PLoS ONE: Потеря экспрессии Reprimo, р53-индуцированного клеточного цикла гена, коррелируется с инвазионной стадии опухолевого прогрессирования заболевания и р73 в Expression рака желудка

Абстрактный
<р> Reprimo (RPRM), вниз по течению эффектор остановки клеточного цикла р53-индуцированный в G2 /M, было предложено в качестве гена супрессора опухоли (мнимый TSG) и в качестве потенциального биомаркера для не- инвазивная обнаружение рака желудка (GC). Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить эпигенетическую глушителей гена RPRM путем метилирования промотора и его опухолевого супрессора функции в клеточных линиях GC. Кроме того, была изучена клиническая значимость RPRM белкового продукта и его ассоциации с р53 /р73 супрессоров опухолей семейства белков. Эпигенетическое глушение гена RPRM путем метилирования промотора оценивали в четырех GC клеточных линиях. Белок выражение RPRM оценивали в 20 опухоли и неопухолевой соответствуют случаи. Клиническая значимость RPRM ассоциации с р53 /р73-супрессора семейства белков оценивали в 114 случаях GC. Функция опухолевый супрессор исследовали с помощью функциональных анализов. экспрессия гена RPRM отрицательно коррелировала с метилирования промоторов (Спирмена ранга г = -1; р = 0,042). RPRM избыточная экспрессия ингибирует образование колонии и якорного независимый рост. В клинических образцах, экспрессия RPRM гена белка был обнаружен у 75% (15/20) из неопухолевой прилегающей слизистой оболочки, но только в 25% (5/20) желудочных тканей опухоли (р = 0,001). Клинико-патологическими корреляции потери экспрессии RPRM были в значительной степени связано с инвазивной стадии GC (стадия I к II-IV, р = 0,02) и положительной связи между RPRM и экспрессии белкового продукта гена p73 был найден (р &л; 0,0001 и значение каппа = 0,363 ). В заключение, эпигенетические глушение гена RPRM путем метилирования промотора связан с потерей экспрессии RPRM. Функциональные анализы показывают, что RPRM ведет себя как TSG. Потеря экспрессии белкового продукта гена RPRM связано с инвазивной стадии ГХ. Положительная связь между RPRM и выражения р73 позволяют предположить, что другие члены семейства генов р53 могут участвовать в регуляции экспрессии RPRM
<р> Образец цитирования:. Сааведра К, Вальбуэна J, Оливарес W, Маршан MJ, Родригес, Torres- Estay В, и др. (2015) Потеря экспрессии Reprimo, р53-индуцированного клеточного цикла гена, коррелируется с инвазионной стадии опухолевого прогрессирования заболевания и р73 в Expression рака желудка. PLoS ONE 10 (5): e0125834. DOI: 10.1371 /journal.pone.0125834
<р> Академический редактор: Мохаммед Soutto, Университет Вандербильта медицинский центр, Соединенные Штаты
<р> Поступило: 16 января 2015 года; Принято: 25 марта 2015 года; Опубликовано: 8 мая 2015
<р> Copyright: © 2015 Сааведра и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе и ее поддержка информационных файлов
<р> Финансирование:.. это работает при поддержке грантов НКНТИ-FONDECYTo1014 (AHC) и НКНТИ-FONDAP—30011 (AHC и JCR) от правительства Чили

конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является третьей ведущей причиной рака, связанных смерти и пятое место среди самых распространенным злокачественным во всем мире [1]. Несмотря на снижение заболеваемости ГК, частично в связи с признанием определенных факторов риска (например, хеликобактер пилори
и факторы окружающей среды), он остается одним из самых распространенных видов рака во всем мире и по-прежнему является клинической задачей [2 , 3]. Желудочный канцерогенез предполагает постепенное накопление генетических и эпигенетических изменений, что приводит к нарушению регуляции экспрессии онкогенов и генов-супрессоров опухолей (TSGs) [4]. Reprimo (RPRM) является новым мнимый ТСГ [5,6] и связанных с желудочной канцерогенеза [7]. Кроме того, мы предположили, что метилированный бесклеточная ДНК RPRM может быть потенциальным биомаркером для неинвазивного обнаружения GC [8,9].
<Р> RPRM является высоко гликозилированный белок локализован преимущественно в цитоплазме и был идентифицированный как нижестоящий эффектор остановки клеточного цикла р53-индуцированный в G2 /M [10]. Отчеты показывают, что экспрессия RPRM регулируется двумя механизмами, один через метилирование ДНК на его промоторной области [8], а другой р53 пути [10]. Однако более поздние исследования не смогли подтвердить эти результаты [6]. С другой стороны, клиническое значение RPRM было плохо изучен [11]. В настоящем исследовании мы оценили роль метилирования ДНК в регуляции экспрессии RPRM, его клиническое значение и его ассоциации с членами опухолевого супрессора р53 семейства белков (т.е. P53 и р73). Мы нашли плотное метилирование в промоторной области RPRM, что было связано с потерей экспрессии в клеточных линиях GC. В клинических случаях, потеря экспрессии была связана со стадией инвазивность GC. Кроме того, мы наблюдали положительную связь между выражением RPRM и p73, предполагая, что другие члены семейства генов р53 может быть новых кандидатов для регуляции экспрессии RPRM.

Методы

Клеточные линии и Образцы тканей
<р> Четыре клеточные линии GC (AGS, SNU-1, KATOIII и NCI-N87) были приобретены у американской коллекции типовых культур (АТСС) в декабре 2012 культивировали в среде RPMI-1640 (Hyclone) и дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и выдерживают при температуре 37 ° С, 5% СО <югу> 2. Двадцать совпадающая опухолевые и неопухолевой смежно слизистой оболочке (NTAM) образцы были отобраны для оценки экспрессии RPRM. Шесть были отобраны для оценки RPRM метилирования. Когорта 114 пациентов GC был выбран для клинико-патологическими корреляции белкового продукта гена RPRM. Образцы тканей из отдельных случаев были классифицированы в соответствии с японским научно-исследовательского общества при желудочных рекомендаций рака [12]. Все случаи были набраны из Instituto Чилено Japonés де Enfermedades Digestivas-Больница Клинико Сан-Борха Arriarán (ICHJED-HCSBA), Сантьяго, Чили между 1993-2000 [13] и клинико-патологическими особенностями приведены в таблице 1. Данное исследование было одобрено институциональным Обзор Доски Папский католический университет Чили (Comité де ETICA Científico) и ICHJED-HCSBA (Comite де ETICA Científico, Servicio де Salud Metropolitano Центральный, Сантьяго, Чили). Письменное информированное согласие было получено от каждого участника, участвующего в исследовании.

Ткань микрочипов и Immunohistochemistry
<р> Тканевые микрочипы (ТМА), были получены с помощью ручной Tissue Массив II инструмент (Бичер Instruments), как ранее описаны [14,15]. Основные разделы (4 мкм) были подвергнуты иммунным по Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), в соответствии с инструкциями изготовителя. Антитела, используемые в данном исследовании, были RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), р53 (клон 318-6-11, Dako Дания) и р73 белок α (клон 24, Novacastra). Результаты иммунным окрашиванием в целом опухоли и NTAM, а также секций ТМА считались положительными для RPRM если > 30% эпителиальных клеток показало окрашивание цитоплазмы, &GТ; 10% ядерное окрашивание для p53, или > 10% ядерного /цитоплазматических окрашивания для p73 , Оценка иммуногистохимическое окрашивание проводили независимо друг от друга с помощью двух патологов (СП &Amp; ГЦ). Которые не были осведомлены о клинических данных

