PLoS One: elvesztése kifejezése Reprimo, a p53-indukálta sejtciklusmegállás Gene korrelál az invazív Stage tumor progressziójának és p73-expresszió Gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

Reprimo (RPRM), a downstream effek p53 indukálta sejtciklus G2 /M, már javasolták a feltételezett tumor szuppresszor gén (TSG), és mint potenciális biomarker nem invazív kimutatására gyomorrák (GC). A vizsgálat célja az volt, hogy értékelje a epigenetikai elnémítása RPRM gén promoter metiláció és tumor szupresszor funkciót GC sejtvonalak. Továbbá klinikai jelentősége RPRM protein termék és annak kapcsolata a p53 /p73 tumor szupresszor fehérje család tárni. Epigenetikus csendesítése RPRM gén promoter metiláció értékelték négy GC sejtvonalak. Protein expresszióját RPRM értékelték 20 tumor és nem-tumor párosított esetben. A klinikai jelentősége RPRM társulás p53 /p73 tumor szupresszor fehérje család értékelték 114 GC esetekben. A tumor szuppresszor funkció vizsgáltuk át funkcionális vizsgálatok. RPRM génexpresszió negatívan korrelált a promoter metiláció (Spearman rang r = -1; p = 0,042). RPRM overexpressziója gátolta kolónia képződését és rögzítéstől független növekedését. Klinikai mintákban, RPRM gén fehérje expresszióját volt kimutatható 75% -os (15/20) nem-tumor szomszédos nyálkahártya, de csak 25% -os (5/20) a gyomor tumor szövetekben (p = 0,001). Klinikopatológiai összefüggések elvesztése RPRM expresszió szignifikánsan járó invazív szakaszában GC (I-től a II-IV, p = 0,02), és pozitív összefüggést a RPRM és p73 gén fehérje termék expressziót találtunk (p < 0,0001 és kappa érték = 0,363 ). Összefoglalva, epigenetikus csendesítése RPRM gén promoter metiláció társul elvesztése RPRM kifejezés. Funkcionális vizsgálatok arra utalnak, hogy RPRM viselkedik TSG. Expressziójának elvesztése a RPRM gén protein termék társított invazív szakaszában GC. Közötti pozitív kapcsolat RPRM és p73 expresszió arra utalnak, hogy a többi tag a p53 gén család részt vehet szabályozásának RPRM kifejezés. Katalógusa

Citation: Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ Rodríguez A, Torres- Estay V, et al. (2015) elvesztése kifejezése Reprimo, a p53-indukálta sejtciklusmegállás Gene korrelál az invazív Stage tumor progressziójának és p73 expressziója gyomorrákban. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10,1371 /journal.pone.0125834 katalógusa

Akadémiai Kiadó: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: január 16, 2015; Elfogadva: március 25, 2015; Megjelent: május 8, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Saavedra et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: a munkálatok támogatták CONICYT-FONDECYTo1014 (AHC) és CONICYT-FONDAP—30011 (AHC és JCR) a chilei kormány.

Érdekütközés: a szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

a gyomorrák (GC) a harmadik vezető oka a rák okozta halál és az ötödik legnagyobb közös rosszindulatú daganat világszerte [1]. Annak ellenére, hogy a csökkenő előfordulási GC, részben az a felismerés bizonyos kockázati tényezők (pl Helicobacter pylori katalógusa és a környezeti tényezők), továbbra is az egyik leggyakoribb rákos világszerte, és továbbra is a klinikai kihívást [2 , 3]. Gyomor karcinogenezis magában foglalja a fokozatos felhalmozódása a genetikai és epigenetikai változások, ami a diszreguláció az onkogének expressziója és a tumor szuppresszor gének (HKT) [4]. Reprimo (RPRM) egy újszerű feltételezett TSG [5,6] és a kapcsolódó gyomor karcinogenezis [7]. Továbbá javasoltuk, hogy metilezett RPRM sejtmentes DNS lehet egy potenciális biomarker a nem invazív kimutatására GC [8,9].

