PLoS ONE: Verlust der Expression von Reprimo, eine p53-induzierte Gene Zellzyklusarrest, korreliert mit einer invasiven Stadium der Tumorprogression und p73 Expression in Magen Cancer

Abstrakt

Reprimo (RPRM), einem nachgeschalteten Effektor p53 induzierte Arretierung des Zellzyklus in G2 /M, wurde als putative Tumorsuppressorgen (TSG) und als potentielle Biomarker für die nicht-invasive Detektion von Magenkrebs (GC) vorgeschlagen. Das Ziel dieser Studie war, die epigenetische Silencing RPRM Gens durch Promotor-Methylierung und ihre Tumorsuppressor-Funktion in GC-Zelllinien zu bewerten. Darüber hinaus wurde die klinische Bedeutung der RPRM Proteinprodukt und seine Verbindung mit p53 /p73-Tumorsuppressor-Protein-Familie untersucht. Epigenetische Silencing RPRM Gens durch Promotor-Methylierung wurde in vier GC-Zelllinien untersucht. Proteinexpression von RPRM wurde in 20 Tumor ausgewertet und Nicht-Tumorfälle abgestimmt. Die klinische Bedeutung RPRM Assoziation mit p53 /p73-Tumorsuppressor-Protein-Familie wurde in 114 GC Fällen beurteilt. Tumorsuppressor-Funktion wurde durch funktionelle Assays untersucht. RPRM Genexpression negativ mit Promotor-Methylierung (p = 0,042 Spearman Rang r = -1) korreliert. RPRM Überexpression gehemmt Koloniebildung und Verankerung-unabhängiges Wachstum. In klinischen Proben wurde RPRM Gen-Protein-Expression in 75% (15/20) von Nicht-Tumor benachbarten Schleimhaut nachgewiesen, jedoch nur in 25% (5/20) der Magentumorgewebe (p = 0,001). Clinicopathological Korrelationen der Verlust von RPRM Expression signifikant mit invasiven Stadium der GC (Stadium I bis II-IV, p = 0,02) und eine positive Assoziation zwischen RPRM und p73-Gen-Proteinprodukt Expression assoziiert gefunden wurde (p < 0,0001 und kappa-Wert = 0,363 ). Abschließend wird epigenetische Silencing RPRM Gens durch Promotor-Methylierung mit dem Verlust der RPRM Expression assoziiert. Funktionelle Tests legen nahe, dass RPRM als TSG verhält. Der Verlust der Expression von RPRM Gen-Proteinprodukt wird mit der invasiven Stadium der GC verbunden. Positive Assoziation zwischen RPRM und p73 Ausdruck legen nahe, dass andere Mitglieder der p53-Gen-Familie bei der Regulation der RPRM Ausdruck teilnehmen

Citation. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- estay V, et al. (2015) Der Verlust der Expression von Reprimo, eine p53-induzierten Zellzyklusarrest Gene, korreliert mit einer invasiven Stadium der Tumorprogression und p73 Expression in Magenkrebs. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10.1371 /journal.pone.0125834

Academic Editor: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, USA

Empfangen: 16. Januar 2015; Akzeptiert: 25. März 2015; Veröffentlicht am: 8. Mai 2015

Copyright: © 2015 Saavedra et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

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konkurrierende Interessen:. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Tod und die fünfte am gemeinsame Bösartigkeit weltweit [1]. Trotz der abnehmenden Häufigkeit von GC, aufgrund der Anerkennung bestimmter Risikofaktoren teilweise (zB Helicobacter pylori
und Umweltfaktoren), bleibt es eine der häufigsten Krebserkrankungen weltweit und weiterhin eine klinische Herausforderung sein [2 ,3]. Magen Karzinogenese beinhaltet eine allmähliche Ansammlung von genetischen und epigenetischen Veränderungen, in der Expression von Onkogenen zu Dysregulation führenden und Tumorsuppressor-Gene (TSGs) [4]. Reprimo (RPRM) ist eine neue mutmaßliche TSG [5,6] und mit Magen Karzinogenese assoziiert [7]. Außerdem haben wir vorgeschlagen, dass methylierte RPRM zellfreie DNA einer potentiellen Biomarker für die nicht-invasive Detektion von GC sein kann [8,9].

