PLoS ONE: nuostoliai išraiškos Reprimo A p53 sukelta ląstelių ciklo arešto Gene, yra susijęs su Invazinių etapo naviko progresavimas ir P73 raiškos skrandžio vėžio

Anotacija

Reprimo (RPRM), tolesnis efektorinių p53 sukelta ląstelių ciklo suėmimo metu G2 /M, buvo pasiūlyta kaip spėjamas auglio slopinamojo geno (GTG) ir kaip potencialus biologinis žymuo dėl ne- skrandžio vėžiu (GC) invazinis aptikimas. Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti epigenetinius nutildymo iš RPRM geną promotoriaus metilinimo ir jos auglio slopinamojo funkcija GC ląstelių linijų. Be to, buvo ištirta klinikinė reikšmė RPRM baltymų produkto ir jo kartu su P53 /P73 navikas slopintuvas baltymų šeimai. Epigenetinius triukšmo slopinimo ir RPRM geną promotoriaus metilinimo buvo įvertintas keturiomis GC ląstelių linijų. Baltymų išraiška RPRM buvo įvertintas 20 naviko ir ne auglys atitiko atvejus. Klinikinė reikšmė RPRM kartu su P53 /P73 auglio slopinamojo baltymų šeimos buvo įvertintas 114 GC atvejais. Naviko slopintuvas funkcija buvo tiriama per funkciniai tyrimai. RPRM genų ekspresijos neigiamai koreliuoja su promotoriaus metilinimo (Spearman r = -1; p = 0,042). RPRM raiškos slopinamas kolonijų susidarymą ir tvirtinimo nepriklausomas augimą. Klinikinių mėginių, RPRM genas baltymo ekspresija buvo aptikta 75% (15/20) ne-naviko gretimo gleivinę, bet tik į 25% (5/20) skrandžio navikų audiniuose, (p = 0,001). Klinikos koreliacijos praradimo RPRM išraiškos buvo reikšmingai susijęs su GC invazinio etape (I etapas II-IV, p = 0,02), ir teigiamą ryšį tarp RPRM ir P73 genų baltymo produktas išraiškos buvo nustatyta, (p < 0,0001 ir kapa vertė = 0,363 ). Taigi, epigenetinius triukšmo slopinimo ir RPRM geną promotoriaus metilinimo yra susijusi su nuostolių RPRM išraiška. Funkciniai tyrimai rodo, kad RPRM elgiasi kaip GTG. Praradimas išraiška RPRM genų baltyminio produkto yra susijęs su invaziniam GC etape. Teigiamas ryšys tarp RPRM ir P73 išraiškos rodo, kad kiti nariai geną p53 šeimos gali dalyvauti RPRM raiškos reguliavimo

nurodomoji dalis:. Saavedra K Valbuena, J Olivares W Marchant MJ, Rodriguez, Torres- Estay V, ir kt. (2015) praradimas išraiškos Reprimo A p53 sukelta ląstelių ciklo arešto Gene, yra susijęs su Invazinių etapo naviko progresavimas ir P73 raiškos skrandžio vėžio. PLoS ONE 10 (5): e0125834. Doi: 10,1371 /journal.pone.0125834

Akademinė redaktorius: Mohammedas Soutto, Vanderbilt universiteto medicinos centras, JAV

Įstojo: Sausis 16, 2015 m Priėmė: Kovo 25, 2015 m Paskelbta 8 Gegužė 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Saavedra, et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jos pagalbinė informacija failus

finansavimas:.. Tai veikia parėmė dotacijos CONICYT-FONDECYTo1014 (AHC) ir CONICYT-FONDAP.130.011 (AHC ir JCR) iš Čilės Respublikos Vyriausybės