RPRM egy erősen glikozilált fehérje lokalizálódik túlnyomórészt a citoplazmában, és már azonosították downstream effektor p53 indukálta sejtciklus G2 /M [10]. A jelentések szerint a RPRM expresszióját szabályozza két mechanizmus, az egyik a DNS metiláció a promoter régió [8], a másik a p53 [10]. Azonban az újabb vizsgálatok nem tudták megerősíteni ezeket a megállapításokat. [6] Másrészt, a klinikai jelentősége RPRM már kevéssé tanulmányozott [11]. A jelen tanulmányban megvizsgáltuk a szerepe a DNS metiláció szabályozásában RPRM kifejezést, a klinikai jelentősége és egyesülete tagjai a p53 tumor szupresszor fehérje család (azaz p53 és p73). Azt találtuk, sűrű metilezés a RPRM promotor régió, amely társult expressziójának elvesztése GC sejtvonalakban. A klinikai esetek, expressziójának elvesztése járt a invazivitását szakaszában GC. Továbbá megfigyeltük közötti pozitív kapcsolat kifejezése RPRM és p73, ami arra utal, hogy más tagjai a p53 gén család lehet új jelöltek szabályozása RPRM kifejezés. Katalógusa

Módszerek katalógusa

Sejtvonalak és a szövetmintákat

Négy GC sejtvonalak (AGS, SNU-1, KATOIII és NCI-N87) vásároltunk a American Type Culture Collection (ATCC) 2012. decemberi RPMI-1640 közegben (Hyclone) és kiegészített 10% magzati borjúszérumot (FBS) és 37 ° C-on, 5% CO _{2. Húsz párosított tumor és nem-tumor szomszédos mucosa (NTAM) mintákat kiválasztott értékelési RPRM kifejezés. Hat választottak értékelési RPRM metiláció. A kohorsz 114 GC betegek kiválasztott klinikopatológiai összefüggéseit RPRM gén fehérje termék. Szövetminta egyedi esetekben sorolták szerint a japán Research Society gyomorrák ajánlások [12]. Minden esetben vettek fel az Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital Clínico San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago, Chile között 1993-2000 [13] klinikopatológiai jellemzők 1. táblázatban mutatjuk be Ez a tanulmány által jóváhagyott intézményi felülvizsgálata alaplapok Pontificia Katolikus Egyetem Chile (Comité de Etica Científico) és ICHJED-HCSBA (Comité de Etica Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chile). Írásos beleegyezését adta a minden résztvevő vett részt a tanulmányban. Katalógusa}

Tissue microarray és immunhisztokémiai katalógusa

Tissue microarray (TMA) is történhet a kézi Tissue Array II eszköz (Beecher Instruments), mint korábban leírt [14,15]. Core szakaszok (4μm) vetettük alá immunfestés által Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs) szerint a gyártó utasításai szerint. Antitestek ebben a vizsgálatban alkalmazott voltak RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (klón 318-6-11, Dako Dánia) és P73 fehérje α (24. klón, Novacastra). Eredményei immunfestés teljes tumor és NTAM valamint TMA metszeteket tekinthető pozitívnak RPRM ha > 30% hámsejtek mutatott citoplazmatikus festődés, > 10% nukleáris festődést p53, vagy > 10% nukleáris /citoplazmatikus festődés a P73 . Értékelése immunhisztokémiai festést végeztünk függetlenül két patológusok (JV & GC), akik nem ismerték a klinikai adatokat.