RPRM ist ein stark glycosyliertes Protein lokalisiert vorwiegend im Zytoplasma und wurde identifiziert als nachgeschalteter Effektor bei G2 /M [10] Zellzyklusarrest p53 induzierte. Berichte deuten darauf hin, dass RPRM Ausdruck durch zwei Mechanismen reguliert wird, eine durch DNA-Methylierung an seiner Promotorregion [8] und andererseits durch p53-Signalweg [10]. Doch neuere Studien nicht in der Lage gewesen, diese Ergebnisse zu bestätigen [6]. Auf der anderen Seite hat sich die klinische Bedeutung der RPRM schlecht untersucht worden [11]. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Rolle der DNA-Methylierung in der Regulation der RPRM Ausdruck, ihre klinische Bedeutung und seine Verbindung mit den Mitgliedern des p53-Tumorsuppressor-Protein-Familie (das heißt p53 und p73). Wir fanden dichte Methylierung in der RPRM Promotorregion, die mit einem Verlust der Expression in GC-Zelllinien verbunden war. In klinischen Fällen wurde Verlust der Expression mit der Invasivität Phase der GC verbunden. Darüber hinaus haben wir eine positive Assoziation zwischen der Expression von RPRM und p73 beobachtet, was darauf hindeutet, dass andere Mitglieder der p53-Gen-Familie könnte für die Regulation der RPRM Ausdruck Roman Kandidaten sein.

Methoden

Zelllinien und Gewebeproben

Vier GC-Zelllinien (AGS, SNU-1, KatoIII und NCI-N87) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) in Dezember 2012 in RPMI-1640-Medium (Hyclone) herabgesetzt und gekauft mit 10% fötales Rinderserum (FBS) und bei 37 ° C, 5% CO _{2 gehalten. Zwanzig abgestimmt Tumor und Nicht-Tumor angrenzenden Schleimhaut (NTAM) Proben wurden zur Auswertung von RPRM Expression ausgewählt. Sechs wurden für die Bewertung der RPRM Methylierungs ausgewählt. Eine Kohorte von 114 Patienten GC wurde für klinisch-pathologischen Korrelationen von RPRM Genprotein Produkt ausgewählt. Gewebeproben von Einzelfällen wurden für Magenkrebs Empfehlungen gemäß der japanischen Forschungsgesellschaft eingestuft [12]. Alle Fälle wurden vom Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital Clinico San Borja Arriaran (ICHJED-HCSBA), Santiago, Chile zwischen 1993-2000 [13] und klinisch-pathologischen Eigenschaften rekrutiert werden in Tabelle 1 dieser Studie gezeigt, von der Institutional genehmigt wurde Review Boards der Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de Ética Científico) und ICHJED-HCSBA (Comité de Ética Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chile). Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von jedem Teilnehmer, die an der Studie erhalten.}

Tissue Microarray und Immunhistochemie

Tissue Microarrays (TMA) wurden unter Verwendung eines manuellen Tissue Array II Instrument (Beecher Instruments) wie bisher beschrieben [14,15]. Kernabschnitte (4 um) wurden zu Immunofärbung von Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs) unterzogen, nach den Anweisungen des Herstellers. Antikörper, die in dieser Studie verwendet wurden, waren RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (Klon 318-6-11, Dako Dänemark) und p73-Protein α (Klon 24, Novacastra). Ergebnisse der Immunfärbung in ganzen Tumor und NTAM sowie TMA Abschnitte wurden als positiv für RPRM angesehen, wenn > 30% der Epithelzellen zytoplasmatische Färbung zeigten, > 10% Kernfärbung für p53 oder > 10% Kern /Zytoplasma-Färbung für p73 . Auswertung der immunhistochemischen Färbung wurde durch zwei Pathologen unabhängig voneinander durchgeführt (JV & GC)., Die zu klinischen Daten wurden geblendet