бисульфит секвенирования и количественного ОТ-ПЦР Анализ экспрессии
<р> ДНК из линий GC клеток было экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Life Technologies) в соответствии протоколом производителя, а затем бисульфита преобразования с помощью метилирования ДНК Gold комплект EZ (Zymo Research). RPRM промотор амплифицировали из бисульфита обработанной ДНК с использованием праймеров 5'-RPRM_B_FW TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'и 5'-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', что позволяет обнаруживать 52 сайтов CpG в пределах 509 п.о. области промотора. ПЦР-продукты очищали с использованием набора для экстракции геля QIAXEN II (QIAGEN) и лигировали в pGEM-T вектора. Продукт лигирования использовали для трансформации компетентных E
. палочка
TOP10 клетки, в соответствии с процедурой, описанной Inoue и др. [16]. Трансформанты были отобраны на чашках с агаром LB, дополненной ампициллином (100 мкг /мл), Х-Gal (50 мг /мл) и IPTG (100 мМ). Полученные белые колонии оценивали с помощью колонии-ПЦР. Положительные клоны выращивали на жидкой среде (LB /ампициллином) до поздней экспоненциальной фазы (OD600 = 1) и плазмиды ДНК очищали с использованием набора для Pure Выход системы Miniprep (Promega). Область промотора RPRM секвенировали с использованием универсального M13 (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'и 5'-RV CAGGAAACAGCTATGAC-3') с помощью Macrogen (http://dna.macrogen.com). BIQ анализатор программного обеспечения был использован для анализа клонов секвенировали. Все положительные pGEM-T клоны выращивали на LB /ампициллином среде и хранили при -80 ° С (в 14% глицерина). Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) и кДНК синтезировали с использованием iScript синтеза кДНК комплект в соответствии с инструкциями производителя (Biorad). Затем кДНК используют для каждой реакции ПЦР с каждой парой праймеров. В RPRM специфичные праймеры являются: RPRM_FW 5'-GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'и 5'-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. В режиме реального времени ОТ-ПЦР анализ проводили с использованием LightCycler Fast Start ДНК MasterPlus SYBR Green I (Roche) в LightCycler 1.5 системы в режиме реального времени обнаружения (Roche). Относительный количественный анализ нормированы на RPL-30 было проведено с помощью сравнительного порогового цикла метода [17]. САП-30 специфических праймеров являются:. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'и 5'-RPL30_RV AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'

Валидация RPRM антитела при помощи иммуноблота и иммунофлюоресценции
<р> 3x10 ^{5 клеток AGS были трансфицированы с pCMV6 /RPRM или pCMV6 (Origene) пустого вектора, используя Lipofectamine 2000 (Invitrogen), в соответствии с протоколом производителя. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки инкубировали в течение 24 ч в RPMI1640 с 10% FBS, в присутствии или в отсутствие ингибитора N-гликозилирование Tunicamicyn (10 нг /мл). Клетки собирали и весь-клеточные лизаты экстрагировали с использованием Тритонового буфера (Трис-HCl, 50 мМ рН 7,5, NaCl, 0,1 М, 0,5% Тритон Х-100) с коктейлем Kit (ингибиторов протеаз P8340, Sigma Aldrich) и коктейль Kit фосфатаза Ингибитор ( SC-45045, Santa Cruz Biotechnology). Концентрации белка определяли с помощью Quick Start Bradford Реагент (Bio-Rad). Пятьдесят мкг белка разделяли на SDS-PAGE 4% до 12%. Белки на гели электроблоттингу на поливинилидендифторидную мембран с помощью мини-системы transblotter (Bio-Rad, Hercules, CA). В дифторида мембраны из поливинилиденфторида блокировали в 5% молоке в Трис-буферном солевом растворе /твин 20 (TBST) в течение 1 ч. Первичное антитело против RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) разводили 1: 1000 в TBST /3% БСА /и мембраны инкубировали в первичных антител при 4 ° С в течение ночи. Мембраны промывали три раза в TBST в течение 10 мин каждый раз. Анти-кроличий, конъюгированные с пероксидазой вторичное антитело (Santa Cruz) разводили 1: 2000 в TBST и инкубировали на мембранах в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны промывали, как описано выше, и визуализировали с использованием SuperSignal West Pico хемилюминесцентный субстрат (Pierce) в соответствии с протоколом производителя. Для оценки клеточного местоположения RPRM, иммунофлюоресценции была выполнена. AGS клетки трансфицированы с pCMV6-RPRM или pCMV6 выращивали на покровных. В трансфицированы клетки AGS фиксировали в 4% параформальдегид в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем промывают три раза в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Клетки проницаемыми в 0,1% Тритон-Х-100 (Sigma-Aldrich) в течение 10 мин, блокировали в 3% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем метили анти-RPRM антитела (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). После промывания PBS клетки инкубировали с Alexa Fluor 488-конъюгированных антител (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) в течение 1 ч при комнатной температуре. Изображения были получены с помощью флуоресцентной лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (см вспомогательную информацию, S1 и S2 рис).}

