Plos ONE: Izguba izražanju Reprimo, a-p53 povzroča Cell Cycle naloga Gene, povezana z invazivno odru napredovanje tumorjev in P73 izražanja v želodca Cancer

Povzetek

Reprimo (RPRM), efektor na nižji stopnji od -p53 inducira zastoj celičnega ciklusa v G2 /M, je bil predlagan kot domnevni tumorski supresor genov (ZTP) in kot potencialni biomarkerja za neinvazivno odkrivanje raka želodca (GC). Cilj te raziskave je bil oceniti epigenetsko utišanje RPRM gena, ki promotorja metilacije in njenega tumorja funkcijo supresor v celičnih linijah GC. Poleg tega je bil raziskati klinični pomen RPRM beljakovin proizvoda in njegove povezave z p53 /P73 družine zaviralnih proteinov. Epigenetsko utišanje RPRM gena, ki promotorja metilacije so ocenili v štirih GC celičnih linijah. Protein izraz RPRM so ocenili v 20 tumorja in ne tumor ujema primere. Klinični pomen RPRM povezavi z p53 /P73 zaviralnih družine proteinov je bila ocenjena v 114 primerih GC. Funkcija zaviralnih bila preučena s funkcionalnimi testi. RPRM izražanje genov je v negativni korelaciji s promotor metilacije (Spearmanu ranga r = -1; p = 0,042). RPRM overexpression zaviral nastanek kolonij in rast sidrišča neodvisen. V kliničnih vzorcih je bila RPRM gen izražanje zaznali pri 75% (15/20), ki niso tumorsko sosednji sluznice, vendar le v 25% (5/20) želodčnih tumorskih tkiv (p = 0,001). Clinicopathological korelacije izgube RPRM izražanja so znatno povezana z invazivno fazi GC (faza I II-IV, p = 0,02) in pozitivno povezavo med RPRM in P73 genske ekspresije proteina izdelka je bilo ugotovljeno (p < 0,0001 in kapa vrednost = 0,363 ). Na koncu je epigenetsko utišanje RPRM gena, ki promotorja metilacije povezana z izgubo RPRM izražanja. Funkcionalni testi kažejo, da RPRM obnaša kot zajamčene tradicionalne posebnosti. Izguba izražanja RPRM genskega proteinskega produkta povezan z invazivno fazi GC. Pozitivna povezava med RPRM in P73 izražanja kažejo, da lahko drugi člani p53 gena družine sodelujejo pri regulaciji RPRM izražanja

Navedba. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- Estay V. et al. (2015) Izguba izražanju Reprimo, a-p53 povzroča Cell Cycle naloga Gene, povezana z invazivno odru napredovanje tumorjev in P73 izražanja želodčnega raka. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10,1371 /journal.pone.0125834

Akademska Urednik: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, UNITED STATES

Prejeto: 16. januar 2015; Sprejeto: 25. marec 2015; Objavljeno: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Saavedra et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:.. Ta del je bil podprt s donacije CONICYT-FONDECYTo1014 (AHC) in CONICYT-FONDAP—30011 (AHC in JCR) od vlade Čile

nasprotujočimi si interesi. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je tretji najpogostejši vzrok smrti zaradi raka in peta najbolj Skupno maligne bolezni po vsem svetu [1]. Kljub manjšim pojavnosti GC, delno zaradi priznanja nekaterih dejavnikov tveganja (npr Helicobacter pylori
in okoljski dejavniki), je še vedno eden izmed najpogostejših rakov po vsem svetu in je še vedno klinični izziv [2 , 3]. Želodca karcinogeneze vključuje postopno kopičenje genetskih in epigenetskih sprememb, ki vodi do disregulacijo pri izražanju onkogenov in zaviralnih genov (ZTP) [4]. Reprimo (RPRM) je nov domnevni TSG [5,6] in so povezane z želodčno rakotvornost [7]. Poleg tega smo predlagali, da se lahko metiliran RPRM brez celic DNA potencial biomarker za neinvazivno odkrivanje GC [8,9].