Bisulfite szekvenálással és kvantitatív RT-PCR-expressziós analízis

származó DNS GC sejtvonal volt extraháljuk TRIzol reagenssel (Life Technologies) szerint gyártó protokollja, majd a hidrogén-szulfit átalakítás segítségével az EZ DNS metiláció arany készlet (Zymo Research). RPRM promotert amplifikáltuk biszulfittal kezeit DNS primerek felhasználásával RPRM_B_FW 5'-TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'és RPRM_B_RV 5'-CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', amely lehetővé teszi a kimutatására 52 CpG helyek egy 509-bp-os promoter régióban. A PCR-termékeket tisztítjuk QIAXEN II Gel Extraction Kit (QIAGEN) és ligáltuk pGEM-T-vektorba. A ligálási terméket használjuk kompetens E katalógusa. coli
Top10 sejtek eljárás szerint által leírt Inoue et al. [16]. A transzformánsokat szelektáltunk LB agar lemezeken ampicillinnel kiegészített (100 ng /ml), X-Gal-t (50 mg /ml) és IPTG-t (100 mM). A kapott fehér kolóniákat értékelte kolónia-PCR-rel. A pozitív klónokat növesztünk folyékony tápközegben (LB /ampicillin) késő exponenciális fázisban (OD600 = 1) és a DNS-plazmidokat tisztítjuk Pure Hozam miniprep rendszer készlet (Promega). A RPRM promoter régiót szekvenáltuk univerzális M13 (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'és az RV 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') által Macrogen (http://dna.macrogen.com). BIQ Analyzer szoftver használtuk az elemzéshez szekvenált klónok. Minden pozitív pGEM-T-klónokat növesztünk LB /ampicillin tápközegben és -80 ° C közötti hőmérsékleten (14% glicerin). Teljes RNS-t extraháltunk TRIzol reagenssel (Invitrogen), és a cDNS-t szintetizálunk iScript cDNA Synthesis Kit, a gyártó utasításai szerint (Biorad). Ezt követően a cDNS-t használunk minden egyes PCR-reakcióban az egyes primer párral. A RPRM specifikus primerek: RPRM_FW 5'-GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'és RPRM_RV 5'-CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. Valós idejű RT-PCR analízis alkalmazásával végeztük LightCycler Fast Start DNS MasterPlus SYBR Green I (Roche) egy LightCycIer 1,5 Real-Time Detection System (Roche). Relatív kvantitatív elemzés normalizált RPL-30 keresztül folytatták az összehasonlító ciklus küszöb módszer [17]. Az RPL-30 specifikus primerek: RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'és 5' RPL30_RV AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3 '. Katalógusa

validálása RPRM antitest Immunoblot és Immunfluoreszcenciás katalógusa

3x10 ^{5 AGS sejteket tranziensen transzfektáltunk pCMV6 /RPRM vagy pCMV6 (OriGene) üres vektor, Lipofectamine 2000 (Invitrogen), a gyártó utasításai szerint protokollt. Negyvennyolc órával a transzfekciót követően, a sejteket 24 órán át inkubáltuk RPMI1640 10% FBS jelenlétében vagy távollétében N-glikozilációs inhibitor Tunicamicyn (10 ng /ml). A sejteket összegyűjtöttük, és teljes sejt lizátumokat extraháljuk Triton pufferrel (Tris-HCI 50 mM pH = 7,5, NaCl 0,1 M, 0,5% Triton X-100) proteázgátlóval Cocktail Kit (P8340, Sigma Aldrich) és foszfatáz-gátló Cocktail Kit ( sc-45045, santa Cruz Biotechnology). A protein koncentrációt határoztuk meg Quick Start Bradford reagens (Bio-Rad). Ötven ug fehérjét SDS-PAGE-4% és 12%. Fehérjék A géleket elektroblottoltuk polivinilidén-difluorid membránokra a Mini transblotter rendszer (Bio-Rad, Hercules, CA). A polivinilidén-difluorid membránokat blokkoltuk 5% tejjel Tris-pufferolt sóoldat /Tween 20-at (TBST) 1 órán át. Primer antitest anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) adtunk 1: 1000 hígítás TBST /3% BSA /és a membránokat inkubáltuk primer antitestekkel át 4 ° C-on egy éjszakán át. A membránokat háromszor mossuk TBST-ben 10 percig minden egyes. Anti-nyúl peroxidáz-konjugált másodlagos antitesttel (Santa Cruz) hígítjuk 1: 2000 hígítás TBST-vel, és inkubáltuk a membránokat 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A membránokat mostuk, mint fent, és láthatóvá tettük segítségével SuperSignal West Pico kemilumineszcens szubsztrátot (Pierce) alkalmazásával a gyártó protokollja. Értékelni a celluláris helyét RPRM, immunfluoreszcencia vizsgálatot végeztünk. AGS sejteket tranziensen transzfektáltunk pCMV6-RPRM vagy pCMV6 növesztettük fedőlemezen. A tranziensen transzfektált AGS sejteket fixáltuk 4% paraformaldehiddel 20 percig szobahőmérsékleten, majd háromszor mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). A sejteket permeabilizáltuk 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich), 10 percig, blokkoltuk 3% BSA-t 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, és ezt követően jelölt anti-RPRM antitestet (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Mosás után PBS-sel a sejteket inkubáltuk Alexa Fluor 488-konjugált antitestet (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A képeket fluoreszcens pásztázó lézer konfokális mikroszkópia (lásd alátámasztó információk S1 és S2 ábra). Katalógusa}