konkuruojančių interesų. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra trečioji pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių ir penktasis dauguma bendras piktybinių navikų pasaulyje [1]. Nepaisant mažėjančio dažnio GC, iš dalies dėl tam tikrų rizikos veiksnių (pvz Helicobacter pylori parsisiųsti ir aplinkos veiksniai), jis tebėra vienas iš labiausiai paplitusių vėžio visame pasaulyje ir toliau būti klinikinis iššūkis pripažinimo [2 , 3]. Skrandžio Kancerogeninis apima laipsnišką kaupimosi genetinių ir epigenetinių pokyčių, todėl disreguliacija į onkogenų bei navikų slopintuvas genų (GTG) išraiškos [4]. Reprimo (RPRM) yra nauja spėjamas GTG [5,6] ir susijęs su skrandžio kancerogenezėje [7]. Be to, mes pasiūlėme, kad metilo RPRM ląstelių nemokamai DNR gali būti potencialus biologinis už neinvaziniai GC aptikti [8,9].

RPRM yra labai glikuoto baltymų lokalizuota daugiausia citoplazmą ir buvo nustatyta, kad pasroviui efektoriaus p53-sukeltas ląstelių ciklo suėmimo esant G2 /M [10]. Ataskaitos rodo, kad RPRM išraiška reglamentuoja dviejų mechanizmų, vienas per DNR metilinimo jos promotoriaus regione [8], o kitą p53 keliu [10]. Tačiau naujesni tyrimai nebuvo galima patvirtinti šias išvadas [6]. Kita vertus, klinikinė reikšmė RPRM buvo prastai tiriamas [11]. Šiame tyrime mes įvertino DNR metilinimo vaidmenį RPRM išraiškos, jos klinikinė reikšmė ir jos kartu su nariais p53 naviko slopintuvas baltymų šeimos (pvz p53 ir P73) reguliavimas. Mes nustatėme, tankus metilinimas į RPRM promotoriaus regione, kuris buvo susijęs su nuostolių išraiška GC ląstelių linijų. Klinikinių atvejais, praradimas išraiškos buvo susijęs su invazijos etape GC. Be to, mes nustatėme teigiamą ryšį tarp išraiškos RPRM ir P73, o tai rodo, kad kiti nariai p53 geno šeima gali būti naujus kandidatus į RPRM raiškos reguliavimas.

metodų

Mobilaus ryšio linijų ir audinių mėginiai

Keturi GC ląstelių linijas (AGS, SNU-1, KATOIII ir NVI-N87) buvo nupirkta iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (ATCC) 2012 kultūringas gruodžio RPMI-1640 terpe (Hyclone) ir papildyta 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS) ir palaikoma 37 ° C, 5% CO _{2. Dvidešimt suderintos naviko ir ne naviko greta gleivinė (NTAM) mėginiai buvo atrinkti vertinimo RPRM išraiška. Šeši atrinkta vertinimo RPRM metilinimo. A 114 GC pacientų grupėje buvo atrinkti klinikos Koreliacija RPRM genų baltymų produktas. Audinių mėginiai atskirais atvejais buvo klasifikuojami vadovaujantis Japonijos mokslinių tyrimų draugijos skrandžio vėžys rekomendacijas [12]. Visi atvejai buvo įdarbinti iš Instituto Chileno Japonų de Enfermedades Digestivas-ligoninė CLINICO San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santjagas, Čilė tarp 1993-2000 [13] ir klinikos ypatybių yra parodyta 1 lentelėje Šis tyrimas buvo patvirtintas pagal institucinius peržiūros tarybose Pontificia Universidad Catolica de Čilė (Comité de ETICA Científico) ir ICHJED-HCSBA (Comité de ETICA Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Čilė). Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš kiekvieno dalyvaujančio tyrime dalyvis.}

Audinių Mikrogardelė ir imunohistocheminis

Audinių mikrogardelių (PMA) buvo daroma naudojant Rankinis Audinių masyvas II priemonę (Beecher priemones), kaip anksčiau aprašyta [14,15]. Pagrindiniai skyriai (4μm) buvo atliktas imunodažymu pagal Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), pagal gamintojo instrukcijas. Antikūnai naudojami šiame tyrime buvo RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (klonas 318-6-11, Dako Danija) ir P73 baltymo α (klonas 24, Novacastra). Rezultatai imunodažymu į visą naviko ir NTAM, taip pat TMA skyriuose buvo teigiami RPRM jei > 30% epitelinių ląstelių parodė, citoplazminio dažymo, > 10% branduolinės dažymas, p53, arba > 10% branduolinės /citoplazminės dažymas, P73 , Vertinimas imunohistocheminį dažymo buvo atliktas savarankiškai dviejų patologai (JV & GC). Kurie buvo apakinti klinikinių duomenų

