PLOS ONE: Förlust av expression av Reprimo, en p53-inducerad cellcykelstopp Gene, korrelerar med Invasive Stage för tumörprogression och p73 uttryck i Gastric Cancer

Abstrakt

Reprimo (RPRM), en nedströms effektor av p53-inducerad cellcykelstopp vid G2 /M, har föreslagits som en förmodad tumörsuppressorgen (GTS) och som en potentiell biomarkör för icke-invasiv detektion av magcancer (GC). Syftet med denna studie var att utvärdera den epigenetiska tysta RPRM genen genom promotor metylering och dess tumörsuppressorfunktion i GC-cellinjer. Vidare kliniska betydelsen av RPRM proteinprodukt och dess association med p53 /p73 tumörsuppressorproteinet familj utforskas. Epigenetisk tysta RPRM genen genom promotor metylering utvärderades i fyra GC cellinjer. Proteinuttryck av RPRM utvärderades i 20 tumör och icke-tumör matchade fall. Den kliniska betydelsen av RPRM association med p53 /p73 tumörsuppressorproteinet familj bedömdes i 114 GC fall. Tumörsuppressorfunktion undersöktes genom funktionella analyser. RPRM genuttryck negativt korrelerad med promotor metylering (Spearman rank r = -1; p = 0,042). RPRM uttryck hämmade kolonibildning och förankringsoberoende tillväxt. I kliniska prover, var RPRM gen proteinuttryck detekteras i 75% (15/20) av icke-tumör intill slemhinna, men bara i 25% (5/20) av gastriska tumörvävnader (p = 0,001). Kliniskt patologiska korrelationer av förlust av RPRM uttryck var signifikant associerade med invasiva stadiet av GC (steg I till II-IV, p = 0,02) och ett positivt samband mellan RPRM och p73-gen-proteinprodukten expression befanns (p < 0,0001 och kappa-värde = 0,363 ). Sammanfattningsvis är epigenetisk tysta RPRM genen genom promotor metylering i samband med förlust av RPRM uttryck. Funktionella analyser tyder på att RPRM beter sig som en GTS. Förlust av expression av RPRM gen-proteinprodukten är associerad med den invasiva stadiet av GC. Positivt samband mellan RPRM och p73 uttryck tyder på att andra medlemmar av p53-genfamiljen kan delta i regleringen av RPRM uttryck

Citation. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- Estay V, et al. (2015) Förlust av expression av Reprimo, en p53-inducerad cellcykelstopp Gene, korrelerar med Invasive Stage för tumörprogression och p73 uttryck i magcancer. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10.1371 /journal.pone.0125834

Academic Redaktör: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, USA

Mottagna: 16 januari 2015, Accepteras: 25 mars 2015, Publicerad: 8 maj 2015

Copyright: © 2015 Saavedra et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och stödja informationsfiler

Finansiering:.. detta fungerar har finansierats med bidrag CONICYT-FONDECYTo1014 (AHC) och CONICYT-FONDAP.130.011 (AHC och JCR) från Chiles regering

konkurrerande intressen. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer (GC) är den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad död och den femte mest gemensam malignitet i världen [1]. Trots den minskade förekomsten av GC, delvis på grund av erkännandet av vissa riskfaktorer (t.ex. Helicobacter pylori Mössor och miljöfaktorer), är det fortfarande en av de vanligaste cancer hela världen och fortsätter att vara en klinisk utmaning [2 , 3]. Gastric cancer innebär en gradvis ackumulering av genetiska och epigenetiska förändringar, vilket leder till dysreglering i uttrycket av onkogener och tumörsuppressorgener (GTS) [4]. Reprimo (RPRM) är en ny förmodad TSG [5,6] och associerad med gastrisk karcinogenes [7]. Dessutom har vi föreslagit att denaturerad RPRM cellfria DNA kan vara en potentiell biomarkör för icke-invasiv detektion av GC [8,9].