Sejttenyésztés és transzfekció katalógusa

A stabil transzfekciós kísérletekhez AGS sejteket a 3x10 ^{5 sejt /100 mm-es Petri-csészére, és transzfektáltuk 24 óra után a pCMV6-RPRM vagy pCMV6 (OriGene) üres vektorral Lipofectamine 2000 (Invitrogen) szerint a gyártó protokollja. Negyvennyolc órával a transzfekciót követően, a sejteket tenyésztjük azonos körülmények között a G418-at (500 g /ml). Táptalajok lecseréltük minden 24 óra 14 napon át.}

telepképző assay

telepképző assay, 200 sejteket stabilan transzfektáltunk pCMV6-RPRM vagy pCMV6 üres vektor. A sejteket RPMI-1640 tápközegben (Hyclone) és kiegészítve 10% FBS-sel. A tápoldatot lecseréltük minden 24 óra. A telepeket megfestjük 0,4% kristályibolya (Sigma) 50% metanol, 21 nap után a kezdeti beoltás és megszámoltuk a 20 képek alapján hozott invertált mikroszkóp (Evos XL Core Cell Imaging System, Life Technologies). Mindegyik transzfekciót végeztünk három példányban. Ezen túlmenően, replikálni kísérleteket végeztünk, így további klónok expresszióját elemzés.

rögzítéstől független növekedési vizsgálat

rögzítéstől független sejtnövekedés analizáltuk plating 1% agarózt tartalmazó 2x10 ^{5 sejtek stabil transzfektált pCMV6-RPRM vagy pCMV6 üres vektort 6 lyukú lemezeken. A sejteket táplálja hetente fedő friss lágy-agar-oldatot, és a telepeket fényképezett után 4 hetes inkubálás. A kísérletet három párhuzamossal végezzük.}

Statisztikai elemzés

Spearman korrelációs koefficiens számolható, hogy elemezze a korreláció RPRM metiláció és génexpresszió szintjét. A kategorikus változókat elemeztük Pearson Chi-négyzet teszt (kétoldalas), a p-érték korrigálni logisztikus regressziós analízis. A folytonos változókat analizáltuk a Student-féle T
teszt és adatokat átlag ± SD. Kappa tesztet használják, hogy elemezzék az összefüggést a RPRM kifejezés és p73 expresszió. A statisztikai elemzéseket SPSS 17.0 verzióját (SPSS Inc., Chicago, IL) statisztikai csomagot és GraphPad Prism5 szoftver (La Jolla, CA, Egyesült Államok). Minden érték kétoldalas volt, kivéve a Spearman rank korreláció. A statisztikai szignifikancia meghatározása p < 0.05.

Eredmények katalógusa

RPRM metiláció és a véleménynyilvánítás gyomorrák sejtvonalakon

Korábban mi és mások arról számoltak be, hogy a RPRM kifejezés lehet visszaállítani a demetilációs agent 5-aza -2-dezoxicitidin (Lásd alátámasztó információk S3 és S4 ábra) [5,8,18]. Azonban RPRM metiláció már gyengén korrelál expresszióját [18]. További értékelése közötti összefüggés RPRM promoter metiláció és génexpresszió, a teljes promoter régióját RPRM gén elemezzük DNS biszulfit szekvenálás négy GC sejtvonal (AGS, SNU-1, KATO III és az NCI-N87) (1A ábra). Így a metilációs állapotát 52 CpG helyek között helyezkedik -207 és 302 nukleotid képest a transzkripciós starthelyet (TSS), elemezték. Ez az elemzés azt mutatja, sűrű metilezés sejtvonalakban AGS és SNU-1 (89,6%, illetve 86% -kal), összehasonlítva a KATO III és az NCI-N87 (79,7%, illetve 51,8% -kal) (p = 0,0002) (1B ábra) . Ezután szintje RPRM expresszióját határoztuk meg kvantitatív RT-PCR-rel. Alacsony RPRM génexpresszió volt megfigyelhető a AGS és SNU-1 összehasonlítva KATO III és NCI-N87 sejtvonalak (p < 0,0001) (ábra 1C). Spearman-féle korrelációs analízis szignifikáns negatív korrelációt találtunk a metilációs sűrűség és RPRM génexpresszió (r = 1; p = 0,042) (1d). Együttesen ezek az eredmények arra utalnak, hogy a metilációs RPRM promoter régió kritikus szerepet játszik a szabályozásában RPRM kifejezés. Katalógusa