bisulfite sekos ir kiekybinė PGR išraiška analizė

DNR iš GC ląstelių linijų buvo išgauti naudojant TRIzol reagento (Life Technologies) pagal gamintojo protokolą, po bisulfito konversijos naudojant EZ DNR metilinimo Gold komplektas (Zymo tyrimai). RPRM rengėjas buvo papildytas iš bisulfito gydytų DNR, naudojant pradmenis RPRM_B_FW 5'-TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 "ir RPRM_B_RV 5'-CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3", leidžianti 52 CpG svetainių aptikimą per 509-BP promotoriaus regione. PGR produktai buvo išvalytas su QIAXEN II gelis ištraukimo rinkinys (QIAGEN) ir susiūta į pGEM-T vektoriaus. Ligavimo prekė buvo naudojamas transformuoti kompetentingą E
. coli
top10 ląstelės, pagal aprašytą Inoue tvarka. [16]. Transformantai buvo atrinkti remiantis LB agaro lėkštelėse papildyti su ampicilino (100 mikrogramų /ml), X-Gal (50 mg /ml) ir IPTG (100 mM). Susidariusią baltą kolonijos buvo įvertintas kolonijų-PGR. Teigiami klonai buvo auginami skystoje terpėje (LB /ampicilino) iki vėlyvo eksponentinio etapą (OD600 = 1) ir DNR plazmidės buvo išgrynintas naudojant gryną Derlingumas minipreparatyvinė sistemos komplektas (PROMEGA). RPRM rengėjas regionas buvo sekos naudojant universalų M13 (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 "ir R. 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3") iki Macrogen (http://dna.macrogen.com). BIQ analizatorius programinė įranga buvo naudojama sekvenuotuose klonų analizės. Visi teigiami pGEM-T klonai buvo auginamos LB /ampicilino terpėje ir saugomi -80 ° C temperatūroje (14% glicerolio). Bendras RNR buvo išskirta naudojant TRIzol reagento (Invitrogen) ir kDNR buvo susintetintas naudojant iScript sintezei komplektas pagal gamintojo instrukcijas (BioRed). Vėliau, kDNR buvo naudojamas kiekvienam PGR reakcijos su kiekviena pradmenų porą. Kad RPRM specifinius pradmenis yra: RPRM_FW 5'-GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'ir RPRM_RV 5'-CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. Realaus laiko PGR analizė atlikta naudojant LIGHTCYCLER Greitas Pradėti DNR MasterPlus SYBR Green I (Roche) A LIGHTCYCLER 1.5 Realaus laiko aptikimo sistemos (Roche). Santykinis kiekybinė analizė normalizuojamas RPL-30 buvo atliktas per lyginamąjį ciklas slenksčio metodas [17]. RPL-30 specifinių pradmenų yra:. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 "ir RPL30_RV 5'-AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3"