RPRM är en mycket glykosylerat protein lokaliserat övervägande i cytoplasman och har varit identifierats som en nedströms effektor för p53-inducerad cellcykelstopp vid G2 /M [10]. Rapporter tyder på att RPRM uttryck regleras av två mekanismer, en genom DNA-metylering vid dess promotorregion [8] och den andra av p53 väg [10]. Emellertid har senare studier inte kunnat bekräfta dessa fynd [6]. Å andra sidan har den kliniska betydelsen av RPRM varit dåligt studerats [11]. I denna studie har vi utvärderat betydelsen av DNA-metylering i regleringen av RPRM uttryck, dess kliniska betydelse och dess förening med medlemmar av p53 tumörsuppressorproteinet familj (dvs p53 och P73). Vi hittade tät metylering i RPRM promotorregionen, som var förknippad med förlust av uttryck i GC-cellinjer. I kliniska fall har förlust av expression associerad med invasivitet skede av GC. Dessutom observerade vi ett positivt samband mellan uttryck av RPRM och p73, vilket tyder på att andra medlemmar av p53-genfamiljen kan vara nya kandidater för reglering av RPRM uttryck.

Metoder

cellinjer och vävnads~~POS=TRUNC

Fyra GC cellinjer (AGS, SNU-1, KATOIII och NCI-N87) köptes från American Type Culture Collection (ATCC) i december 2012 odlades i RPMI-1640-medium (Hyclone) och kompletterades med 10% fetalt bovint serum (FBS) och hölls vid 37 ° C, 5% CO _{2. Tjugo matchade tumör och icke-tumör intilliggande slemhinnor (NTAM) prover ut för utvärdering av RPRM uttryck. Sex valdes ut för utvärdering av RPRM metylering. En kohort av 114 GC patienter ut för kliniskt patologiska korrelationer RPRM gen-proteinprodukten. Vävnadsprover från enskilda fall klassificerades i enlighet med japanska Research Society for Gastric rekommendationer Cancer [12]. Samtliga fall rekryterades från Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-sjukhuset Clínico San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago, Chile mellan 1993 till 2000 [13] och kliniskt patologiska egenskaper visas i tabell 1. Studien godkändes av Institutional Review Boards of Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de Etica Científico) och ICHJED-HCSBA (Comité de Etica Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chile). Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje inblandade i studien deltagare.}

Tissue microarray och immunohistokemi

Vävnads microarrays (TMA) gjordes med hjälp av en manuell Tissue Array II instrument (Beecher Instruments) som tidigare beskrivits [14,15]. Kärnsektioner (4μm) underkastades immunfärgning av Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), enligt tillverkarens instruktioner. Antikroppar som används i denna studie var RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (klon 318-6-11, Dako Danmark) och p73-protein α (klon 24, Novacastra). Resultat av immunofärgning i hela tumören och NTAM samt TMA sektioner betraktades som positiva för RPRM om > 30% av epitelceller uppvisade cytoplasmisk färgning > 10% nukleär färgning för p53, eller > 10% nukleär /cytoplasma färgning för p73 . Utvärdering av immunohistokemisk färgning utfördes självständigt av två patologer (JV & GC). Som var blinda för kliniska data

