PLoS ONE: Verlies van Expressie van Reprimo, een p53-geïnduceerde celcyclus Gene, correleert met Invasieve fase van de progressie van de tumor en p73 expressie in Gastric Cancer

Abstract

Reprimo (RPRM), een stroomafwaartse effector van p53 geïnduceerde celcyclusstilstand in G2 /M, is voorgesteld als potentieel tumor suppressor gen (GTS) en als potentiële biomarker voor niet-invasieve detectie van maagkanker (GC). Het doel van deze studie was de epigenetische inactivatie van gen RPRM evalueren promoter methylering en tumor suppressor functie GC cellijnen. Bovendien, klinische betekenis van RPRM eiwit product en de associatie met p53 /p73 tumor suppressor eiwit familie werd onderzocht. Epigenetische van RPRM gen door promoter methylatie werd geëvalueerd in vier GC cellijnen. Eiwitexpressie van RPRM werd geëvalueerd bij 20 tumor en non-tumor afgestemd gevallen. De klinische betekenis van RPRM associatie met p53 /p73 tumor suppressor eiwit familie werd bepaald in 114 GC gevallen. Tumor suppressor functie werd onderzocht door middel van functionele assays. RPRM genexpressie werd negatief gecorreleerd met promotor methylering (Spearman r = 1; p = 0,042). RPRM overexpressie remde vorming kolonie en verankering-onafhankelijke groei. In klinische monsters werd RPRM gen-eiwitexpressie aangetoond in 75% (15/20) van niet-tumor aangrenzende mucosa, maar slechts in 25% (5/20) van gastrische tumorweefsels (p = 0,001). Klinisch-pathologische correlaties van het verlies van RPRM meningsuiting waren significant geassocieerd met invasieve fase van GC (fase I naar II-IV, p = 0,02) en een positieve associatie tussen RPRM en p73 gen-proteïne product expressie werd gevonden (p < 0,0001 en kappa-waarde = 0,363 ). Tot slot wordt epigenetische silencing van RPRM-gen door promoter methylatie geassocieerd met verlies van RPRM expressie. Functionele testen suggereren dat RPRM zich gedraagt ​​als een TSG. Verlies van expressie van gen RPRM eiwitproduct wordt gekoppeld aan de invasieve fase van GC. Positieve associatie tussen RPRM en p73 meningsuiting suggereren dat andere leden van het p53-gen familie kan deelnemen aan de regulatie van RPRM meningsuiting

Visum:. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- Estay V, et al. (2015) Verlies van Expressie van Reprimo, een p53-geïnduceerde celcyclus Gene, correleert met Invasieve fase van de progressie van de tumor en p73 Expression bij maagkanker. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10.1371 /journal.pone.0125834

Academic Editor: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, Verenigde Staten

Ontvangen: 16 januari 2015; Aanvaard: 25 maart 2015; Gepubliceerd: 8 mei 2015

Copyright: © 2015 Saavedra et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:.. Dit werk werd ondersteund door subsidies CONICYT-FONDECYTo1014 (AHC) en CONICYT-FONDAP—30011 (AHC en JCR) van de regering van Chili

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de derde belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde dood en de vijfde meest voorkomende maligniteit in de wereld [1]. Ondanks de dalende incidentie van GC, mede als gevolg van de erkenning van bepaalde risicofactoren (zoals Helicobacter pylori Kopen en omgevingsfactoren), het blijft een van de meest voorkomende vormen van kanker wereldwijd en blijft een klinische uitdaging [2 , 3]. Maagkanker omvat een geleidelijke accumulatie van genetische en epigenetische veranderingen, die tot ontregeling in de expressie van oncogenen en tumorsuppressorgenen (GTS) [4]. Reprimo (RPRM) is een nieuwe kandidaat TSG [5,6] en in verband met de maag carcinogenese [7]. Bovendien hebben we voorgesteld dat gemethyleerd RPRM celvrij DNA potentiële biomarker voor de niet-invasieve detectie van GC kan [8,9].