Культура клеток и трансфекция
<р> Для стабильных экспериментов трансфекции AGS клетки высевают при 3x10 5 клетки 100-мм блюдо культуры /и трансфицированные через 24 ч с pCMV6-RPRM или pCMV6 (Origene) пустой вектор с использованием Липофектамина 2000 (Invitrogen), в соответствии с протоколом производителя. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки культивировали при тех же условиях с использованием G418 (500 г /мл). Питательные среды меняли каждые 24 ч в течение 14 дней.

Колонии Анализ образования
<р> Для анализа колониеобразования, 200 клеток, стабильно трансфицированных pCMV6-RPRM или pCMV6 пустым вектором. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Hyclone) и с добавлением 10% FBS. Питательные среды меняли каждые 24 ч. Колонии окрашивали 0,4% кристаллическим фиолетовым (Sigma) в 50% метанола, 21 день после первоначального посева, и подсчитывали на 20 снимков, сделанных под инвертированным микроскопом (системы формирования изображения Cell Evos XL Ядро, Life Technologies). Каждый трансфекцию проводили в трех повторностях. Кроме того, воспроизводящие эксперименты были проведены с целью получения других клонов для анализа экспрессии.

Анкоридж-независимый анализ роста
<р> Анкоридж-независимый рост клеток анализировали с помощью металлизации 1% агарозы, содержащей 2x10 5 клеток стабильно трансфицированных с pCMV6-RPRM или pCMV6 пустым вектором в 6-луночных планшетах. Клетки подпитывали еженедельно вышележащими свежий раствор мягкого-агар, и колонии были сфотографированы после 4-х недель инкубации. Эксперимент проводился в трех экземплярах.

Статистический анализ
<р> коэффициент корреляции Спирмена был рассчитан для анализа корреляции между RPRM метилирования и уровней экспрессии генов. Категориальные переменные были проанализированы с помощью хи-квадрат Пирсона тест (двухсторонняя), р-значение корректировали с использованием логистического регрессионного анализа. Непрерывные переменные были проанализированы с помощью Стьюдента T
тест и данные выражали как среднее ± стандартное отклонение. тест Kappa был использован для анализа корреляции между выражением RPRM и экспрессии р73. Статистический анализ проводили с помощью программы SPSS версия 17.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс) статистический пакет и программное обеспечение GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, США). Все значения были двусторонними, для Спирмена ранга корреляции исключением. Статистическую значимость определяли как р &ЛТ; 0.05.

Результаты

RPRM метилирование и экспрессию в линиях рака желудка клеток
<р> Ранее мы и другие сообщили, что экспрессия RPRM может быть восстановлен деметилирующий агентом 5-аза -2-дезоксицитидин (См вспомогательную информацию, S3 и S4 рис) [5,8,18]. Однако RPRM метилирование был слабо коррелирует с его экспрессии [18]. Для дальнейшей оценки связи между RPRM метилирования промотора и экспрессии генов, полный промоторной области гена RPRM анализировали с помощью ДНК бисульфитом последовательности в четырех линиях ГХ клеток (AGS, SNU-1, КАТО III и NCI-N87) (рис 1А). Таким образом, статус метилирования 52 сайтов CpG, расположенный между -207 и +302 нуклеотидов относительно сайта инициации транскрипции (TSS), были проанализированы. Этот анализ показывает, плотный метилирование в клеточных линиях AGS и SNU-1 (89,6% и 86%, соответственно) по сравнению с КАТО-III и NCI-N87 (79,7% и 51,8%, соответственно) (р = 0,0002) (рис 1B) , Далее, уровень экспрессии RPRM определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР. Низкая экспрессия гена RPRM наблюдалась в AGS и СНУ-1 по сравнению с КАТО III и линии NCI-N87 клеток (р < 0,0001) (рис 1C). По корреляционный анализ Спирмена показал значительное отрицательная корреляция была обнаружена между плотностью метилирования и экспрессии генов RPRM (г = -1; р = 0,042) (рис 1D). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что метилирование RPRM промоторной области играет важную роль в регуляции экспрессии RPRM.

