatársai katalógusa. [11], ami így lényegesen magasabb számú C > T és G > A átmenetek mindkét MSS és az MSI-high daganatok (2A ábra és táblázat S4). Érdekes, hogy a C > G átmenetek gyakoribbak voltak bél típusú, mint a diffúz típusú GC minden MSS mintát, amely tartalmazza a három EGCs és 18 AGCS (Wilcoxon rank sum tesztet, P katalógusa = 0,010) (2B és táblázat S4).

37 AGC és 4 EGC mintákat, a nem csendes mutációk (missense, nonsense, esszenciális illesztési hely és indels) detektáltunk 3,372 és 784 gének esetében. Mindkét EGCs és AGCS, 268 gén mutált általánosan; A BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI katalógusa és TP53 katalógusa géneket mutáns legalább két EGC mintát, és a ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22
és TTN katalógusa gének, valamint más, szignifikáns összefüggést mutattak a AGCS egy téves elfogadási arány a < 0,2 [11], [12] (3. ábra). Funkcionális annotáció analízis DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) megvizsgálni a gének találtak átfedés a két minta készletek kiderült, hogy a jelentősen gazdagította kifejezések szerepelnek aktin-kötő, citoszkeleton, sejt vetítés és a sejt-sejt csomópont (táblázat S5). katalógusa

Vita katalógusa

Bár egész exome szekvenálás leírták 37 AGC minták [11], [12], nem volt ilyen vizsgálatban, korai karcinogenezissel genetikai szinten. Hogy vizsgálja meg a teljes repertoárját szomatikus mutációk EGCs végeztünk egész exome szekvenálása négy páros EGC mintát, és megállapította, különálló és közös genetikai aláírások között EGCs és AGCS amely gének azonosítása vonni a korai és a későbbi karcinogenezissel progresszióját. Katalógusa

epiteliális rákok gyakran változó mutáció spektrumokat mutat különösen mutagén ingerekre [15], [16]. Például a magas aránya a > a C és C > T átmenetek észleltek nyelőcső adenocarcinoma és napnak kitett melanomák, illetve arra utal, hogy ezek a mutációk tulajdoníthatók gastrooesophagealis reflux és ultraibolya expozíció [15], [17]. Egy korábbi genom szekvenálása vizsgálatban két gyomor adenocarcinoma kimutatta gyakori C > A és T > A változtatások, összehasonlítva a normál genomok [18]. Itt találtuk a gyakori C > G átmenetek bél típusú carcinoma képest diffúz típusú GC kizárása után az MSI-magas GC. Egyedülálló megfigyelés garantálja jövőkutatás hogy jellemző etiológia, hogy a potenciálisan hozzájárul megértése a bonyolult és nehezen érthető molekuláris útvonalakat intesztinális típusú GC. Katalógusa

Keresztül összehasonlító elemzés során azonosított 268 átfedő gének nem csendes mutációk osztott mindkét EGCs és AGCS (3. ábra). Körülbelül egyharmada a nem csendes mutációk EGCs vannak megosztva AGCS és 8% a nem csendes mutációk megtalálhatók AGCS vannak megosztva EGCs. Egy korábbi tanulmány génexpressziós analízis azt mutatta, hogy a legtöbb elváltozások társított EGCs megmaradnak AGCS és további expressziós változások jelöljük az átmenetet a EGC AGC [10]. Összességében ezek az eredmények azt jelzik, hogy EGC jelentése korai molekuláris szakaszában AGC, és a közösen mutáns gének fontos szerepet játszanak a progresszió EGC az AGC. Azt megerősítette, hogy TP53 katalógusa a leggyakrabban mutált gén GC, a TP53 katalógusa mutációt találtak felében EGC és kétharmada AGC minták. Között átfedő gének, AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A katalógusa és RPL22 katalógusa arra kiegészítések értelmében onkogének, míg ATM, FBXW7, MSH6 NF1, PTEN, SETD2
és TP53 katalógusa voltak tumor szupresszor gének a Sanger Gene népszámlálás (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census). A Rák Népszámlálási gének, először azonosították egy EGFR mutáció katalógusa (c.2224G > A, p.V742I) egy diffúz típusú EGC az MSI-magas. Egy nemrégiben készült tanulmány 63 MSI-magas GC, Az EGFR mutáció katalógusa által nem észlelt közvetlen szekvenálása a kináz domén (exon 18, 19, 20 és 21). [19] Ugyanez a V742I mutáció számoltak be egy beteg endometriális rák és egy glióma sejtvonalban [20], [21]. A klinikai jelentősége ritka mutáció kell érvényesíteni a közeljövőben. Katalógusa