RPRM je visoko glikoziliranega proteina lokalizirana pretežno v citoplazmi in je bil opredeljena kot efektor nadaljnji of-p53 povzroča ustavitev celičnega cikla v G2 /M [10]. Poročila kažejo, da je RPRM izraz urejata dva mehanizma, enega preko metilacije DNA na svoji promotorja regiji [8], drugo pa p53 poti [10]. Vendar pa so novejše raziskave niso mogli potrditi te ugotovitve [6]. Po drugi strani pa je klinični pomen RPRM je slabo raziskana [11]. V tej raziskavi smo ovrednotili vlogo metilacije DNA pri regulaciji RPRM izražanja, klinični pomen in njene zveze s člani p53 zaviralnih proteinov družine (tj p53 in P73). Ugotovili smo gosto metilacije v RPRM promotorski regiji, ki je povezano z izgubo izražanja v GC celičnih linijah. V kliničnih primerov je izguba izražanja povezana s stopnjo invazivnosti GC. Poleg tega smo ugotovili pozitivno povezavo med izražanjem RPRM in P73, kar kaže, da bi lahko drugi člani p53 gena družine se nove kandidate za regulacijo RPRM izražanja.

metod

Mobilni Lines in Tkivo Vzorci

štiri GC celične linije (AGS, snu-1, KATOIII in NCI-N87) smo dobili od American Type Culture Collection (ATCC) v decembru 2012 gojimo v RPMI-1640 medij (Hyclone) in dopolni z 10% fetalni goveji serum (FBS) in jo vzdržujemo pri 37 ° C, 5% CO _{2. Dvajset ujema tumor in ne tumor v bližini sluznice (NTAM) vzorci so bili izbrani za oceno RPRM izražanja. Šest so bile izbrane za oceno RPRM metilacije. Kohorti 114 bolnikov GC je bil izbran za clinicopathological korelacij RPRM genov proteinskega produkta. Tkiva vzorcev iz posameznih primerih so bile razvrščene v skladu z japonsko raziskovalnega združenja za zdravljenje želodčnih priporočila za boj proti raku [12]. Vsi primeri so bili zaposleni od Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital klinično San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago, Čile med 1993-2000 [13] in clinicopathological funkcije, so prikazani v tabeli 1. Ta študija je odobril institucionalne Pregled odbori Pontificia Universidad Catolica de Chile (Comité de etica Científico) in ICHJED-HCSBA (Comité de etica Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Čile). Pisna privolitev je bila pridobljena iz vsakega, ki sodeluje pri raziskavi udeleženca.}

tkiv mikromrež in Imunohistokemija

tkiv mikromrež (TMA) so bile izvedene z uporabo instrumenta Array II Manual Tissue (Beecher inštrumenti), kot prej opisana [14,15]. Core oddelki (4μm) so bili izpostavljeni imunskim barvanjem ga Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), v skladu z navodili proizvajalca. Protitelesa, ki se uporabljajo v tej študiji je bilo RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (klon 318-6-11, Dako Danska) in P73 protein α (klon 24, Novacastra). Rezultati imunskim barvanjem v celotnem tumorja in NTAM kot tudi TMA odseke smo smatrali pozitivne za RPRM če > 30% epitelijskih celic pokazala citoplazemsko obarvanje, > 10% jedrske obarvanje za p53 ali > 10% jedrskih /citoplazemskega barvanja za P73 . Vrednotenje imunohistokemičnim barvanjem je bila izvedena neodvisno dveh patologov (JV & PK)., Ki so zaslepljeni s kliničnimi podatki