RPRM метилирование и экспрессию в раковых тканях желудка
<р>, чтобы подтвердить предыдущие данные в GC тканях уровни метилирования RPRM были определены в 6 спаренных опухолей и NTAM образцов. Результаты указывают на более высокие уровни метилирования в опухолевых тканях по сравнению с тканями NTAM (см 1E). Для исследования экспрессии белкового продукта гена RPRM в ГХ тканях анализ IHC проводили. Позитивное выражение RPRM в основном наблюдался в цитоплазме эпителиальных клеток желудка. экспрессия гена белка RPRM был обнаружен у 75% (15/20) из тканей NTAM образцов. Однако только 25% (5/20) образцов опухолей показал экспрессию гена RPRM белкового продукта (рис 2). Эти различия были статистически значимы (р = 0,001), и предполагают, что экспрессия RPRM теряется в дс тканях. Для того, чтобы оценить клиническую значимость этой потери экспрессии RPRM оценивали когорту из 114 случаев GC. Потеря экспрессии RPRM была обнаружена в 62% (71/114) случаев GC. Клинико-патологическими корреляции экспрессии RPRM приведены в таблице 1. Прогрессирование от стадии I ГХ стадии II-IV (р = 0,006) и метастазов в лимфатических узлах (р = 0,037) были связаны с потерей экспрессии белкового продукта гена RPRM. Тем не менее, логистический регрессионный анализ показывает, что только переход от стадии I к II-IV значительно связан с потерей гена RPRM белкового продукта (р = 0,020).

Функциональный анализ из RPRM в рак желудка (образование колоний и якорной стоянки -независимый роста)
<р> Как к потере экспрессии RPRM было связано в GC и в основном с прогрессированием от стадии I к II-IV, опухоль супрессор роль RPRM может быть правдоподобным. Таким образом, функциональные тесты, такие как
пробирке образование колоний в и анализы роста анкерные независимые были выполнены в AGS клетки трансфицированных pCMV6 /RPRM (рис 3А). Non-экспрессирующие AGS клеточные линии, трансфицированные экспрессии RPRM плазмид показали значительно уменьшенное количество колоний по сравнению с pCMV6- пустой вектор трансфицируют клеточные линии, трансфицированные pCMV6-пустым вектором (р &ЛТ; 0,05) (рис 3б). Эффект RPRM оверэкспрессии на якорной независимый рост в мягком агаре анализе образования колоний также оценивали в стабильных трансфецированных AGS клонов клеточной линии. Колонии были подсчитаны после первоначального посева и инкубации в мягком агаре в течение 4-х недель. Клетки, трансфицированные пустым вектором показал устойчивый рост колоний, по количеству и размеру колоний. Это было значительно снижается, когда была вновь выражена RPRM в клетках AGS (рис 3C).