įteisinimas RPRM antikūno immunoblot and IMUNOFLUORESCENCIJOS

3x10 ^{5 AGS ląstelės buvo laikinai perkeltų su pCMV6 /RPRM ar pCMV6 (Origene) tuščio vektorių, naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen), pagal gamintojo protokolą. Keturiasdešimt aštuonias valandas po to, kai transfekciją, ląstelės buvo inkubuojami 24 h į RPMI1640 su 10% FBS esant arba nesant N-glikozilinimo inhibitoriaus Tunicamicyn (10 ng /ml). Ląstelės buvo nukirsta ir sveikų ląstelių fragmentai buvo paimti naudojant Triton buferis (Tris-HCl, 50 mM pH7.5, NaCl, 0,1 M, 0,5% Triton X-100) su proteazių inhibitoriais Cocktail Kit (P8340, Sigma-Aldrich) ir fosfatazės inhibitorius Cocktail Kit ( SC-45045, Santa Cruz biotechnologijos). Baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant Quick Start Bradford reagento (Bio-Rad). Penkiasdešimt mikrogramų baltymo buvo atskirtos SDS-PAGE 4% iki 12%. Baltymai ant gelių buvo electroblotted į polivinilideno difluoridą membranų naudojant mini transblotter sistemą (Bio-Rad, Heraklis, Kalifornija). Į polivinilideno difluoridą membranos buvo užblokuotas 5% pieno tri-buferio druskų tirpalu /Tween 20 (TBST) 1 val. Pirminis antikūnas anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) buvo praskiestas 1: 1000 TBST /3% BSA /ir membranos buvo inkubuojamos pirminių antikūnų, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Membranos buvo plaunamos tris kartus TBST už kiekvieną 10 min. Anti-triušio peroksidazės-konjuguoto antrinis antikūnas (Santa Cruz) buvo praskiestas 1: 2000 TBST ir inkubuojami ant membranų 1 val kambario temperatūroje. Membranos buvo nuplauti, kaip nurodyta pirmiau, ir vizualizuoti naudojant SuperSignal Vakarų Pico cheminės liuminescencijos Substratas (Pierce) pagal gamintojo protokolą. Įvertinti ląstelių vietą RPRM, imunofluorescencinio tyrimas buvo atliktas. AGS ląstelės laikinai transfektuotose pCMV6-RPRM ar pCMV6 buvo auginami coverslips. Kad laikinai transfekuotos AGS ląstelės buvo nustatyta 4% paraformaldehido 20 min kambario temperatūroje, po to plaunamas tris kartus fosfatas-buferio druskų tirpalu (PBS). Ląstelės buvo padarytos laidžiomis 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 10 min, užblokuotas 3% BSA 1 val kambario temperatūroje, ir vėliau ženklinti su anti-RPRM antikūno (1: 1000, 38-50, sigma-Aldrich). Po plovimo su PBS, ląstelės buvo inkubuojamos su Alexa Fluor 488-konjuguoto antikūno (1: 200, molekulinė zondai, Invitrogene) už 1 h kambario temperatūroje. Vaizdai įsigijo fluorescencija skenavimo lazeriu confocal mikroskopijos (žr Pagalbinė informacija S1 ir S2 Figos).}

Mobilusis kultūra ir transfekcija

stabilių transfekcijos eksperimentų, AGS ląstelės buvo padengtas ne 3x10 ^{5 ląstelių /100 mm kultūra indą ir Transfekuoti po 24 h su pCMV6-RPRM ar pCMV6 (Origene) tuščio vektoriaus naudojant Lipofectamine 2000 (INVITROGEN), pagal gamintojo protokolą. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, ląstelės buvo auginamos tomis pačiomis sąlygomis su G418 (500g /ml). Kultūra žiniasklaida buvo keičiami kas 24 val 14 dienas.}

kolonija formavimas tyrimas

kolonija formavimosi tyrime, 200 ląstelės buvo stabiliai perkeltų su pCMV6-RPRM ar pCMV6 tuščias vektorių. Ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpėje (Hyclone) ir papildyti su 10% FBS. Kultūra žiniasklaida buvo pakeistas per 24 val. Kolonijos buvo dažomi 0,4% violetinei (sigma), 50% metanolio, 21 dienų po pradinio sėja ir skaičiuojami ne 20 paveikslų, kurių imtasi pagal apversto mikroskopu (Evos XL Core Mobilusis vizualizavimo sistema, Life Technologies "). Kiekvienas transfekcija buvo atliktas tris kartus. Be to, atkartoti eksperimentai buvo atliekami siekiant gauti tolesnes klonai už ekspresijos analizė.