Bisulfite zaporedja in kvantitativno RT-PCR Expression Analiza

DNK iz celične linije GC je pridobljeni z uporabo TRIzola reagenta (Life Technologies) po protokolu proizvajalca, ki mu sledi bisulfita pretvorbo uporabo EZ DNA metilacijskega Gold kit (Zymo Research). RPRM promotor smo pomnožili od-bisulfita obdelano DNK, s pomočjo začetnih oligonukleotidov RPRM_B_FW 5'-TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 "in RPRM_B_RV 5'-CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3", ki omogoča odkrivanje 52 CpG območij v 509-bp promotorja regiji. PCR produkt smo očistili z QIAXEN II ekstrakcije gel kit (Qiagen) in ligiramo v pGEM-T vektor. Produkt ligation je bila uporabljena za preoblikovanje pristojni E
. coli
Najboljših 10 celice v skladu s postopkom, ki ga Inoue et al opisan. [16]. Je transformante smo izbrali na LB agarske plošče, dopolnjeni z ampicilin (100 ug /ml), X-Gal (50 mg /ml) in IPTG (100 mM). Nastale bele kolonije so bili ocenjeni s kolonijo PCR. Pozitivne klone smo gojili na tekočem mediju (LB /ampicilina) do pozne eksponentne faze (OD600 = 1) in DNK plazmidov so očistili s pomočjo Pure Donos miniprep sistem komplet (Promega). Promotor regija RPRM je sekvenco s pomočjo univerzalnega M13 (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'in RV 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3), ki ga Macrogen (http://dna.macrogen.com). BIQ analizator programska oprema je bila uporabljena za analizo zaporednih klonov. Vsi pozitivni pGEM-T klone smo gojili na LB /ampicilina mediju in shranimo pri -80 ° C (iz 14% glicerola). Celotno RNA smo ekstrahirali z uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen) in cDNA smo sintetizirali z uporabo iScript cDNA sintezno kit v skladu z navodili proizvajalca (BioRad). Nato je cDNA uporabljena za vsako reakcijo PCR z vsakim oligonukleotidni pobudnik par. V RPRM specifične primerji so: RPRM_FW 5'-GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'in RPRM_RV 5'-CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3 ". Realnem času RT-PCR analizo smo izvedli s pomočjo LightCycler hiter začetek DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche) v LightCycler sistema v realnem času Detection 1.5 (Roche). Relativna kvantitativna analiza preračuna RPL-30 je bila izvedena po metodi primerjalnega praga cikel [17]. Posebni primerji RPL-30 so:. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'in RPL30_RV 5'-AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'

validacija RPRM protitelesa, ki ga imunoblot and imunofluorescenčni

3x10 ^{5 AGS celice so bile prehodno transfekciji s pCMV6 /RPRM ali pCMV6 (Origene) prazen vektor, s pomočjo Lipofectamine 2000 (Invitrogen), v skladu s protokolom proizvajalca. Oseminštirideset ur po transfekciji smo celice inkubirali 24 ur pri RPMI1640 z 10% FBS v prisotnosti ali odsotnosti inhibitorja N-glikozilacijsko Tunicamicyn (10 ng /ml). Celice so bile pobrane in celotne celične lizate pridobljeni z uporabo Triton pufra (Tris-HCl 50 mM pH7.5, NaCl 0,1M, 0,5% Triton X-100), s inhibitor proteaze Cocktail Kit (P8340, Sigma-Aldrich) in Fosfataza zaviralec Cocktail Kit ( sc-45045, santa Cruz Biotechnology). Koncentracije proteinske smo določili s pomočjo Quick Start, Bradford Reagent (Bio-Rad). Petdeset ig proteina ločimo na SDS-PAGE 4% do 12%. Beljakovine o geli so electroblotted na poliviniliden ditluoridne membrane z uporabo mini transblotter sistema (Bio-Rad, Hercules, CA). difluorid membrane so poliviniliden so pri 5% mleka blokiran v tris-pufrom /Tween 20 (TBST) 1 h. Primarna protitelesa anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) smo razredčili 1: 1000 v TBST /3% BSA /in membrane inkubiramo v primarnih protiteles pri 4 ° C preko noči. Membrane speremo trikrat v TBST za vsakih 10 minut. Anti-kunčje peroksidazo konjugirano sekundarna protitelesa (Santa Cruz) smo razredčili 1: 2000 v TBST in inkubiramo na membranah 1 h pri sobni temperaturi. Membrane smo sprali kot zgoraj in prikaže z SuperSignal West Pico kemiluminescenčni substrat (Pierce) po protokolu proizvajalca. Oceniti celično lokacijo RPRM bil imunofluorescenčni test izvedli. AGS celice začasno transfektirane s pCMV6-RPRM ali pCMV6 gojili na coverslips. Za prehodno transficirane AGS celice so bile določene v 4% paraformaldehida v 20 min pri sobni temperaturi in jo nato sprali trikrat fosfat-pufrom (PBS). Celice smo permeabiliziramo v 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) v 10 min, blokiran 3% BSA 1 uro pri sobni temperaturi, nato označeni s protitelesom anti-RPRM (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Po spiranju s PBS, smo celice inkubirali z Alexa Fluor 488-konjugiranega protitelesa (1: 200, Molecular sondo, Invitrogene) za 1 h pri sobni temperaturi. Slike so bile pridobljene z fluorescence lasersko skeniranje konfokalno mikroskopijo (glej dodatne informacije S1 in S2 sl).}