RPRM metiláció és a véleménynyilvánítás gyomorrákban szövetek katalógusa

megerősítik korábbi adat GC szövetekben , RPRM metilációs szinteket határoztuk meg 6 párosított tumor és NTAM mintákban. Az eredmények azt mutatják magasabb metilációs szintje daganatszöveteken képest NTAM szövetekben (Lásd 1E). Annak vizsgálatára, a kifejezés a RPRM gén protein termék GC szövetekben IHC analízist végeztünk. Pozitív RPRM kifejezés elsősorban megfigyelhető citoplazmájában gyomor hámsejtek. RPRM gén fehérje expressziót mutattunk ki 75% (15/20) az NTAM szövetek mintákban. Azonban csak 25% (20/05) tumor minták expresszióját mutatta RPRM gén protein termék (2. ábra). Ezek a különbségek erősen szignifikánsak voltak (p = 0,001), és arra utalnak, hogy expressziója RPRM elvész GC szövetekben. Értékelni a klinikai jelentősége veszteség RPRM kifejezés egy kohorsz 114 GC esetben értékeltük. Elvesztése RPRM expressziót találtunk 62% (71/114) a GC esetben. Klinikopatológiai összefüggéseit RPRM expresszió 1. táblázatban mutatjuk be Progression I. stádiumú GC szakaszok II-IV (p = 0,006) és a nyirokcsomó-metasztázis (p = 0,037) szignifikánsan elvesztésével jár expressziójának RPRM gén fehérje termék. Azonban logisztikus regressziós elemzés azt mutatja, hogy csak a progresszió a színpadon I-II-IV jelentősen elvesztésével jár RPRM gén protein termék (p = 0,020). Katalógusa

Funkcionális vizsgálat szerint RPRM gyomorrákban (telep kialakulása és rögzítési -független növekedés)

Mivel a veszteség a RPRM expresszió társult GC és főleg a progresszió I. stádiumú, hogy a II-IV, egy tumor szuppresszor szerepe RPRM lehet elfogadható. Ezért funkcionális vizsgálatok például in vitro
kolónia képződését és rögzítéstől független növekedését vizsgálatokat végeztünk AGS transzfektált pCMV6 /RPRM (3A ábra). Nem expresszáló AGS sejtvonalak transzfektált RPRM expressziós plazmidokkal szignifikánsan csökkent a telepek számát összehasonlítva pCMV6- üres vektorral transzfektált sejtvonalak transzfektált pCMV6-üres vektorral (p < 0,05) (3B ábra). A hatás a RPRM túlexpresszió rögzítéstől független növekedését lágy agar telepképző assay-ben is értékelték stabil transzfektált AGS sejtvonal klónok. Telepeket megszámoltuk után a kezdeti beoltás és inkubációs lágy-agarban, 4 héten át. A sejteket transzfektáltuk üres vektorral mutatta, robusztus telepnövekedés, által száma és mérete telepeket. Ez nagyban csökkent, ha RPRM újra kifejezve AGS sejtek (3C). Katalógusa

Szövetsége RPRM kifejezés és a p53 /p73 tumor szupresszor fehérje család gyomorrákban katalógusa