bisulfit sekvensering och kvantitativ RT-PCR Expression Analysis

DNA från GC cellinjer var extraherades med användning av TRIzol-reagens (Life Technologies) enligt tillverkarens protokoll, följt av bisulfit omvandling genom att använda EZ DNA-metylering Gold kit (Zymo Research). RPRM promotorn amplifierades från bisulfit-behandlad DNA, med användning av primrar RPRM_B_FW 5'-TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'och RPRM_B_RV 5'-CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', vilket tillåter detektion av 52 CpG-platser inom en 509-bp-promotorregionen. PCR-produkterna renades med QIAXEN II gelextraheringskit (QIAGEN) och ligerades in i pGEM-T-vektor. Ligeringsprodukten användes för att transformera kompetenta E
. coli
Top10 celler, enligt det förfarande som beskrivs av Inoue et al. [16]. Transformanterna selekterades på LB-agarplattor kompletterade med ampicillin (100 mikrogram /ml), X-Gal (50 mg /ml) och IPTG (100 mM). De resulterande vita kolonier bedömdes genom koloni-PCR. Positiva kloner odlades på flytande medium (LB /ampicillin) förrän sent exponentiell fas (OD600 = 1) och DNA-plasmider renades med ren Yield miniprep systemet kit (Promega). Den RPRM promotorregionen sekvenserades med användning av universella M13 (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'och RV 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') genom Macrogen (http://dna.macrogen.com). BIQ analysator programvara användes för analys av sekvense kloner. Alla positiva pGEM-T-kloner odlades på LB /ampicillin-medium och förvarades vid -80 ° C (i 14% glycerol). Totalt RNA extraherades med användning av TRIzol-reagens (Invitrogen) och cDNA syntetiserades med användning iScript cDNA Synthesis-kit enligt tillverkarens instruktioner (Biorad). Därefter tillsattes cDNA användes för varje PCR-reaktion med varje primerpar. De RPRM specifika primers är: RPRM_FW 5'-GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'och RPRM_RV 5'-CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. Realtids RT-PCR-analys utfördes genom att använda LightCycler snabbstart DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche) i en LightCycler 1,5 Real-Time Detection System (Roche). Relativ kvantitativ analys normaliserad till RPL-30 genomfördes via den jämförande cykeln tröskelmetoden [17]. De RPL-30-specifika primrar är:. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'och RPL30_RV 5'-AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'

Validering av RPRM antikropp genom Immunoblot och immunofluorescens

3x10 ^{5 AGS-celler transfekterades transient med pCMV6 /RPRM eller pCMV6 (Origene) tom vektor, med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen), enligt tillverkarens protokoll. Fyrtioåtta timmar efter transfektion, inkuberades cellerna under 24 h i RPMI1640 med 10% FBS i närvaro eller frånvaro av N-glykosylering inhibitor Tunicamicyn (10 ng /ml). Cellerna skördades och hel-cellysat extraherades med användning av Triton-buffert (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,1 M, 0,5% Triton X-100) med Protease Inhibitor Cocktail Kit (P8340, Sigma-Aldrich) och Phosphatase Inhibitor Cocktail Kit ( SC-45045, Santa Cruz Biotechnology). Proteinkoncentrationer bestämdes med användning av snabbstart Bradford-reagens (Bio-Rad). Femtio | ig protein separerades på SDS-PAGE 4% till 12%. Proteiner på gelerna elektroblottades till polyvinylidendifluorid-membran med användning av mini transblotter systemet (Bio-Rad, Hercules, CA). De polyvinylidendifluorid Membranen blockerades i 5% mjölk i Tris-buffrad saltlösning /Tween 20 (TBST) under 1 h. Primär antikropp anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) späddes 1: 1000 i TBST /3% BSA /och membranen inkuberades i primära antikroppar vid 4 ° C över natten. Membranen tvättades tre gånger i TBST under 10 min vardera. Anti-kanin-peroxidas-konjugerad sekundär antikropp (Santa Cruz) späddes 1: 2000 i TBST och inkuberades på membranen under 1 timme vid rumstemperatur. Membranen tvättades enligt ovan och visualiserades med användning av supersignalen West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) enligt tillverkarens protokoll. För att utvärdera den cellulära lokaliseringen av RPRM ades immunfluorescensanalys utförs. AGS-celler transient transfekterade med pCMV6-RPRM eller pCMV6 odlades på täck. De övergående transfekterade AGS-celler fixerades i 4% paraformaldehyd under 20 min vid rumstemperatur och tvättades sedan tre gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Cellerna permeabiliserades i 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) under 10 min, blockerades i 3% BSA under 1 h vid rumstemperatur, och därefter märkt med en anti-RPRM antikropp (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Efter tvättning med PBS inkuberades cellerna med en Alexa Fluor 488-konjugerad antikropp (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) under 1 h vid rumstemperatur. Bilder förvärvades av fluorescenslaserscanning konfokalmikroskopi (se Stöd Information S1 och S2 figurerna).}