RPRM is een sterk geglycosyleerd eiwit voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma en is geïdentificeerd als een stroomafwaartse effector van p53 geïnduceerde celcyclusstilstand in G2 /M [10]. Rapporten suggereren dat RPRM expressie wordt gereguleerd door twee mechanismen, één tot DNA methylatie op de promotorregio [8] en anderzijds door p53 route [10]. Echter, meer recente studies niet in staat zijn om deze bevindingen te bevestigen geweest [6]. Aan de andere kant heeft de klinische betekenis van RPRM is slecht bestudeerd [11]. In de huidige studie onderzochten we de rol van DNA-methylatie in de regulatie van RPRM meningsuiting, de klinische betekenis en de associatie met de leden van het p53 tumor suppressor eiwit familie (dat wil zeggen, p53 en p73). We vonden dichte methylatie in de RPRM promotorgebied, dat werd toegeschreven aan een verminderde expressie in GC cellijnen. In klinische gevallen, expressie was geassocieerd met het invasieve fase van GC. Verder zagen we een positieve associatie tussen expressie van RPRM en p73, wat suggereert dat de andere leden van het p53-gen familie zou kunnen zijn nieuwe kandidaten voor de regulering van RPRM meningsuiting.

Methods

cellijnen en Weefselmonsters

Vier GC cellijnen (AGS, SNU-1, KATOIII en NCI-N87) werden gekocht bij American Type Culture Collection (ATCC) in december 2012 gekweekt in RPMI-1640 medium (Hyclone) en aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en gehandhaafd op 37 ° C, 5% CO _{2. Twintig afgestemd tumor- en non-tumor aangrenzende mucosa (NTAM) monsters werden geselecteerd voor de evaluatie van RPRM expressie. Zes werden geselecteerd voor de evaluatie van RPRM methylatie. Een cohort van 114 GC patiënten werd geselecteerd voor klinisch-pathologische correlaties van RPRM gen-eiwit product. Weefselmonsters van individuele gevallen werden geclassificeerd volgens de Japanse Research Society for Maag aanbevelingen Cancer [12]. In alle gevallen werden gerekruteerd uit het Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital Clínico San Borja Arriaran (ICHJED-HCSBA), Santiago, Chili tussen 1993-2000 [13] en clinicopathologische functies zijn weergegeven in tabel 1. Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional review Boards van Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de Ética Científico) en ICHJED-HCSBA (Comité de Ética Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chili). Schriftelijke toestemming werd verkregen van elk bij het onderzoek betrokken deelnemer.}

Tissue microarray en Immunohistochemie

Tissue microarrays (TMA) werden gedaan met behulp van een handmatige Tissue Array II instrument (Beecher Instruments) zoals eerder beschreven [14,15]. Kerndelen (4 urn) werden onderworpen aan immunokleuring met Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), volgens de instructies van de fabrikant. Antilichamen die in deze studie waren RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (kloon 318-6-11, Dako Denemarken) en p73 eiwit α (kloon 24, Novacastra). De resultaten van immunokleuring gehele tumor en NTAM evenals TMA secties werden positief voor RPRM beschouwd wanneer > 30% van epitheliale cellen vertoonden cytoplasmische kleuring, > 10% nucleaire kleuring voor p53, of > 10% nucleaire /cytoplasmatische kleuring voor p73 . Evaluatie van immunohistochemische kleuring werd onafhankelijk uitgevoerd door twee pathologen (JV & GC). Die blind waren klinische gegevens

bisulfietsequencing en kwantitatieve RT-PCR expressie analyse

DNA van GC cellijnen was geëxtraheerd met behulp TRIzol reagens (Life Technologies) volgens protocol van de fabrikant, gevolgd door bisulfiet conversie met de EZ DNA methylatie Gold kit (Zymo Research). RPRM promoter werd geamplificeerd uit bisulfiet behandelde DNA, onder gebruikmaking van primers 5'-RPRM_B_FW TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'en 5'-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', waardoor de detectie van 52 CpG posities binnen een 509-bp promotorgebied. PCR producten werden gezuiverd met QIAXEN II gelextractiekit (QIAGEN) en geligeerd in pGEM-T vector. Het ligatieproduct werd gebruikt om competente E
transformeren. coli
Top10 cellen, volgens de beschreven door Inoue et al procedure. [16]. De transformanten werden geselecteerd op LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline (100 ug /ml), X-Gal (50 mg /ml) en IPTG (100 mM). De verkregen witte kolonies werden bepaald door kolonie-PCR. Positieve klonen werden gekweekt op vloeibaar medium (LB /ampicilline) tot in de late exponentiële fase (OD600 = 1) en DNA-plasmiden werden gezuiverd met behulp van Pure Yield miniprep systeem kit (Promega). De RPRM promotorgebied werd gesequenced met behulp universele M13 (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'en 5'-RV CAGGAAACAGCTATGAC-3') van Macrogen (http://dna.macrogen.com). BIQ analyzer software werd gebruikt voor de analyse van klonen gesequentieerd. Alle positieve pGEM-T klonen werden gekweekt op LB /ampicilline medium en bewaard bij -80 ° C (in 14% glycerol). Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van TRIzol reagens (Invitrogen) en cDNA werd gesynthetiseerd met behulp iScript cDNA Synthesis kit volgens instructies van de fabrikant (Biorad). Vervolgens cDNA werd gebruikt voor elke PCR reactie met elk primerpaar. RPRM de specifieke primers: 5'-RPRM_FW GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'en 5'-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. Real-time RT-PCR-analyse werd uitgevoerd met behulp LightCycler Fast Start DNA Masterplus SYBR Green I (Roche) in een LightCycler 1,5 Real-Time Detection System (Roche). Relatieve kwantitatieve analyse genormaliseerd naar RPL-30 werd uitgevoerd via de vergelijkende cyclus drempelwaarde methode [17]. De RPL-30 specifieke primers zijn:. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'en RPL30_RV 5'-AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'