RPRM lett definiálva p53-közvetített gén embrionális fibroblaszt sejtekben [18]. Azonban azt is leírták, hogy a szabályozása RPRM expresszió lehet, független a p53 gén állapotát neuronális sejtekben kezelt réz [19]. Másrészt a P73 aktiválhatja a transzkripcióját p53-reszponzív gének [20]. Figyelembe véve ezt a beállítást, megvizsgáltuk a p53-expresszió és a többi tagja a p53 fehérje család, p73 TSG. A p53 expressziója volt található, a magok a gyomornyálkahártya-sejtek. Pozitív p53 expresszió volt kimutatható 23,5% (20/114) a GC esetben. Csak tumor méretét expressziójával kapcsolatos p53 (p = 0,035, lásd 2. táblázat). Expressziója P73 volt található, a sejtmagok és a citoplazma a hámsejtek. Pozitív P73 expressziót találtunk 30,6% (34/114) a GC mintákon. Érdekes, hogy jelentős klinikopatológiai összefüggéseit p73 expresszió kapcsolatos invazív stádium (I szakasz 55,6%; 10/18 szakaszainak II-IV 25,8%; 24/93, p = 0,012), és a nyirokcsomó-áttétek (p = 0,038) (2. táblázat ). Mivel veszteség kifejezése RPRM és p73 gén fehérje termék hasonló klinikopatológiai összefüggéseket értékeltük közötti társulás kifejezései szintek mindkét fehérje. Ebből a célból az esetekben elválasztjuk négy csoportba szerint a kifejezés a RPRM és P73 fehérje termék. Az elemzés azt mutatta, hogy 22 ki 111 GC esetben volt pozitív mindkét RPRM és P73 fehérjéket, míg a 57 ki 111 negatív volt. Ez az összefüggés statisztikailag szignifikáns volt (p < 0,0001) egy kappa értéke 0,363 (3. táblázat).

Discussion

RPRM egy erősen glikozilált citoplazmatikus fehérje, kezdetben azonosított downstream effektor p53 indukált sejtciklusmegállás G2 /M. Korábban azt javasolták, hogy a RPRM elnémítása promoter metiláció, bár azt már gyengén korrelál kifejezés [5,8]. Ezen túlmenően, RPRM javasolták, mint a feltételezett tumor szuppresszor gén vesesejtes karcinóma, valamint a hypophysis daganatok [5,6]. Ebben a vizsgálatban kimutattuk, hogy RPRM génexpresszió szorosan összefügg a saját promotor régiójának metilációs állapotát, ami arra utal epigenetikus csendesítése RPRM génexpressziót. Emellett azt mutatják, hogy a RPRM gén protein termék csökkent GC szövetben képest jóindulatú gyomor nyálkahártyáját. Ezek az eredmények hasonló a Luo és munkatársai katalógusa. [11], akik arról számoltak be veszteség RPRM GC képest gyomorfekély szöveti mintákat. Továbbá, a mi megállapítása tekintetében veszteség kifejezése RPRM az átmenet szakaszában I. szakaszában a II-IV klinikailag releváns. Luo és munkatársai katalógusa. [11] számolt be egy másik hasonló esetet, de kis számú I. szakasz GC esetek (n = 15). Ezek az eredmények klinikai jelentősége prediktív tényező a progresszió GC. Ennek megfelelően ezt a veszteséget a RPRM expresszió progressziójának GC, mi funkcionális vizsgálatok (kolónia képződését és rögzítéstől független növekedés) is javasolta egy feltételezett tumor szuppresszor szerepe RPRM GC.

Bár a p53 eredetileg le, mint egy RPRM induktivitás [10], a klinikai vizsgálatok során legfeljebb eddig nem tudták megerősíteni az ilyen megállapítás [6,18]. Itt azt állapította meg, hogy veszteség RPRM kifejeződése korrelál expressziójának elvesztése egy másik tagja p53 család, p73. Bár a P73 TSG expresszálódik egy nagyon alacsony szintű a normál humán szövetekben [21], túlexpresszálódik számos különböző emberi rákos megbetegedések, például emlőrák, a neuroblasztóma, a tüdő, a nyelőcső, a gyomor, vastagbél, hólyag és petefészek [14,22]. Ezen túlmenően, azt is leírták, hogy a p73 aktiválhatja a transzkripcióját p53-reszponzív gének, beleértve a p21WAF1 /Cip1, Bax, MDM2, a ciklin-G, GADD45 és IGFBP3 [20]. Így Eredményeink alapján azt javasoljuk, hogy RPRM kifejezés lehetne szabályozni p73 p53-független módon. Katalógusa