Ankoridžas nepriklausomas augimo tyrimas

Ankoridžas nepriklausomas ląstelių augimas buvo analizuojami plating 1% agarozės, kuriame 2x10 ^{5 ląstelės stabili perkeltų su pCMV6-RPRM ar pCMV6 tuščias vektoriaus 6-duobučių lėkštelėse. Ląstelės buvo šeriami savaitę iki overlying šviežios minkštos agar sprendimą ir kolonijos buvo nufotografuoti po 4 savaičių inkubacijos. Eksperimentas buvo atliekamas tris kartus.}

Statistinė analizė

Ietininkas koreliacijos koeficientas buvo apskaičiuotas analizuoti tarp RPRM metilinimo ir genų ekspresijos lygio koreliaciją. Kategorinių kintamųjų buvo analizuojami Pearson Chi-kvadrato testas (dvipusis), P-vertė buvo pataisyta naudojant logistinę regresinę analizę. Ištisiniai kintamieji buvo analizuojami naudojant Stjudento T
testą ir duomenis buvo išreikštas vidurkis ± SD. Kappa testas buvo naudojamas analizuoti tarp RPRM saviraiškos ir P73 raiškos sąsajas. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SPSS versija 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistinį paketą ir GraphPad Prism5 programinę įrangą ( "La Jolla, CA, Jungtinės Valstijos). Visi vertybių buvo du-tailed, išskyrus Spearman koreliacijos. Statistinis reikšmingumas buvo apibrėžtas kaip "P < 0,05.

Rezultatai

RPRM metilinimas ir išraiška skrandžio vėžio ląstelių linijas

Anksčiau, mes ir kiti, pranešė, kad RPRM išraiška gali būti atkurta pagal demetilinimą agentas 5-aza -2-dezoksicitidino (Žr Pagalbinė informacija S3 ir S4 Figos) [5,8,18]. Tačiau RPRM metilinimas buvo silpnai koreliuoja su jo išraiškos [18]. Siekiant dar labiau įvertinti tarpusavio RPRM promotoriaus metilinimo ir genų ekspresijos asociaciją, pilnas rengėjas regionas RPRM geno buvo analizuojami DNR bisulfito sekos keturių GC ląstelių linijas (AGS, SNU-1, KATO III ir NVI-N87) (pav 1A). Taigi, buvo analizuojami metilinimo statusas 52 CpG svetainių, įsikūręs tarp -207 ir +302 nukleotidų, palyginti su transkripcijos starto svetainėje (TSS). Ši analizė rodo, tankus metilinimas ląstelių linijų AGS ir SNU-1 (89,6% ir 86% atitinkamai), palyginti su KATO III ir NVI-N87 (79,7% ir 51,8% atitinkamai) (p = 0,0002) (pav 1B) , Kitą, lygis RPRM išraiškos buvo nustatomas pagal kiekybinės RT-PGR. Žemas RPRM genų ekspresijos buvo pastebėtas AGS ir SNU-1, palyginti su KATO III ir NVI-N87 ląstelių linijas (p < 0,0001) (pav 1c). Iki Spearman koreliacijos analizė atskleidė, buvo nustatyta reikšminga neigiama koreliacija tarp metilinimo tankio ir RPRM genų ekspresiją (r = -1; p = 0,042) (pav 1D). Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad metilinimas RPRM promotoriaus regione vaidina lemiamą vaidmenį RPRM raiškos reguliavimas.

RPRM metilinimas ir išraiška skrandžio vėžio audiniuose

Jei patvirtina ankstesnius duomenis GC audinių , RPRM metilinimo lygis buvo nustatytas 6 suporuotas naviko ir NTAM pavyzdžius. Rezultatai rodo didesnes metilinimas lygį navikų audiniuose, palyginti su NTAM audinių (žr 1e). Ištirti RPRM genų baltymų produkto išraišką GC audinių IHC analizė buvo atlikta. Teigiamas RPRM išraiška buvo daugiausia pastebėta skrandžio epitelinių ląstelių citoplazmoje. RPRM genų baltymų ekspresija buvo aptikta 75% (15/20) apie NTAM audinių pavyzdžius. Tačiau tik 25% (20/05) naviko pavyzdžių nerodė, išraiška RPRM genas baltyminio produkto (2 pav). Šie skirtumai buvo labai reikšmingas (p = 0,001) ir rodo, kad išraiška RPRM prarandama GC audiniuose. Įvertinti klinikinę reikšmę šioje RPRM išraiškos netekimą įvertino 114 GC atvejais kohortos. Praradimas RPRM išraiška buvo nustatyta 62% (71/114) GC atvejais. Klinikos koreliacijos RPRM išraiškos rodomi 1 lentelė progresavimo nuo I etapo ir DC į etapus II-IV (p = 0,006) ir limfmazgių metastazių (p = 0,037) buvo reikšmingai susijęs su nuostolių išraiška RPRM genų baltymų produktas. Tačiau logistinės regresijos analizė rodo, kad tik ligos progresavimo nuo I etapo į II-IV yra reikšmingai susijęs su nuostolių RPRM genų baltymų produktas (p = 0,020).