Cellodling och transfektion

För stabil transfektion experiment, AGS-celler ströks på 3x10 ^{5 celler /100-mm odlingsskål och transfekterade efter 24 h med pCMV6-RPRM eller pCMV6 (Origene) tom vektor med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen), enligt tillverkarens protokoll. Fyrtioåtta timmar efter transfektion, cellerna odlas under samma betingelser med G418 (500 g /ml). Odlingsmedia byttes var 24 h under 14 dagar.}

kolonibildningsanalys

För kolonibildningsanalys, var 200 celler stabilt transfekterade med pCMV6-RPRM eller pCMV6 tom vektor. Celler odlades i RPMI-1640-medium (Hyclone) och kompletterat med 10% FBS. Odlingsmedia ändrades varje 24 h. Kolonier färgades med användning av 0,4% kristallviolett (Sigma) i 50% metanol, 21 dagar efter initial sådd och räknade på 20 bilder tagna i inverterat mikroskop (Evos XL Kärn cell imaging System, Life Technologies). Varje transfektion utfördes i triplikat. Dessutom har replikera experiment utförs för att erhålla ytterligare kloner för expressionsanalys.

förankringsoberoende tillväxtanalys

förankringsoberoende celltillväxt analyserades genom utstrykning 1% agaros innehållande 2x10 ^{5 celler stabilt transfekterade med pCMV6-RPRM eller pCMV6 tom vektor i sex brunnar. Cellerna matades veckovis genom överliggande frisk mjuk-agar-lösning, och kolonier fotograferades efter 4 veckors inkubation. Experimentet utfördes i tre exemplar.}

Statistisk analys

Spearman korrelationskoefficient beräknades för att analysera sambandet mellan RPRM metylering och gen-uttrycksnivåer. Kategoriska variabler analyserades med Pearson Chi-Square test (dubbelsidig), erhölls p-värdet korrigeras med hjälp av en logistisk regressionsanalys. Kontinuerliga variabler analyserades med användning av Students t
testet och data uttrycktes som medelvärde ± SD. Kappa test användes för att analysera sambandet mellan RPRM uttryck och P73 uttryck. Statistiska analyser utfördes med användning av SPSS version 17,0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistikpaketet och GraphPad Prism5 programvara (La Jolla, CA, USA). Alla värden var tvåsvansade, utom för Spearman rank korrelation. Statistisk signifikans definierades som p < 0.05.

Resultat

RPRM metylering och uttryck i magcancer cellinjer

Tidigare vi och andra har rapporterat att RPRM uttryck kan återställas genom den demetyliseringsmedel 5-aza -2-deoxicytidin (Se Bakgrundsinformation S3 och S4 figurerna) [5,8,18]. Men RPRM metylering har svagt korrelerad med dess uttryck [18]. För att ytterligare utvärdera sambandet mellan RPRM promotor metylering och genuttryck, var den fullständiga promotorregionen av RPRM gen analyserades genom DNA-bisulfit sekvense i fyra GC cellinjer (AGS, SNU-1, KATO III och NCI-N87) (Fig 1A). Således metyleringsstatus av 52 CpG-platser, som ligger mellan -207 och +302 nukleotider i förhållande till transkriptionsstartstället (TSS), analyserades. Denna analys visar tät metylering i cellinjer AGS och SNU-1 (89,6% och 86%, respektive), i jämförelse med KATO III och NCI-N87 (79,7% och 51,8%, respektive) (p = 0,0002) (Fig 1B) . Därefter nivå RPRM uttryck bestämdes genom kvantitativ RT-PCR. Låg RPRM genuttryck observerades i AGS och SNU-1 jämfört med KATO III och NCI-N87 cellinjer (p < 0,0001) (Figur 1C). Genom avslöjade Spearmans korrelationsanalys signifikant negativ korrelation mellan metylering densitet och RPRM genexpression (r = -1; p = 0,042) (Fig 1D). Sammantaget tyder dessa fynd att metylering av RPRM promotorregionen spelar en avgörande roll i regleringen av RPRM uttryck.