celične kulture in transfekciji

Za stabilne transfekcijskih poskusov, AGS celice zasadimo na 3x10 ^{5 celic /100 mm kultura kuhinjske in transfektirane po 24 urah z pCMV6-RPRM ali pCMV6 (Origene) prazen vektor z uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen), v skladu s protokolom proizvajalca. Oseminštirideset ur po transfekciji smo celice kultiviramo pod enakimi pogoji z G418 (500g /ml). Gojišča je spremenil vsakih 24 ur za 14 dni.}

kolonija tvorba vsebnosti

tvorbe kolonij testu smo 200 celice stabilno transficirane z pCMV6-RPRM ali pCMV6 nov vektor. Celice smo kultivirali v RPMI-1640 medij (Hyclone) in dopolnjen z 10% FBS. Gojišča je spremenil vsakih 24 ur. Kolonije smo obarvali s 0,4% kristal vijoličnim (Sigma) v 50% metanola, 21 dni po prvem sejanje in prešteti na 20 posnetkov, narejenih na podlagi obrnjenem mikroskopom (EVOS XL Core Cell slikanje sistem, Life Technologies). Vsak transfekciji smo izvedli v treh izvodih. Poleg tega so bile ponarejajo poskusi izvajajo za pridobitev dodatnih klonov za analizo izražanja.

Anchorage neodvisen test rast

Anchorage neodvisen rast celic smo analizirali s plošče, 1% Agarozo vsebuje 2x10 ^{5 celicah stabilno transficirane z pCMV6-RPRM ali pCMV6 nov vektor v 6 vdolbinami. Celice smo hranili tedensko ga prekriva svežo raztopino mehkega agarja in kolonije smo fotografirali po 4 tednih inkubacije. Poskus je bil izveden v treh izvodih.}

Statistična analiza

Spearman koeficient korelacije smo izračunali za analizo korelacije med RPRM metilacije in ravni izražanja genov. Kategorične spremenljivke smo analizirali s Pearson Chi-kvadrat test (obojestransko), je p-vrednost je bila popravljena z uporabo logistične regresijske analize. Neprekinjene spremenljivke smo analizirali s pomočjo študentskega t
test in podatke je bila izražena kot srednja vrednost ± SD. Kappa testu je bila uporabljena za analizo korelacije med izražanja RPRM in P73 izražanja. Statistične analize so bile izvedene s pomočjo SPSS verzija 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistični paket in GraphPad Prism5 programske opreme (La Jolla, CA, ZDA). Vse vrednosti so bile dva repa, razen Spearmanu rang korelacije. Statistična značilnost je bila opredeljena kot p < 0.05.

Rezultati

RPRM metilacija in izražanje v celičnih linijah raka želodca

Prej, mi in drugi so poročali, da se RPRM izraz mogoče obnoviti, ki jih demetiliranjem agenta 5-aza -2-deoksicitidin (glej dodatne informacije S3 in S4 sl) [5,8,18]. Vendar pa je bila RPRM metilacija šibko povezana z izrazom [18]. Nadalje oceniti povezavo med RPRM promotorja metilacije in izražanje genov, je popolna promotor regija RPRM gena analizirali z DNA bisulfita sekvenciranja v štirih GC celičnih linijah (AGS, snu-1, KATO III in NCI-N87) (slika 1A). Tako, smo analizirali stanje metilacija 52 CpG spletnih strani, ki se nahaja med -207 in +302 nukleotidov glede na začetnim mestom transkripcije (TSS). Ta analiza kaže gosto metilacije v celičnih linijah AGS in snu-1 (89,6% in 86%, v tem zaporedju), v primerjavi z KATO III in NCI-N87 (79,7% in 51,8%, v tem zaporedju) (p = 0,0002) (slika 1B) . Naslednji je nivo RPRM izražanja določen s kvantitativno RT-PCR. Nizka RPRM izražanje genov je bilo opaziti v letnem pregledu rasti in snu-1 v primerjavi z KATO III in celičnih linij NCI-N87 (p < 0,0001) (slika 1C). Z analizo korelacije Spearman je pokazala, je bila pomembna negativna korelacija je pokazala med gostoto metilacije in RPRM genske ekspresije (r = -1; p = 0,042) (Slika 1D). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da ima metilacija RPRM promotorski regiji pomembno vlogo pri uravnavanju RPRM izražanja.