Die Bisulfit-Sequenzierung und quantitative RT-PCR Expressionsanalyse

DNA von GC-Zelllinien war unter Verwendung von TRIzol-Reagens (Life Technologies) gemäß Herstellerprotokoll, gefolgt von Bisulfit Umwandlung unter Verwendung des EZ DNA Methylierungs Gold-Kit (Zymo Research) extrahiert. RPRM Promotor wurde aus Bisulfit-behandelte DNA amplifiziert, Grundierungen RPRM_B_FW 5'-TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'und 5'-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', so dass der Nachweis von 52 CpG Stellen innerhalb eines 509-bp-Promotor-Region. PCR-Produkte wurden mit QIAXEN II Gel-Extraktions-Kits (QIAGEN) gereinigt und ligiert in pGEM-T-Vektor. Das Ligationsprodukt wurde verwendet, um kompetente E
verwandeln. coli
Top10-Zellen nach dem Verfahren von Inoue et al. [16]. Die Transformanten wurden auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 ug /ml), X-Gal (50 mg /ml) und IPTG (100 mM) ergänzt ausgewählt. Die resultierenden weißen Kolonien wurden durch Kolonie-PCR untersucht. Positive Klone wurden bis zur späten exponentiellen Phase auf flüssigen Medium (LB /Ampicillin) gezüchtet (OD 600 = 1) und die DNA-Plasmide wurden unter Verwendung von reinem Ausbeute Miniprep-System-Kit gereinigt (Promega). Der RPRM Promotorregion wurde unter Verwendung von Universal-M13 sequenziert (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'und RV 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') durch Macrogen (http://dna.macrogen.com). BiQ Analysator-Software wurde für die Analyse der sequenzierten Klone verwendet. Alle positiven pGEM-T-Klone wurden bei -80 ° C auf LB /Ampicillin-Medium und gespeichert gewachsen (in 14% Glycerin). Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRIzol-Reagens (Invitrogen) extrahiert, und cDNA wurde unter Verwendung von nach iScript cDNA Synthesis Kit synthetisiert Anweisungen des Herstellers (Biorad). Anschließend wurde cDNA für jede PCR-Reaktion mit jedem Primer-Paar verwendet. Die RPRM spezifischen Primer sind: 5'-RPRM_FW GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'und 5'-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. Echtzeit-RT-PCR-Analyse wurde in einem LightCycler 1.5 Real-Time Detection System (Roche) mit LightCycler Fast Start DNA Masterplus SYBR Green I (Roche) durchgeführt. Relative quantitative Analyse normalisiert RPL-30 wurde über die Vergleichszyklusschwellenverfahren durchgeführt [17]. Die RPL-30-spezifische Primer sind:. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'und RPL30_RV 5'-AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'