Validatie van RPRM antilichaam door Immunoblot en immunofluorescentie

3x10 ^{5 AGS cellen werden voorbijgaand getransfecteerd met pCMV6 /RPRM of pCMV6 (Origene) lege vector, met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant. Achtenveertig uur na transfectie werden cellen geïncubeerd gedurende 24 uur in RPMI1640 met 10% FBS, in aanwezigheid of afwezigheid van N-glycosylering remmer Tunicamicyn (10 ng /ml). Cellen werden geoogst en gehele cellysaten werden geëxtraheerd met behulp Triton-buffer (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,5% Triton X-100) met Protease Inhibitor Cocktail Kit (P8340, Sigma-Aldrich) en fosfatase Inhibitor Cocktail Kit ( sc-45045, Santa Cruz Biotechnology). Eiwit concentraties werden bepaald met behulp van Quick Start Bradford reagens (Bio-Rad). Vijftig ug eiwit werd gescheiden op SDS-PAGE 4% tot 12%. Eiwitten op de gels werden geëlektroblot op polyvinylideendifluoride membranen via de mini transblotter systeem (Bio-Rad, Hercules, CA). De polyvinylideendifluoride membranen werden geblokkeerd in 5% melk in Tris-gebufferde zoutoplossing /Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur. Primaire antilichaam anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) werd verdund 1: 1000 in TBST /3% BSA /en de membranen werden geïncubeerd in primaire antilichamen bij 4 ° C overnacht. Membranen werden driemaal in TBST gewassen voor 10 minuten elk. Anti-konijn peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (Santa Cruz) werd verdund 1: 2000 in TBST geïncubeerd en de membranen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. De membranen werden gewassen zoals hierboven en gevisualiseerd met behulp SuperSignal West Pico chemiluminescentiesubstraat (Pierce) volgens het protocol van de fabrikant. Om de cellulaire locatie van RPRM evalueren, werd immunofluorescentietest uitgevoerd. AGS-cellen die transiënt getransfecteerd met pCMV6-RPRM of pCMV6 werden gekweekt op dekglaasjes. De tijdelijk getransfecteerde AGS cellen werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens driemaal gewassen in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Cellen werden gepermeabiliseerd in 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) gedurende 10 minuten geblokkeerd in 3% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens gemerkt met een anti-RPRM antilichaam (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Na wassen met PBS werden cellen geïncubeerd met Alexa Fluor 488-geconjugeerd antilichaam (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Beelden werden verworven door middel van fluorescentie laser scanning confocale microscopie (zie Ondersteunende informatie S1 en S2 figuren).}

Cel cultuur en transfectie

Voor een stabiele transfectie-experimenten, AGS cellen werden op 3x10 vergulde ^{5 cellen /100 mm kweekschaal en getransfecteerd na 24 uur met pCMV6-RPRM of pCMV6 (Origene) lege vector met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant. Achtenveertig uur na transfectie werden de cellen gekweekt onder dezelfde omstandigheden met G418 (500 g /ml). Kweekmedium werden elke 24 uur gedurende 14 dagen.}

kolonievorming assay

Voor kolonievorming test werden 200-cellen stabiel getransfecteerd met pCMV6-RPRM of pCMV6 lege vector. Cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium (Hyclone) en aangevuld met 10% FBS. Kweekmedium werden elke 24 uur. Kolonies werden gekleurd met 0,4% kristalviolet (Sigma) in 50% methanol, 21 dagen na de eerste zaaien, en telde bij 20 beelden genomen in het kader omgekeerde microscoop (Evos XL Core Cell Imaging System, Life Technologies). Elke transfectie werd in drievoud uitgevoerd. Bovendien werden repliceren experimenten uitgevoerd om verdere klonen voor expressie analyse te verkrijgen.