RPRM metilacija in izražanje v želodčnih rakavih tkivih

Da, podpirajo prejšnje podatke v GC tkivih so bile stopnje metilacije RPRM določena v 6 parnih tumorskih in NTAM vzorcev. Rezultati kažejo višjo raven metilacije v tumorskih tkivih, v primerjavi z NTAM tkiv (glej slika 1E). Da bi raziskali izražanje RPRM genskega proteinskega produkta v GC tkivih je IHC analiza izvedena. Pozitivna RPRM izraz je v glavnem opaziti v citoplazmi epitelijskih celic želodca. RPRM gen izraz je bila odkrita pri 75% (15/20) z dne NTAM tkiv vzorcev. Vendar pa le 25% (20/05) vzorcev tumorjev pokazala izražanje RPRM gen proteinskega produkta (slika 2). Te razlike so bile zelo pomembne (p = 0,001) in predlaga, da se izraz RPRM izgubil v GC tkivih. Za oceno kliničnega pomena te izgube RPRM izražanja so ocenili kohorti 114 primerih GC. Izguba RPRM izražanja je bilo v 62% (71/114) primerov GC. Clinicopathological korelacije RPRM izražanja so prikazani v tabeli 1. napredovanje iz faze I GC do faze II-IV (p = 0,006) in na bezgavkah metastaze (p = 0,037) so statistično pomembno povezane z izgubo izražanja RPRM genskega proteinskega produkta. Vendar logistična regresijska analiza je pokazala, da je le napredovanje iz faze I do II-IV značilno povezana z izgubo RPRM gen proteinskega produkta (p = 0,020).

Funkcionalna vsebnosti RPRM raka želodca (nastanek kolonij in sidrišča -independent rast)

Kot izgubo RPRM izražanja je bila povezana v GC in predvsem z napredovanjem od stopnje I do II-IV, lahko tumor supresor vloga RPRM verjetna. Zato, funkcionalni poskusi, kot so in vitro
nastanek kolonij in testi rasti pritrdilne neodvisen smo izvedli v AGS celici transfektirana z pCMV6 /RPRM (slika 3A). Non-izražanje AGS celičnih linij transfektiranih s RPRM ekspresijskih plazmidov pokazala bistveno zmanjšano število kolonij v primerjavi z pCMV6- praznih-vektorsko transficirane celične linije transfektiranih s pCMV6 prazen vektor (p-0.05) (slika 3b). Učinek RPRM prekomerno rast pritrditve neodvisne mehko agar testu tvorbe kolonije smo ocenili tudi v stabilnih AGS celični liniji klonov transfekciji. Kolonije so bili prešteti po začetnem setev in inkubacijo v mehki agar 4 tedne. Celice transficirane s praznim vektorjem pokazala, robustno rast mikroorganizmov, po številu in velikosti kolonij. To se je močno zmanjšala, ko je bil RPRM ponovno izražena, v AGS celicah (slika 3c).