Ассоциация экспрессии RPRM и р53 /р73 опухоли семейства супрессор белка в желудочном
рака <р> RPRM была определена как р53-опосредованных генов в эмбриональных клеток фибробластов [18]. Тем не менее, было сообщено, что регуляция экспрессии RPRM может быть независимым от статуса p53 гена в нейрональных клетках, обработанных медью [19]. С другой стороны, р73 может активировать транскрипцию р53 реагирующих генов [20]. Учитывая эту установку, мы оценивали экспрессию р53 и другого члена семейства белков р53, р73 TSG. Экспрессия р53 была расположена в ядрах клеток слизистой оболочки желудка. Выражение Положительная p53 был обнаружен в 23,5% (20/114) случаев GC. Только размер опухоли был связан с экспрессией р53 (р = 0,035, таблица 2). Экспрессия р73 находился в клеточных ядрах и цитоплазме эпителиальных клеток. Положительная экспрессия р73 была обнаружена в 30,6% (34/114) образцов GC. Интересно отметить, что значительные корреляции клинико-патологических экспрессии р73 были связаны с инвазивной стадии (стадия I 55,6%; 10/18 на стадии II-IV 25,8%; 24/93, р = 0,012) и метастазов в лимфатических узлах (р = 0,038) (таблица 2 ). Поскольку потери экспрессии RPRM и гена p73 белковых продуктов имеют схожие корреляции клинико, мы оценивали связь между выражениями уровней обоих белков. С этой целью случаи были разделены на четыре группы в соответствии с выражением RPRM и р73 белковых продуктов. Анализ показал, что 22 из 111 случаев GC были положительными для обоих RPRM и р73 белков, в то время как 57 из 111 были отрицательными. Это объединение было статистически значимым (р ≪ 0,0001). Со значением каппа 0,363 (таблица 3)

Обсуждение
<р> RPRM является высоко гликозилированный цитоплазматическим белком, первоначально идентифицирован как нижестоящим эффектором p53 индуцированная арест клеточного цикла в G2 /M. Ранее было высказано предположение, что RPRM молчит промоутер метилирования, хотя она была слабо коррелирует с его выражением [5,8]. Кроме того, RPRM был предложен в качестве мнимого опухолевого гена-супрессора в почечно-клеточной карциномы и опухоли гипофиза [5,6]. В этом исследовании мы показали, что экспрессия гена RPRM прочно ассоциируется со своим статусом метилирования области промотора, предлагая эпигенетическую глушителей экспрессии генов RPRM. Кроме того, мы показали, что ген RPRM белка продукт снизился в GC ткани по сравнению с доброкачественное слизистой оболочки желудка. Эти результаты аналогичны Ло и др
. [11], который сообщил потерю RPRM в GC по сравнению с образцов желудочного язву ткани. Кроме того, наш вывод о потере экспрессии RPRM при переходе от стадии I к стадии II-IV является клинически значимым. Ло и др
. [11] сообщили Аналогичный вывод, но в небольшом количестве стадии I GC случаев (п = 15). Эти данные могут иметь клиническое значение в качестве прогностического фактора для прогрессирования GC. Соответственно с этим потери экспрессии RPRM в прогрессировании ГХ наших функциональных анализов (образование колоний и якорного-независимый рост) также предложил предполагаемую роль супрессор опухолей для RPRM в GC.
<Р> Хотя р53 был первоначально описан как RPRM катушка индуктивности [10], клинические исследования, проведенные до сих пор не удалось подтвердить такой вывод [6,18]. Здесь, мы определили, что потеря экспрессии RPRM коррелирует с потерей экспрессии другого члена семейства p53, p73. Хотя P73 ТСГ экспрессируется на очень низком уровне, в нормальных тканях человека [21], избыточно экспрессируется во многих различных раковых заболеваний человека, таких как рак молочной железы, нейробластомы, легких, пищевода, желудка, толстой кишки, мочевого пузыря и яичников [14,22]. Кроме того, сообщалось, что р73 может активировать транскрипцию р53 реагирующих генов, в том числе p21Waf1 /Cip1, Bax, Mdm2, циклин-G, GADD45 и IGFBP3 [20]. Таким образом, основываясь на наших результатах, мы полагаем, что выражение RPRM может регулироваться с помощью p73 в p53-независимым способом.
<Р> Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что эпигенетические глушение гена RPRM путем метилирования промотора связан с потерей выражение RPRM и, соответственно, функциональные анализы предложили предполагаемую супрессор опухолей роль RPRM в GC. В клинических образцах, RPRM теряется при инвазивных стадиях GC и его экспрессия коррелирует с тем из p73 предполагая, что другие члены семейства генов р53 могут участвовать в регуляции экспрессии RPRM. Дальнейшее исследование гарантировано, чтобы охарактеризовать роль RPRM в прогрессировании ГХ и проверки биологической регуляции RPRM с помощью p73.