Validierung von RPRM Antikörper durch Immunoblot und Immunofluoreszenz

3x10 ^{5 AGS-Zellen wurden transient mit pCMV6 /RPRM oder pCMV6 (Origene) leeren Vektor transfiziert, unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für 24 h in RPMI 1640 mit 10% FBS in Gegenwart oder Abwesenheit von N-Glycosylierung Inhibitor Tunicamicyn (10 ng /mL) inkubiert. Zellen wurden geerntet und Ganzzell-Lysate wurden unter Verwendung von Triton-Puffer (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,1 M, 0,5% Triton X-100) mit Protease Inhibitor Cocktail Kit (P8340, Sigma Aldrich) und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail Kit extrahiert ( sc-45045, Santa Cruz Biotechnology). Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Quickstart Bradford-Reagenz (Bio-Rad) bestimmt. Fünfzig &mgr; g Protein wurden SDS-PAGE 4% bis 12% getrennt. Proteine ​​auf den Gelen wurden elektrophoretisch auf Polyvinylidendifluorid-Membranen unter Verwendung des Mini transblotter System (Bio-Rad, Hercules, CA). Die Polyvinylidendifluorid-Membranen wurden in 5% Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung /Tween 20 (TBST) für 1 h blockiert. Primäre Antikörper anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) wurde 1: 1000 verdünnt in TBST /3% BSA /und die Membranen wurden in primären Antikörpern bei 4 ° C über Nacht inkubiert. Die Membranen wurden für 10 Minuten jeweils dreimal in TBST gewaschen. 2000 in TBST und auf den Membranen 1 h bei Raumtemperatur inkubiert: Anti-Kaninchen-Peroxidase-konjugierter sekundärer Antikörper (Santa Cruz) wurde 1 verdünnt. Die Membranen wurden wie oben gewaschen und visualisiert Supersignal West-Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) unter Verwendung von gemäß dem Protokoll des Herstellers. Um die zelluläre Lokalisation von RPRM bewerten, wurde Immunfluoreszenz-Assay durchgeführt. AGS-Zellen transient mit pCMV6-RPRM oder pCMV6 wurden auf Deckgläsern gezüchtet. Die transient transfizierten AGS-Zellen wurden in 4% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur fixiert und dann dreimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). 1000, 38-50,: Zellen wurden in 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) für 10 min blockiert in 3% BSA für 1 h bei Raumtemperatur und anschließend markiert mit einem Anti-Antikörper RPRM (1 permeabilisiert Sigma-Aldrich). (200, Molecular Probes, Invitrogene 1) für 1 h bei Raumtemperatur nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem Alexa Fluor 488-konjugierten Antikörper inkubiert. Die Bilder wurden durch Fluoreszenz-Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie erworben (siehe Hintergrundinformationen S1 und S2 Figuren).}

Zellkultur und Transfektion

Für eine stabile Transfektion Experimente, AGS-Zellen bei 3x10 plattiert ^{5 Zellen /100-mm-Kulturschale und transfiziert nach 24 h mit pCMV6-RPRM oder pCMV6 (Origene) leeren Vektor unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion unter den gleichen Bedingungen mit G418 (500g /ml) Zellen wurden. Das Kulturmedium alle 24 h für 14 Tage geändert wurde.}

Koloniebildungstest

Für Koloniebildungstest wurden 200 Zellen, die stabil mit pCMV6-RPRM oder pCMV6 leeren Vektor transfiziert. Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (Hyclone) mit 10% FBS ergänzt. Kulturmedium wurde alle 24 Stunden gewechselt. Die Kolonien wurden gefärbt mit 0,4% Kristallviolett (Sigma) in 50% Methanol, 21 Tage nach der ersten Aussaat und zählte bei 20 Bildern, die unter inverses Mikroskop genommen (Evos XL-Core-Cell-Imaging-System, Life Technologies). Jede Transfektion wurde dreifach durchgeführt. Darüber hinaus wurden Versuche durchgeführt replizieren weitere Klone für die Expressionsanalyse zu erhalten.

verankerungsunabhängigen Wachstumstest

Verankerungs-unabhängiges Zellwachstum durch Plattieren 1% Agarose analysiert enthaltend 2x10 ^{5-Zellen stabil transfiziert mit pCMV6-RPRM oder pCMV6 leeren Vektor in 6-Well-Platten. Zellen wurden durch wöchentliche überlagernden frischen Weichagar Lösung zugeführt, und die Kolonien wurden nach 4 Wochen Inkubation photographiert. Das Experiment wurde dreifach durchgeführt.}