Funkcinis kiekybinė analizė RPRM skrandžio vėžio (kolonija formavimo ir įtvirtinimo -independent augimas)

Kadangi RPRM išraiškos praradimo buvo siejamas GC ir daugiausia su progresavimo nuo I etapo į II-IV, navikas slopintuvas vaidmuo RPRM gali būti patikimas. Todėl, funkciniai tyrimai, pavyzdžiui, in vitro
kolonija formavimas ir tvirtinimo nepriklausomas augimo tyrimai buvo atliekami AGS ląstelių transfekuota pCMV6 /RPRM (pav 3a). Ne išreiškiančias, iš AgS ląstelių linijas, transfekuota su RPRM ekspresijos plazmidės, nustatyta gerokai sumažintą kolonijų skaičių, palyginti su pCMV6- tuščias vektorinę transfekuota ląstelių linijas, transfekuota su pCMV6-tuščias vektorius (p < 0,05) (pav 3b). Iš RPRM raiškos įtaka tvirtinimo nepriklausomas augimo minkštu agaro kolonija formavimosi tyrime taip pat buvo įvertintas stabiliomis perkeltų AGS ląstelių linija klonai. Kolonijos buvo skaičiuojami po pirminio Sėjamoji ir inkubacijos minkštos agaro 4 savaites. Ląstelės Transfekuoti su tuščiu vektoriaus parodė tvirtą kolonijų augimą, skaičiaus ir dydžio kolonijose.

asociacija RPRM saviraiškos ir p53 /P73 naviko slopintuvas baltymų šeimos skrandžio vėžio

RPRM buvo apibrėžiama kaip tai buvo labai sumažintas, kai RPRM vėl buvo išreikštas AGS ląstelių (pav 3c). p53-tarpininkaujant genas embrionini fibroblastus ląstelių [18]. Tačiau tai buvo pranešta, kad reguliavimas RPRM išraiška gali būti nepriklausoma nuo p53 geno statusą neuronų ląstelių gydomiems vario [19]. Kita vertus P73 galite aktyvuoti p53 reaguoja genų [20] transkripciją. Atsižvelgiant į šią nuostatą, mes įvertino p53 ir kitos nario p53 baltymų šeimos, P73 GTG išraiška. Išraiška p53 buvo įsikūrusi skrandžio gleivinės ląstelės branduolyje. Teigiamas p53 išraiška buvo aptiktas 23,5% (20/114) GC atvejais. Tik naviko dydis buvo susijęs su p53 išraiškos (p = 0,035, 2 lentelė). Išraiška P73 buvo įsikūrusi ląstelių branduolių ir citoplazmos epitelio ląstelių. Teigiamas P73 išraiška buvo rasta 30,6% (34/114) GC pavyzdžius. Įdomu tai, kad reikšmingi klinikos koreliacijos P73 išraiška buvo susiję su invazinės stadijos (I etapas 55,6%; 10/18 į etapus II-IV 25,8%; 24/93, p = 0,012) ir limfmazgių metastazių (p = 0,038) (2 lentelė ). Nuo nuostoliai išraiškos RPRM ir P73 genas baltymų produktų turi panašias klinikos koreliacijas, mes įvertino asociaciją tarp išraiškų lygių abiejų baltymų. Šiuo tikslu bylos buvo suskirstyti į keturias grupes pagal RPRM ir P73 baltymų produktų išraiška. Analizė parodė, kad 22 iš 111 GC atvejais buvo teigiami abiems RPRM ir P73 baltymų, o 57 iš 111 buvo neigiami. Ši asociacija buvo statistiškai reikšmingas (p < 0,0001). Su kappa vertės 0,363 (3 lentelė)