Združenje RPRM izražanja in p53 /P73 zaviralnih proteinov družine v želodčnem raku

RPRM je opredeljena kot a-p53 posredovano gen v embrionalnih fibroblastne celice [18]. Vendar pa so poročali, da lahko regulacija RPRM izražanja neodvisno od položaja p53 genski v živčnih celicah, obdelanih z bakrom [19]. Po drugi strani P73 mogoče aktivirati transkripcijo p53 odzivna genov [20]. Glede na to nastavitev, smo ocenili izražanje p53 in drugi člani družine p53 beljakovin, P73 ZTP. Izražanje p53 je bila nahaja v jedrih želodčne sluznice celic. Pozitivna p53 izraz je bila odkrita v 23,5% (20/114) primerov GC. Samo velikost tumorja je bila povezana z izražanjem p53 (p = 0,035 glej tabelo 2). Izražanje P73 je bila nahaja v jedrih celic in citoplazme epitelnih celic. Pozitivna P73 izraz je bilo v 30,6% (34/114) vzorcev GC. Zanimivo je, da so pomembne clinicopathological korelacije P73 izražanja povezana z invazivno fazi (faza I 55,6%, 10/18 do faze II-IV 25,8%, 24/93, p = 0,012) in na bezgavkah metastaze (p = 0,038) (tabela 2 ). Ker imajo izgube izražanja RPRM in P73 gen beljakovinskih izdelkov s podobnimi clinicopathological korelacije, smo ocenili povezavo med prijavo ravni obeh proteinov. V ta namen primerih smo razdelili v štiri skupine po izražanju RPRM in P73 beljakovinskih izdelkov. Analiza je pokazala, da je bilo 22 od 111 primerov GC pozitivna tako za RPRM in P73 beljakovin, medtem ko je bilo 57 od 111 negativen. To združenje je bila statistično značilna (p < 0,0001). Z kapa vrednosti 0.363 (tabela 3)

Pogovor

RPRM je zelo glikoziliran citoplazme protein, sprva opredeljena kot efektor nadaljnji p53 inducirano aretacija cikel celic v G2 /M. Prej, je bilo predlagano, da se RPRM zatrejo promotorja metilacije, čeprav je bilo šibko povezana z izrazom [5,8]. Poleg tega je bila RPRM predlagana kot domnevni tumorski supresor gena v karcinomom ledvičnih celic in hipofize tumorji [5,6]. V tej študiji smo dokazali, da je RPRM izražanje genov tesno povezano s statusom promotor regiji metilacijskega, kar kaže epigenetsko utišanje RPRM genske ekspresije. Poleg tega smo pokazali, da je bila RPRM gen proizvod se je v GC tkivu v primerjavi z noncancerous želodčne sluznice. Ti rezultati so podobni tistemu Luo sod
. [11], ki so poročali o izgubi RPRM v PK v primerjavi z vzorci želodčne razjede tkiva. Poleg tega je naša ugotovitev v zvezi z izgubo izražanja RPRM pri prehodu iz faze I do faze II-IV je klinično pomembna. Luo et al
. [11] poročali o podobnih ugotovitev, vendar v manjšem številu stopnji I GC primerov (n = 15). Te ugotovitve so lahko klinično pomembna kot napovedni dejavnik za napredovanje GC. V skladu s to izgubo RPRM izražanja v napredovanje GC, naših funkcionalnih testih (nastanek kolonij in pritrdišč neodvisen rast) predlagala tudi domnevnega tumor dušenje vlogo RPRM v PK.

Čeprav je p53 najprej opisali kot RPRM tuljava [10], klinične študije opravljene do datuma niso mogli potrditi takšno ugotovitev [6,18]. Tukaj smo ugotovili, da je izguba RPRM izražanja povezana z izgubo izražanja drugega člana p53 družine, P73. Čeprav je P73 TSG izražena na zelo nizki ravni, v normalnih človeških tkivih [21], ki je močno izraženi v različnih oblikah raka, kot so prsi, nevroblastoma, pljuč, požiralnika, želodca, debelega črevesa, mehurja in jajčnikov [14,22]. Poleg tega je bilo poročali, da lahko P73 aktivirati transkripcijo p53 odzivna genov, vključno p21Waf1 /Cip1, BAX, Mdm2, ciklin-G, gadd45 in IGFBP3 [20]. Tako, ki temelji na naših ugotovitvah, predlagamo, da bi se RPRM izraz ureja P73 v p53 neodvisen način.