Statistical Analysis

Spearman-Korrelationskoeffizienten wurde die Korrelation zwischen RPRM Methylierung und Genexpressionsniveaus berechnet, zu analysieren. Kategorische Variablen, die von Pearson Chi-Quadrat-Test (zweiseitig) analysiert wurden, wurde der p-Wert korrigiert, um eine logistische Regressionsanalyse. Kontinuierliche Variablen wurden unter Verwendung von Students t
Test und Datenanalyse wurde als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Kappa-Test wurde verwendet, um die Korrelation zwischen dem RPRM Expression und p73-Expression zu analysieren. Statistische Analysen wurden mit SPSS Version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) Statistik-Paket und GraphPad Prism5 Software (La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Alle Werte waren zweiseitig, mit Ausnahme der Rangkorrelation nach Spearman. Die statistische Signifikanz wurde als p <definiert sind; 0,05.

Ergebnisse |

RPRM Methylierung und Expression in Magenkrebs-Zelllinien

Bisher haben wir und andere berichteten, dass RPRM Expression durch den Demethylierungsmittel 5-Aza wiederhergestellt werden kann -2-Desoxycytidin (Siehe Informationen S3 und S4 Figuren Unterstützung) [5,8,18]. Jedoch RPRM Methylierung wurde mit seinem Ausdruck [18] schwach korreliert. Um den Zusammenhang zwischen RPRM-Promotor-Methylierung und die Genexpression zu bewerten, die vollständige Promotorregion von RPRM Gens wurde durch DNA-Bisulfit-Sequenzierung in vier GC-Zelllinien (AGS, SNU-1, KATO III und NCI-N87) analysiert (1A). Somit wurden die Methylierungsstatus der CpG-Stellen 52, die sich zwischen -207 und +302 Nukleotiden relativ zur Transkriptionsstartstelle (TSS), analysiert. Diese Analyse zeigt, dichte Methylierung in Zelllinien AGS und SNU-1 (89,6% bzw. 86%, jeweils), im Vergleich zu KATO III und NCI-N87 (79,7% bzw. 51,8% betrugen) (p = 0,0002) (Fig 1B) . Als nächstes wurde Niveau RPRM Expression durch quantitative RT-PCR bestimmt. (1C); Low RPRM Gen-Expression wurde in AGS und SNU-1 im Vergleich zu KATO III und NCI-N87-Zelllinien (0,0001 p <) beobachtet. Durch Spearman-Korrelationsanalyse signifikante negative Korrelation ergab, wurde zwischen Methylierungsdichte und RPRM Genexpression (r = -1; p = 0,042) gefunden (1D). Zusammengenommen sind diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Methylierung von RPRM Promotorregion eine wichtige Rolle bei der Regulation der RPRM Ausdruck spielt.

RPRM Methylierung und Expression in Magenkrebs Gewebe

Zur vorherigen Daten in GC Gewebe erhärten , RPRM Methylierungsniveaus wurden in 6 gepaart Tumor und NTAM Proben bestimmt. Die Ergebnisse zeigen eine höhere Methylierungsniveaus in Tumorgeweben im Vergleich zu NTAM Geweben (siehe Abb 1E). Um die Expression von RPRM Gen-Proteinprodukt in GC Geweben IHC-Analyse untersuchen, wurde durchgeführt. Positive RPRM Expression wurde hauptsächlich im Zytoplasma von Magen-Epithelzellen beobachtet. RPRM Gen-Protein-Expression wurde in 75% (15/20) von NTAM Gewebeproben nachgewiesen. Jedoch nur 25% (5/20) der Tumorproben zeigte die Expression von RPRM Gen-Proteinprodukt (Bild 2). Diese Unterschiede waren hoch signifikant (p = 0,001) und legen nahe, dass die Expression von RPRM wird in GC Gewebe verloren. Zur Auswertung wurde die klinische Bedeutung dieser Verlust von RPRM Ausdruck eine Kohorte von 114 GC Fälle ausgewertet. Der Verlust der RPRM Expression wurde in 62% (71/114) der GC Fälle gefunden. Clinicopathological Korrelationen RPRM Expression sind in Tabelle 1 gezeigt Progression von Stufe I GC Stufen II-IV (p = 0,006) und Lymphknotenmetastasen (p = 0,037) wurden mit einem Verlust der Expression des Gens RPRM Proteinprodukt signifikant verbunden. Allerdings zeigt logistische Regressionsanalyse, dass nur Progression von Stufe I bis II-IV signifikant mit Verlust von RPRM Gen-Proteinprodukt (p = 0,020) assoziiert ist.