Aptarimas

RPRM yra labai glikozilintas citoplazminės baltymų, iš anksto nustatyti, kaip tolesnis efektoriaus p53 indukuotų ląstelės ciklo arešto metu G2 /M. Anksčiau, buvo pasiūlyta, kad RPRM yra nutildyti promotoriaus metilinimo, nors ir buvo silpnai koreliuoja su savo išraiška [5,8]. Be to, RPRM buvo pasiūlyta kaip spėjamame naviko slopinamojo geno inkstų ląstelių karcinoma ir hipofizės navikais [5,6]. Šiame tyrime mes parodė, kad RPRM genų ekspresija yra stipriai susijęs su jo rengėjas regionas metilinimo statuso, o tai rodo epigenetinius nutildymo iš RPRM genų ekspresiją. Be to, mes rodo, kad RPRM genas baltymo produktas buvo sumažintas į GC audinio, lyginant su noncancerous skrandžio gleivinės. Šie rezultatai panašus į Luo ir kt pervežimas. [11], kuris pranešė, praradimą RPRM GC, kai, palyginti su skrandžio opa audinių mėginių. Be to, mūsų išvada dėl praradimo išraiška RPRM pereinant iš I etapo į II-IV stadijų yra kliniškai reikšmingas. Lo, ir kt
. [11] pranešė apie panašią išvadą, tačiau nedaugelyje I etapo GC atvejus (n = 15). Šie rezultatai gali turėti klinikinės reikšmės, kaip prognozavimo veiksnys dėl GC progresavimą. Todėl su šiuo RPRM išraiškos praradimo GC progresavimo, mūsų funkciniai tyrimai (kolonija formavimo ir tvirtinimo nepriklausomas augimas) taip pat pasiūlė spėjamą auglio slopinamojo vaidmenį RPRM GC.

Nors p53 pradžių buvo aprašyta kaip RPRM induktoriaus [10], klinikiniai tyrimai atliekami iki šiol nesugebėjo patvirtinti tokią išvadą [6,18]. Čia mes nustatyta, kad nuostoliai RPRM išraiškos koreliuoja su praradimo išraiška kitos p53 šeimos, P73 narys. Nors P73 GTG išreiškiamas labai žemo lygio normaliomis žmogaus audinių [21], ekspresija įvairiais žmogaus vėžio, pavyzdžiui, krūties, neuroblastoma, plaučių, stemplės, skrandžio, storosios žarnos, pūslės ir kiaušidžių [14,22]. Be to, buvo pranešta, kad P73 galite aktyvuoti p53 reaguoja genų, įskaitant p21Waf1 /CIP1, Bax, MDM2, ciklino-G, GADD45 ir IGFBP3 [20] transkripciją. Taigi, remiantis mūsų duomenimis, mes siūlome, kad RPRM išraiška gali būti reguliuojamas P73 A p53-nepriklausomai.

Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad epigenetinius triukšmo slopinimo ir RPRM geną promotoriaus metilinimo yra susijusi su nuostolių RPRM išraiška ir, atitinkamai, funkciniai tyrimai pasiūlė spėjamą auglio slopinamojo vaidmenį RPRM GC. Klinikinių mėginių RPRM prarandamas invazinių etapuose GC ir jos išraiška koreliuoja su ta P73, rodančių, kad kiti nariai p53 geno šeima gali dalyvauti RPRM raiškos reguliavimas. Tolesni tyrimai yra garantuotai apibūdinti RPRM vaidmenį GC progresavimo ir patvirtinti biologinę reguliavimą RPRM iki P73.