RPRM metylering och uttryck i magcancer vävnader

För att bekräfta tidigare data i GC vävnader ades RPRM metylering nivåer bestämdes i 6 parade tumör och NTAM prover. Resultaten tyder på högre metylering nivåer i tumörvävnad jämfört med NTAM vävnader (se figur 1E). För att undersöka uttrycket av RPRM gen-proteinprodukten i GC vävnader IHC analys utfördes. Positiv RPRM expression huvudsakligen observeras i cytoplasman av gastriska epitelceller. RPRM gen protein uttryck detekterades i 75% (15/20) av NTAM vävnadsprover. Dock endast 25% (20/05) av tumörprover visade expression av RPRM gen-proteinprodukten (figur 2). Dessa skillnader var mycket signifikant (p = 0,001) och föreslår att uttryck av RPRM går förlorad i GC vävnader. För att utvärdera den kliniska betydelsen av denna förlust av RPRM uttryck en kohort av 114 GC fall utvärderades. Förlust av RPRM uttryck återfanns i 62% (71/114) av GC fall. Kliniskt patologiska korrelationer RPRM uttryck visas i Tabell 1. Progression från steg I GC stadier II-IV (p = 0,006) och lymfkörtel metastas (p = 0,037) var signifikant associerade med förlust av uttryck av RPRM gen-proteinprodukten. Emellertid visar logistisk regressionsanalys som bara progression från steg I till II-IV är signifikant associerad med förlust av RPRM gen proteinprodukt (p = 0,020).

Funktionell analys av RPRM i magcancer (kolonibildning och förankring -oberoende tillväxt) Review

Eftersom förlusten av RPRM uttryck förknippades i GC och främst med utvecklingen från steg i till II-IV, kan en tumörsuppressor roll RPRM vara rimliga. Därför funktionella analyser såsom in vitro
kolonibildning och förankringsoberoende tillväxt analyser utfördes i AGS cell transfekterad med pCMV6 /RPRM (fig 3A). Icke-uttryckande AGS cellinjer transfekterade med RPRM expressionsplasmider visade en signifikant reducerat antal kolonier i jämförelse med pCMV6- tom vektor-transfekterade cellinjer transfekterade med pCMV6-tom vektor (p 0,05) (fig 3B). Effekten av RPRM uttryck på förankringsoberoende tillväxt i en mjukagar-kolonibildningsanalys bedömdes också i stabila transfekterade AGS cellinje kloner. Kolonier räknades efter initial seeding och inkubering i mjuk agar i 4 veckor. Celler transfekterade med tom vektor uppvisade kraftig kolonitillväxt i antal och storlek av kolonier. Detta har begränsats kraftigt när RPRM åter uttrycktes i AGS-celler (Fig 3C).

Association of RPRM uttryck och p53 /p73 tumörsuppressorproteinet familj i magcancer