Поддержка Информация
S1 данных. . Данные, лежащие в основе исследования
DOI: 10.1371 /journal.pone.0125834.s001
(ZIP)
S1 Рис. Эффекты Tunicamicyn на RPRM белка.
RPRM является весьма гликозилированного цитоплазматический белок визуализировали до 25 кДа с помощью Вестерн-блоттинга, ингибитор гликозилирования туникамицина (TK) смещает RPRM полосу 25 кДа до 15 кДа в AGS клетках с RPRM оверэкспрессии (pCMV6 /RPRM) (RPRM предсказали размер 12 кД). Клетки инкубировали в течение 24 ч в RPMI1640 с 10% FBS, в присутствии или в отсутствие ингибитора N-гликозилирования tunicamicyn (10 нг /мл). Выражение RPRM определяли с помощью Вестерн-блоттинга с использованием RPRM поликлональные антитела (верхняя панель, разбавление 1: 1000, Sigma-Aldrich). Выражение бета-актина (нижняя панель, разведение 1: 2000, Santa Cruz) представляет нагрузку белка
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s002
(TIF)
S2 Рис. Локализация экспрессии RPRM в гиперэкспрессией AGS клеточной линии иммунофлюоресценции RPRM в желудочном рака клеточной линии AGS трансфицированных вектора, кодирующего pCMV6 RPRM.
24 ч после трансфекции клетки фиксировали в 4% параформальдегида и инкубировали с анти-RPRM-кролика (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) и вторичного антитела Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). Положительное выражение RPRM (зеленый), в основном, рассматривается в цитоплазме. Изображения были получены при использовании многоканального программного обеспечения Axio Vision4 в флуоресцентный микроскоп Axio Scope.A1- Цейсс
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s003
(TIF)
S3 Рис. Выражение RPRM молчит промоутер метилирования.
A) RT-PCR анализ экспрессии мРНК RPRM в AGS желудка линии раковых клеток с использованием и без ингибитора метилирования ДНК 5-азацитидину (1 мкМ в течение 72 часов). GAPDH, использовали в качестве контроля. Б) Усиление RPRM путем метилирования специфической ПЦР в AGS желудка линии клеток рака. Амплификация метилированного MYOD1 использовали в качестве контроля. клеточная линия AGS была метилируется в области промотора. NC: Отрицательный контроль
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s004
(TIF)
S4 Рис. Выражение RPRM будет подавлен метилирования промоторов (оригинальный гель).
A) RT-PCR анализ экспрессии мРНК RPRM в AGS желудочной линии клеток рака с использованием и без ингибитора ДНК-метилирования 5-азацитидин (1 мкМ в течение 72 часов). GAPDH, использовали в качестве контроля. Б) Усиление RPRM путем метилирования специфической ПЦР в AGS желудка линии клеток рака. Амплификация метилированного MYOD1 использовали в качестве контроля. клеточная линия AGS была метилируется в области промотора. NC:. Отрицательный контроль
DOI: 10.1371 /journal.pone.0125834.s005
(TIFF)

Выражение признательности
<р> Мы хотели бы поблагодарить Сабина Magedson за ее вклад в строительство Тканевые Microarrays. Мы также хотели бы поблагодарить Hiroshi Kawachi для гистологического рассмотрения дел, Игнасио Вичманн за ценные замечания по нашей рукописи и Oslando Падилья за его важную поддержку в статистическом анализе.

• PLoS ONE: Affinity Созревание моноклонального антитела 1E11 целенаправленными рандомизации CDR3 регионов Оптимизирует …
• PLoS ONE: Chrysin Угнетает Опухоль Promoter-индуцированный MMP-9 Expression путем блокирования АР-1 путем подавления ERK и JNK путей…