Bár a prevalenciája visszatérő mutációk EGCs viszonylag alacsony volt, 13 gén mutációja legalább két minta, és nagyon kevés szinonimája, intronic és /vagy le nem fordított mutációk. Ezek közül 13 gén, DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5 katalógusa és UNC5C katalógusa lehet specifikus korai szakaszában GC, ami arra utal, szerepe a korai kialakulásában. Sorozatunkban, PCDH17 katalógusa mutáció bél típusú GC MSS, köztük egy EBV-pozitív mintát. Korábbi globális genom elemzése a colorectalis rák és a hasnyálmirigy is kiderült missense mutációt néhány tagja PCDH katalógusa (protokadherin) alcsalád [22], [23]. Azonban a mutációk kimutatható a EGCs által Illumina szekvenálás nem erősítette meg Sanger szekvenálás, valószínűleg azért, mert a mutáns allél frekvenciája nagyon alacsony. UNC5C
tartozik a funkcionális függőség receptor család tagjai, amelyek osztoznak a képesség, hogy apoptózist indukálnak hiányában azok ligandumok [24], [25]. Aberráns metilezése ez a gén számoltak során gyomor karcinogenezis, és ez a metiláció eltűnt igen fejlett GC [26]. A fennmaradó gének, ezek funkcionális jelentősége GC tisztázatlan marad.

funkciójának elvesztését sejtadhéziós molekulák növeli a képességét, tumoros sejtek megtámadják a környező szövetekbe, és diszfunkció kromatin-átalakítás komplex elősegíti kromoszomális instabilitás, hogy a meghajtók tumorigenezis [27]. Nem a mi EGC mintában volt fehérje-módosító mutációk kromatin-átalakítás gének találhatók AGCS, mint a ARID1A, MLL3, PBRM1 katalógusa és MBD2 katalógusa [11], [12], ami arra utal, kromatin módosítás későn fordul elő a progresszió GC.

Összességében a tanulmány arra utal, hogy EGC és az AGC közösek szomatikus mutációk és AGC társított további kumulatív genetikai elváltozások sejtadhézió és a kromatin-átalakítás géneket. A molekuláris aláírások megkülönböztetése EGC honnan AGC fontos, hogy segítsen azonosítani újabb prognosztikai markerek és potenciális terápiás célpontokat. Nagyobb vizsgálatok szükségesek annak meghatározására biológiai jelentősége a visszatérően mutált gének EGCs. Katalógusa

alátámasztó információk katalógusa táblázat S1.
összefoglalása egész exome szekvenálás statisztikák négy pár gyomor minták. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s001 katalógusa (PDF) hotelben táblázat S2.
listája minden szomatikus mutációk a korai gyomorrák azonosított exome szekvenálás. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s002 katalógusa (XLS) hotelben táblázat S3.
alapozók Sanger szekvenálás, allél gyakorisága és érvényesítés eredmények. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s003 katalógusa (PDF) hotelben táblázat S4.
összehasonlítása szomatikus pontmutáció spektrumok gyomorrák a tumor állam és a szövettani típus. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s004 katalógusa (PDF) hotelben táblázat S5.
DAVID útvonal elemzés a 268 átfedő gének közötti korai és az előrehaladott gyomorrák. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0082770.s005 katalógusa (XLS) hotelben

• PLoS One: A költség-hatékonyság elemzés értékelése endoszkópos Felügyeleti gyomorrák a populációk alacsony és közepes Risk
• PLoS One: testmozgással és Ülő viselkedésmódok nyelőcső és a gyomor daganatok a NIH-AARP Cohort