RPRM har definierats som en p53-medierad gen i embryonala fibroblastceller [18]. Emellertid har det rapporterats att regleringen av RPRM uttryck skulle kunna vara oberoende av p53-genen status i neuronala celler behandlade med koppar [19]. Å andra sidan p73 kan aktivera transkriptionen av p53-responsiva gener [20]. Med tanke på denna inställning, utvärderade vi uttrycket av p53 och andra medlemmar av p53-proteinfamiljen, P73 TSG. Expression av p53 var beläget i kärnan av magslemhinnan celler. Positiv p53-expression detekterades i 23,5% (20/114) av GC fall. Enbart tumörstorleken var associerad med uttrycket av p53 (p = 0,035, se tabell 2). Uttryck av p73 var belägen i cellkärnor och cytoplasma av epitelceller. Positiv p73 uttryck återfanns i 30,6% (34/114) av GC prover. Intressant nog var betydande kliniskt patologiska korrelationer av p73 uttryck i samband med invasiv steg (steg I 55,6%, 10/18 stadier II-IV 25,8%, 24/93, p = 0,012) och lymfkörtel metastas (p = 0,038) (Tabell 2 ). Eftersom förlust av uttryck av RPRM och p73-genen proteinprodukter har liknande kliniskt patologiska samband utvärderade vi association mellan uttryck nivåer av båda proteinerna. I detta syfte fall separerades i fyra grupper beroende på uttrycket av RPRM och p73 proteinprodukter. Analysen visade att 22 ut 111 GC fall var positiva för både RPRM och p73-proteiner, medan 57 ut 111 var negativa. Denna förening var statistiskt signifikant (p < 0,0001). Med ett kappavärde på 0,363 (tabell 3) katalog

Diskussion

RPRM är ett mycket glykosylerat cytoplasmiskt protein, som ursprungligen identifierats som en nedströms effektor för p53 inducerad cellcykelstopp vid G2 /M. Tidigare har det föreslagits att RPRM tystas av promotor metylering, även om det har varit svagt korrelerad med dess uttryck [5,8]. Dessutom har RPRM föreslagits som en förmodad tumörsuppressorgen i njurcellskarcinom och hypofystumörer [5,6]. I denna studie visade vi att RPRM genuttryck är starkt förknippad med dess promotorregion metyleringsstatus, vilket tyder på epigenetisk tysta RPRM genexpression. Dessutom visar vi att RPRM gen-proteinprodukten minskades i GC vävnad jämfört med noncancerous magslemhinnan. Dessa resultat är liknande den i Luo et al
. [11], som rapporterade förlust av RPRM i GC jämfört med magsår vävnadsprover. Vidare II-IV är vår slutsats om förlust av uttryck av RPRM i övergången från steg I till stadier kliniskt relevant. Luo et al
. [11] rapporterade en liknande slutsats, men i ett litet antal steg I GC fall (n = 15). Dessa fynd kan ha klinisk betydelse som en prediktiv faktor för utvecklingen av GC. Följaktligen med denna förlust av RPRM uttryck i utvecklingen av GC, våra funktionella analyser (kolonibildning och förankringsoberoende tillväxt) föreslås också en förmodad tumörsuppressor roll RPRM i GC.

Trots att p53 beskrevs ursprungligen som en RPRM induktor [10], kliniska studier utförts aktuell har inte kunnat bekräfta detta konstaterande [6,18]. Här identifierade vi att förlusten av RPRM uttryck korrelerar med förlust av uttryck av en annan medlem av p53 familj, P73. Även om p73 TSG uttrycks vid en mycket låg nivå i normala humana vävnader [21], är överuttryckt i många olika humana cancrar såsom bröst-, neuroblastom, lunga, matstrupe, magsäck, kolon, urinblåsa och äggstock [14,22]. Dessutom har det rapporterats att p73 kan aktivera transkriptionen av p53-responsiva gener, inklusive p21Waf1 /Cip1, bax, MDM2, cyklin-G, GADD45 och IGFBP3 [20]. Således, baserat på våra resultat, föreslår vi att RPRM uttryck kan regleras av p73 i en p53-oberoende sätt.