Pagalbinė informacija
S1 duomenų. . Pagrindžiančių duomenų tyrimą
Doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s001
(zip)
S1 pav. Poveikis Tunicamicyn apie RPRM baltymų.
RPRM yra labai glikuoto citoplazmos baltymų ryškinamos 25 kD pagal Vakarų dėmė, glikozilinimo inhibitorius tunicamycin (TK) išstumia 25 kDa RPRM juostos 15 kD į AGS ląstelių su RPRM raiškos (pCMV6 /RPRM) (RPRM prognozavo 12 dydis kd). Ląstelės buvo inkubuojami 24 h į RPMI1640 su 10% FBS esant arba nesant N-glikozilinimo tunicamicyn inhibitoriumi (10 ng /ml). RPRM išraiška buvo nustatomas pagal Vakarų blotingo metodu, naudojant RPRM polikloninio antikūno (viršutinis panelis, praskiestas santykiu 1: 1000, Sigma-Aldrich). Iš beta-aktino (apatiniame skydelyje, skiedimas 1: 2000, Santa Cruz) išraiška yra baltymų pakrovimo
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s002
(TIF)
S2 pav. Lokalizacijos RPRM išraiška ekspresija AGS ląstelių linijos IMUNOFLUORESCENCIJOS iš RPRM skrandžio vėžio AGS ląstelių, į pCMV6 vektorius kodavimo RPRM.
24 h po transfekciją ląstelės buvo nustatyta paraformaldehidus 4% ir inkubuojami su anti-RPRM-triušis (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) ir antrinė antikūnų Alexa Fluor-488 (1: 200, molekuliniai zondai, Invitrogene). Teigiamas išraiška RPRM (žalias) yra daugiausia matyti citoplazmoje. Vaizdai buvo fiksuojami naudojant AXIO Vision4 daugiakanalį programinę įrangą fluorescencijos mikroskopijos AXIO Scope.A1- Zeiss
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s003
(TIF)
S3 pav. RPRM išraiška nutildyti promotoriaus metilinimo.
A), AT-PGR analizė RPRM iRNR raiškos AGS skrandžio vėžio ląstelių linijos su ir be DNR metilinimo inhibitorių 5-azacitidinas (1 ŪM 72 val). GAPDH buvo naudojamas kaip kontrolės. B), stiprinimas iš RPRM metilinimo specialiosios PGR AGS skrandžio vėžio ląstelių linija. Amplifikacija Metilinto MYOD1 buvo naudojamas kaip kontrolės. AGS ląstelių linija buvo metilinti promotoriaus regione. NC: neigiamos kontrolės
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s004
(TIF)
S4 pav. RPRM išraiška nutildyti promotoriaus metilinimo (originalus gelio).
A) RT-PGR analizės RPRM iRNR išraiškos AGS skrandžio vėžio ląstelių linijos su ir be DNR metilinimo inhibitorių 5-azacitidinas (1 ŪM 72 val). GAPDH buvo naudojamas kaip kontrolės. B), stiprinimas iš RPRM metilinimo specialiosios PGR AGS skrandžio vėžio ląstelių linija. Amplifikacija Metilinto MYOD1 buvo naudojamas kaip kontrolės. AGS ląstelių linija buvo metilinti promotoriaus regione. NC:. Neigiamos kontrolės
Doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s005
(TIFF)

Padėka

Mes norėtume padėkoti Sabina Magedson už jos indėlį į pastatų audinių Mikrogardelių. Mes taip pat norėtume padėkoti Hiroshi Kawachi histologinei peržiūros atvejų Ignacio Wichmann savo vertingas pastabas apie mūsų rankraščio Oslando Padilla už jo svarbų paramos statistinės analizės.

• PLoS ONE: Affinity subrendimas monokloninis antikūnas 1E11 tikslinėmis tikimybių į CDR3 Regionų Optimizuoja Terapinis antikūnas Taikymo HER2 teigiamas skrandžio vėžio
• PLoS ONE: Chrysin slopina auglio Promoter sukeltos MMP-9 raiška blokuoja AP-1 per slopinimas ERK ir JNK kelius skrandžio vėžys Cells