Funktionstest von RPRM bei Magenkrebs (Koloniebildung und Verankerung -unabhängigen Wachstum)

Wie der Verlust von RPRM Expression wurde in GC zugeordnet ist, und vor allem mit der Entwicklung vom Stadium I bis II-IV, ein Tumor-Suppressor-Rolle von RPRM könnte plausibel sein. Daher funktionelle Assays wie In-vitro-
Koloniebildung und verankerungsunabhängigen Wachstumstests wurden in AGS Zelle mit pCMV6 /RPRM (3A) transfiziert ausgeführt. Nicht-exprimierenden AGS Zellinien transfiziert mit RPRM Expressionsplasmide zeigten eine signifikant reduzierte Anzahl von Kolonien im Vergleich leeren Vektor transfizierten Zelllinien mit pCMV6-leeren Vektor transfiziert pCMV6- (p < 0,05) (Fig 3B). Der Effekt der Überexpression auf RPRM verankerungsunabhängiges Wachstum in Weichagar Koloniebildungstest wurde ebenfalls in stabil transfizierten Zelllinie AGS Klone beurteilt. Die Kolonien wurden 4 Wochen nach der ersten Aussaat und Inkubation in Soft-Agar gezählt. Zellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert zeigte robuste Koloniewachstum nach Anzahl und Größe der Kolonien. Dies wurde stark reduziert, wenn RPRM wurde in AGS-Zellen (3C) erneut zum Ausdruck gebracht.

Association of RPRM Expression und p53 /p73-Tumorsuppressor-Protein-Familie bei Magenkrebs

RPRM definiert wurde als ein p53-vermittelte Gen in embryonalen Fibroblasten-Zellen [18]. Jedoch wurde berichtet, dass die Regulierung der Expression RPRM unabhängig sein kann von p53-Gen-Status in neuronalen Zellen mit Kupfer behandelt [19]. Auf der anderen Seite kann p73 die Transkription von p53-responsive Gene [20] aktivieren. In Anbetracht dieser Einstellung werteten wir die Expression von p53 und anderen Mitglied der p53-Proteinfamilie, p73 TSG. Expression von p53 wurde in den Kernen der Magenschleimhaut Zellen. Positive p53-Expression wurde in 23,5% (20/114) der GC Fälle nachgewiesen. Nur die Tumorgröße mit der Expression von p53 (p = 0,035, siehe Tabelle 2) verbunden war. Expression von p73 wurde in den Zellkernen und Zytoplasma von Epithelzellen befindet. Positive p73-Expression wurde in 30,6% (34/114) der GC-Proben gefunden. Interessanterweise signifikante klinisch-pathologischen Korrelationen von p73-Expression wurden mit invasiven Stadium (Stadium I 55,6%; 10/18 zu den Stadien II-IV 25,8%; 24/93, p = 0,012) assoziiert und Lymphknotenmetastasen (p = 0,038) (Tabelle 2 ). Da Verluste der Expression von RPRM und p73-Gen-Protein-Produkte ähnlich klinisch-pathologischen Korrelationen haben, werteten wir Assoziation zwischen Ausdrücken der Ebenen der beiden Proteine. Dazu Fälle wurden in vier Gruppen getrennt nach der Expression von RPRM und p73-Proteinprodukte. Die Analyse ergab, dass 22 111 GC Fälle positiv für beide RPRM und p73-Proteine ​​waren, während 57 aus 111 negativ waren. Dieser Verein war statistisch signifikant (p < 0,0001). Mit einem Kappa-Wert von 0,363 (Tabelle 3)