Összefoglalva, eredményeink arra utalnak, hogy az epigenetikai elnémítása RPRM gén promoter metiláció elvesztésével jár RPRM kifejezés és ennek megfelelően, a funkcionális vizsgálati eljárásokban javasolt egy feltételezett tumor szuppresszor szerepe RPRM GC. Klinikai mintákban, RPRM vész el invazív szakaszaiban GC és expresszióját korrelál, hogy a p73 arra utal, hogy más tagjai a p53-gén család részt vehet a szabályozásában RPRM kifejezés. További kutatások szükségesek, hogy jellemezze a szerepe RPRM előrehaladásában GC és érvényesítse a biológiai szabályozásában RPRM által p73. Katalógusa

alátámasztó információk
S1 adatok. Az adatok alapjául szolgáló tanulmány. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s001 katalógusa (ZIP) hotelben S1 ábra. Hatásai Tunicamicyn on RPRM fehérje.
RPRM egy erősen glikozilált citoplazmatikus fehérje láthatóvá 25 kD Western-blot, a glikozilációs inhibitor tunikamicin (TK) kiszorítja a 25 kD RPRM sáv 15 kD AGS sejtek RPRM overexpressziója (pCMV6 /RPRM) (RPRM megjósolt mérete 12 kD). A sejteket 24 órán át inkubáltuk RPMI1640 10% FBS jelenlétében vagy távollétében a inhibitor N-glikozilációs tunicamicyn (10 ng /ml). RPRM expresszióját határoztuk meg Western-blot alkalmazásával RPRM poliklonális antitest (felső panel, hígítás 1: 1000, Sigma-Aldrich). A kifejezés a β-aktin (alsó panel, hígítás 1: 2000, Santa Cruz) képviseli fehérje Loading.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s002 katalógusa (TIF) katalógusa S2 ábra. Lokalizálása RPRM expresszió overexpresszáló AGS sejtvonalban immunfluoreszcenciája RPRM gyomorkarcinómában AGS transzfektált sejtvonal pCMV6 kódoló vektorral RPRM.
24 órával a transzfektálás után a sejteket fixáltuk paraformaldehid 4% és inkubáltuk anti-RPRM-nyúl (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) és a másodlagos antitest Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). A pozitív expresszióját RPRM (zöld) főként látható a citoplazmában. A képeket itt a Axio Vision4 többcsatornás szoftver fluoreszcens mikroszkóp Axio Scope.A1- Zeiss. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s003 katalógusa (TIF) hotelben S3 ábra. RPRM expresszió elhallgattatta promoter metiláció.
A) RT-PCR-analízise RPRM mRNS expressziójának AGS gyomorrák sejtvonal és a nélkül a DNS-metiláció inhibitor 5-azacitidin (1 uM, 72 óra). GAPDH használtunk kontrollként. B) amplifikálása RPRM metilezést specifikus PCR-AGS gyomorrák sejtvonalon. Amplifikálása metilezett MYOD1 használtunk kontrollként. AGS sejtvonalat metilezzük a promoter régió. NC: negatív kontroll. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s004 katalógusa (TIF) hotelben S4 ábra. RPRM expresszió elhallgattatta promoter metiláció (eredeti gél).
A) RT-PCR-analízise RPRM mRNS expressziójának AGS gyomorrák sejtvonal és a nélkül a DNS-metiláció inhibitor 5-azacitidin (1 uM, 72 óra). GAPDH használtunk kontrollként. B) amplifikálása RPRM metilezést specifikus PCR-AGS gyomorrák sejtvonalon. Amplifikálása metilezett MYOD1 használtunk kontrollként. AGS sejtvonalat metilezzük a promoter régió. NC: negatív kontroll. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s005 katalógusa (TIFF) hotelben

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Szeretnénk megköszönni Sabina Magedson neki hozzájárulás épület Tissue Microarrays. Ezúton is szeretnék köszönetet mondani Hiroshi Kawachi szövettani felülvizsgálata esetben Ignacio Wichmann az értékes észrevételeket a kéziratot, és Oslando Padilla az ő fontos támogatást a statisztikai elemzést. Katalógusa

• PLoS One: affinitásérést monoklonális antitest 1E11 által célzott randomizá- a CDR3 régió optimalizálja Terápiás antitest célzás HER2-pozitív gyomorkarcinóma
• PLoS One: Chrysin gátolja a tumor promoter által kiváltott MMP-9 expressziója blokkolásával AP-1 via elnyomása ERK és JNK utak gyomorrákban Cells