Sammanfattningsvis våra data tyder på att epigenetiska tysta RPRM genen genom promotor metylering är förknippad med förlust av RPRM expression och följaktligen föreslagit funktionella analyser en förmodad tumörsuppressor roll RPRM i GC. I kliniska prover är RPRM förlorad vid invasiva stadier av GC och dess uttryck korrelerar med den för p73 tyder på att andra medlemmar av p53-genfamiljen kan delta i regleringen av RPRM uttryck. Ytterligare forskning är motiverat att karakterisera roll RPRM i utvecklingen av GC och validera den biologiska regleringen av RPRM av p73.

Bakgrundsinformation
S1 Data. . Uppgifter som ligger till grund för studien
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s001
(ZIP) Review S1 Fig. Effekter av Tunicamicyn på RPRM protein.
RPRM är en mycket glykosylerat cytoplasmaproteinet visualiseras till 25 kD genom Western blot, den glykosylering hämmaren tunikamycin (TK) förskjuter 25 kD RPRM band till 15 kD i AGS celler med RPRM uttryck (pCMV6 /RPRM) (RPRM förutsagda storleken 12 kD). Celler inkuberades under 24 timmar i RPMI1640 med 10% FBS i närvaro eller frånvaro av inhibitor av N-glykosylering tunicamicyn (10 ng /ml). RPRM expression bestämdes med Western blotting med användning av en RPRM polyklonal antikropp (övre panel, spädning 1: 1000, Sigma-Aldrich). Uttrycket av β-aktin (lägre panel, utspädning 1: 2000, Santa Cruz) representerar proteinladdning
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s002
(TIF) Review S2 Fig. Lokalisering av RPRM uttryck i överuttrycker AGS cellinje Immunofluorescens av RPRM i magcancer AGS cellinje transfekterad med pCMV6 vektor som kodar för RPRM.
24 h efter transfektion fixerades cellerna i paraformaldehyd 4% och odlades med anti-RPRM-kanin (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) och sekundär antikropp Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). En positiv uttryck för RPRM (grön) i huvudsak ses i cytoplasman. Bilder fångades på att använda Axio Vision4 flerkanalig programvara i fluorescensmikroskop Axio Scope.A1- Zeiss
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s003
(TIF) Review S3 Fig. RPRM expression tystas av promotor metylering. Review, en) RT-PCR-analys av RPRM mRNA-uttryck i AGS gastric cancer cell-linje med och utan DNA-metyleringshämmare 5-azacytidin (1 uM under 72 timmar). GAPDH användes som kontroll. B) Förstärkning av RPRM genom metylering Specifik PCR i AGS magsäckscancer cellinje. Amplifiering av metylerat MYOD1 användes som kontroll. AGS-cellinjen metylerades i promotorregionen. NC: negativ kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s004
(TIF) Review S4 Fig. RPRM expression tystas av promotor metylering (original gel). Review, en) RT-PCR-analys av RPRM mRNA-uttryck i AGS gastric cancer cell-linje med och utan DNA-metyleringshämmare 5-azacytidin (1 uM under 72 timmar). GAPDH användes som kontroll. B) Förstärkning av RPRM genom metylering Specifik PCR i AGS magsäckscancer cellinje. Amplifiering av metylerat MYOD1 användes som kontroll. AGS-cellinjen metylerades i promotorregionen. NC:. Negativ kontroll
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s005
(TIFF) katalog

Tack till

Vi vill tacka Sabina Magedson för hennes bidrag i byggnad vävnads~~POS=TRUNC Microarrays. Vi vill också tacka Hiroshi Kawachi för histologisk granskning av fall, Ignacio Wichmann för deras värdefulla synpunkter på våra manuskript och Oslando Padilla för hans viktiga stöd i statistisk analys.

• PLOS ONE: affinitetsmognad av monoklonal antikropp 1E11 genom riktade Randomization i CDR3 regioner optimerar terapeutisk antikropp Targeting av HER2-positiv Gastric Cancer
• PLOS ONE: Chrysin hämmar tumör Promoter-inducerad MMP-9 uttryck genom att blockera AP-1 via bekämpande av ERK och JNK banor i Gastric cancerceller