Diskussion

RPRM ist ein hoch glykosylierte zytoplasmatische Protein, zunächst als nachgeschalteter Effektor von p53 identifiziert -induzierte Zellzyklusarrest in der G2 /M. Bisher wurde vorgeschlagen, dass RPRM durch Promotor-Methylierung zum Schweigen gebracht wird, obwohl sie mit ihrem Ausdruck schwach korreliert ist [5,8]. Zusätzlich RPRM wurde als putative Tumorsuppressorgen in Nierenzellkarzinomen und Hypophysentumoren [5,6] vorgeschlagen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass RPRM Genexpression stark mit seiner Promotorregion Methylierungsstatus assoziiert ist, epigenetische Silencing RPRM Genexpression hinweist. Darüber hinaus zeigen wir, dass RPRM Gen-Proteinprodukt in GC-Gewebe im Vergleich zu nicht-karzinogene Magenschleimhaut verringert wurde. Diese Ergebnisse sind ähnlich der von Luo et al
. [11], die einen Verlust von RPRM in GC gemeldet, wenn Magengeschwür Gewebeproben im Vergleich zu. Darüber hinaus ist unsere Erkenntnis in Bezug auf Verlust der Expression von RPRM im Übergang von der Stufe I zu den Stadien II-IV ist klinisch relevant. Luo et al
. [11] berichteten über ein ähnliches Ergebnis, jedoch in einer kleinen Anzahl von Stufe I GC Fälle (n = 15). Diese Erkenntnisse haben klinische Bedeutung als prädiktiver Faktor für die Progression der GC. Entsprechend dieser Verlust RPRM Expression im Verlauf der GC unsere funktionelle Assays (Koloniebildung und verankerungsunabhängiges Wachstum) auch vorgeschlagen, eine putative Tumorsuppressor Rolle RPRM in GC.

Obwohl p53 zunächst als eine beschrieben wurde RPRM Induktor [10], klinische Studien durchgeführt, auf dem neuesten Stand sind nicht in der Lage gewesen, eine solche Feststellung zu bestätigen, [6,18]. Hier haben wir festgestellt, dass der Verlust von RPRM Expression korreliert mit dem Verlust der Expression von einem anderen Mitglied der p53-Familie, p73. Obwohl p73 TSG auf einem sehr niedrigen Niveau in normalen menschlichen Geweben exprimiert wird [21], wird in vielen verschiedenen menschlichen Krebsarten wie Brust-, Neuroblastom, Lunge, Speiseröhre, Magen, Dickdarm, Blase und Ovars [14,22] überexprimiert. Außerdem wurde berichtet, dass p73 die Transkription von p53-responsive Gene aktivieren kann, einschließlich p21Waf1 /Cip1, bax, mdm2, Cyclin G, GADD45 und IGFBP3 [20]. So basieren auf unseren Erkenntnissen, schlagen wir vor, dass RPRM Expression von p73 in einer p53-unabhängige Art und Weise geregelt werden konnte.

Insgesamt unsere Daten deuten darauf hin, dass epigenetische Silencing RPRM Gens durch Promotor-Methylierung mit Verlust verbunden ist, RPRM Expression und dementsprechend funktionelle Assays vorgeschlagen, einen vermeintlichen Tumor-Suppressor-Rolle von RPRM in GC. In klinischen Proben, RPRM an invasive Stadien der GC und seine Expression korreliert vermutlich mit der von p73 verloren, dass andere Mitglieder der p53 Genfamilie in der Regulation der Expression RPRM teilnehmen. Weitere Forschung ist gerechtfertigt, um die Rolle der RPRM in der Progression von GC und zu validieren, die biologische Regulation der RPRM von p73 zu charakterisieren.