Na kratko, naši podatki kažejo, da je epigenetsko utišanje RPRM gena, ki promotorja metilacije povezana z izgubo RPRM izraz in v skladu s tem, funkcionalne analize predlagala domnevnega tumor dušenje vlogo RPRM v GC. V kliničnih vzorcev, se RPRM izgubil na invazivnih fazah GC in njen izraz povezana s tisto P73, ki kažejo, da lahko drugi člani p53 gena družine sodelujejo pri urejanju RPRM izražanja. Nadaljnje raziskave je potrebna za opredelitev vloge RPRM v napredovanje GC in potrjevanje biološko ureditev RPRM s P73.

Podpora Informacije
S1 podatkov. . Podatki temelji študijo
doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s001
(ZIP)
S1 Sl. Učinki Tunicamicyn na RPRM beljakovin.
RPRM je zelo glikoziliranega citoplazme protein vizualizirali 25 kD z Western blot, Tunicamicin zaviralec glikozilacija (TK) premakne 25 kD RPRM pasu do 15 kD v AGS celice z RPRM prekomerno (pCMV6 /RPRM) (RPRM napovedal velikost 12 kD). Celice inkubiramo 24 ur pri RPMI1640 z 10% FBS v prisotnosti ali odsotnosti inhibitorja N-glikozilacijo tunicamicyn (10 ng /ml). RPRM izraz je bila določena z metodo Western blot uporabo protitelesa za RPRM poliklonalno (zgornjo ploščo, redčenje 1: 1000, Sigma-Aldrich). Izraz beta-aktina (spodnji plošči, redčenje 1: 2000, Santa Cruz) predstavlja beljakovin nakladanje
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s002
(IOD)
S2 Sl. Lokalizacija RPRM izražanja v prekomerno ekspresijo AGS celična linija imunofluorescenčni od RPRM v želodcu raka celične linije AGS transfektirana z pCMV6 vektor kodiranje RPRM.
24 ur po transfekciji celice so bile določene v paraformaldehid 4% in inkubirana z anti-RPRM-zajcev (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) in sekundarna protitelesa Alexa Fluor-488 (1: 200, Molekularna sonde, Invitrogene). Pozitiven izraz RPRM (GREEN) se kaže predvsem v citoplazmi. Slike so bile posnete pri uporabi Axio Vision4 večkanalno programsko opremo v fluorescenčni mikroskop Axio Scope.A1- Zeiss
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s003
(IOD)
S3 Sl. RPRM izraz je utišan s promotorsko metilacijo.
A) RT-PCR analizo RPRM mRNA izražanja AGS liniji želodčni rak celic z in brez DNA metilacijskega inhibitor 5-azacitidin (1 uM 72 ur). GAPDH smo uporabili kot kontrolo. B) Pomnoževanje RPRM s metilacije specifične PCR v AGS želodčni rak celične linije. Pomnoževanje metiliranega MYOD1 smo uporabili kot kontrolo. celično linijo AGS je metiliramo v promotorski regiji. NC: negativna kontrola
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s004
(IOD)
S4 Sl. RPRM izraz je utišan s promotorsko metilacijo (prvotna gelu).
A) RT-PCR analizi RPRM mRNA izražanja v AGS liniji želodčni rak celic z in brez DNA metilacijskega inhibitor 5-azacitidin (1 uM 72 ur). GAPDH smo uporabili kot kontrolo. B) Pomnoževanje RPRM s metilacije specifične PCR v AGS želodčni rak celične linije. Pomnoževanje metiliranega MYOD1 smo uporabili kot kontrolo. celično linijo AGS je metiliramo v promotorski regiji. NC:. Negativna kontrola
doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s005
(TIFF)

Priznanja

Radi bi se zahvalil Sabina Magedson za njen prispevek pri gradnji Tkivo Mikromreže. Prav tako bi se rad zahvalil Hiroshi Kawachi za histološki pregled primerov, Ignacio Wichmann za njihove dragocene pripombe o našem rokopisu in Oslando Padilla za njegovo pomembno podporo v statistično analizo.

• Plos ONE: Affinity Zorenje monoklonsko protitelo 1E11 s ciljnimi popačenosti v CDR3 regij optimizira Terapevtsko protitelo ciljanje na HER2-pozitivnega Rak želodca
• Plos ONE: Chrysin Zavira tumorje-Promotorski povzročena MMP-9 Expression z blokiranjem AP-1 preko zatiranju ERK in JNK Poti v želodcu raka celic