Hintergrundinformationen
S1 Daten. . Daten zugrunde liegen, die Studie
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s001
(ZIP)
S1 Abb. Auswirkungen von Tunicamicyn auf RPRM Protein.
RPRM ist ein hoch glykosylierte bis 25 kD durch Western-Blot sichtbar gemacht zytoplasmatische Protein, die Glykosylierung Hemmstoff Tunicamycin (TK) verdrängt die 25 kD RPRM Band bis 15 kD in AGS-Zellen mit RPRM Überexpression (pCMV6 /RPRM) (RPRM vorhergesagten Größe 12 kD). Zellen wurden 24 h in RPMI 1640 mit 10% FBS in Gegenwart oder Abwesenheit des Inhibitors der N-Glykosylierung tunicamicyn (10 ng /mL) inkubiert. RPRM Expression wurde durch Western-Blotting unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers RPRM (1000, Sigma-Aldrich oberen Platte, Verdünnung 1) bestimmt. Die Expression von β-Aktin (unten, Verdünnung 1: 2000, Santa Cruz) stellt Proteinbeladung
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s002
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S2 Abb. Lokalisierung von RPRM Expression in überexprimierenden AGS Zelllinie Immunofluoreszenz von RPRM bei Magenkrebs AGS-Zelllinie, transfiziert mit pCMV6 Vektor-Codierung RPRM.
24 h nach der Transfektion wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert und inkubiert mit Anti-RPRM-Kaninchen (1 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) und sekundären Antikörper Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). Ein positiver Ausdruck von RPRM (GRÜN) wird hauptsächlich im Zytoplasma zu sehen. Die Bilder wurden bei Verwendung von Axio Vision4 mehrkanaligen Software in Fluoreszenzmikroskop Axio Scope.A1- Zeiss erfasst
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s003
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S3 Abb. RPRM Expression durch Promotor-Methylierung zum Schweigen gebracht.
A) RT-PCR-Analyse von RPRM mRNA-Expression in AGS Magenkrebs-Zelllinie mit und ohne die DNA-Methylierungsinhibitor 5-Azacytidin (1 &mgr; M für 72 Stunden). GAPDH wurde als Kontrolle verwendet. B) Amplifikation von RPRM von Methylierungsspezifische PCR in AGS Magenkrebs-Zelllinie. Amplifikation methylierter MYOD1 wurde als Kontrolle verwendet. AGS-Zelllinie wurde in der Promotorregion methyliert. NC: Negativkontrolle
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s004
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S4 Abb. RPRM Expression durch Promotor-Methylierung (Original Gel) zum Schweigen gebracht.
A) RT-PCR-Analyse von RPRM mRNA-Expression in AGS Magenkrebs-Zelllinie mit und ohne die DNA-Methylierungsinhibitor 5-Azacytidin (1 &mgr; M für 72 Stunden). GAPDH wurde als Kontrolle verwendet. B) Amplifikation von RPRM von Methylierungsspezifische PCR in AGS Magenkrebs-Zelllinie. Amplifikation methylierter MYOD1 wurde als Kontrolle verwendet. AGS-Zelllinie wurde in der Promotorregion methyliert. NC:. Negativkontrolle
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s005
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Acknowledgments

Wir möchten Sabina Magedson für ihren Beitrag im Gebäude zu danken Tissue Microarrays. Wir möchten auch Hiroshi Kawachi für die histologische Überprüfung der Fälle, Ignacio Wichmann für ihre wertvollen Kommentare auf unserer Handschrift und Oslando Padilla für seine wichtige Unterstützung bei der statistischen Analyse danken.

• PLoS ONE: Affinitätsmaturierung des monoklonalen Antikörpers 1E11 durch gezielte Randomisierung in CDR3 Regionen optimiert therapeutische Antikörper-Targeting von HER2-positivem Magenkrebs
• PLoS ONE: Chrysin Hemmt Tumor-Promotor-induzierte MMP-9-Expression durch Blockieren von AP-1 über Unterdrückung von ERK und JNK Pathways in Magenkarzinomzellen