Anchorage-onafhankelijke groei assay

Anchorage-onafhankelijke celgroei werd geanalyseerd door het uitplaten 1% agarose bevattende 2x10 ^{5 cellen stabiel getransfecteerd met pCMV6-RPRM of pCMV6 lege vector in 6-well platen. De cellen werden gevoed wekelijks door bovenliggende verse zacht-agar oplossing en kolonies werden gefotografeerd na 4 weken incuberen. Het experiment werd in drievoud uitgevoerd.}

Statistische analyse

Spearman correlatie coëfficiënt werd berekend om de correlatie tussen RPRM methylatie en genexpressie niveaus analyseren. Categorische variabelen werden geanalyseerd met Pearson Chi-kwadraat test (tweezijdig), werd de p-waarde gecorrigeerd met behulp van een logistische regressie-analyse. Continue variabelen werden geanalyseerd met behulp van t Electronics Test en data Student's werd uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Kappa test werd gebruikt om de correlatie tussen de expressie en RPRM p73 expressie te analyseren. Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS versie 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistisch pakket en GraphPad Prism5 software (La Jolla, CA, Verenigde Staten). Alle waarden waren twee staart, met uitzondering van de Spearman rank correlatie. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0.05.

Resultaten

RPRM methylatie en expressie bij maagkanker cellijnen

Eerder wij en anderen hebben gemeld dat RPRM expressie kan worden hersteld door de demethyleringsmiddel 5-aza -2-deoxycytidine (Zie Ondersteunende informatie S3 en S4 figuren) [5,8,18]. Echter RPRM methylatie is zwak gecorreleerd met de expressie [18]. Om de associatie tussen RPRM promoter methylatie en genexpressie verder te beoordelen, de complete promoter regio RPRM gen werd geanalyseerd door DNA bisulfiet sequencing in vier GC cellijnen (AGS, SNU-1, KATO III en NCI-N87) (afbeelding 1A). Zo is de methylatiestatus van CpG posities 52, gelegen tussen -207 en 302 nucleotiden ten opzichte van de transcriptie startplaats (TSS), geanalyseerd. Deze analyse toont dichte methylatie in cellijnen AGS en SNU-1 (89,6% en 86%, respectievelijk), in vergelijking met KATO III en NCI-N87 (79,7% en 51,8%, respectievelijk) (p = 0,0002) (Fig 1B) . Vervolgens RPRM niveau van expressie werd bepaald met kwantitatieve RT-PCR. Lage RPRM genexpressie waargenomen in AGS en SNU-1 vergeleken met KATO III en NCI-cellijnen N87 (p < 0,0001) (Figuur 1C). Door Spearman correlatie analyse bleek werd significante negatieve correlatie gevonden tussen methylatie dichtheid en RPRM genexpressie (r = 1; p = 0,042) (figuur 1D). Tezamen bieden deze bevindingen suggereren dat methylatie van RPRM promotor gebied een cruciale rol in de regulatie van RPRM uitdrukking speelt.

RPRM methylatie en expressie bij maagkanker weefsels

Om eerdere gegevens in GC weefsels bevestigen , RPRM methylatie niveaus werden bepaald in 6 gepaarde tumor en NTAM samples. De resultaten geven aan hogere methylatie niveaus in tumor weefsel in vergelijking met NTAM weefsels (zie figuur 1E). Om de expressie van RPRM gen eiwitproduct onderzoeken GC weefsels IHC analyse uitgevoerd. Positieve RPRM expressie werd voornamelijk gezien in het cytoplasma van maagepitheelcellen. RPRM gen eiwitexpressie werd gedetecteerd in 75% (15/20) van NTAM weefsel monsters. Echter maar 25% (5/20) van tumormonsters toonde expressie van RPRM gen eiwitproduct (figuur 2). Deze verschillen zijn zeer significant (p = 0,001) en suggereren dat expressie van RPRM verloren in GC weefsels. Om de klinische betekenis van dit verlies van RPRM expressie een cohort van 114 GC gevallen werd geëvalueerd te evalueren. Verlies van RPRM expressie werd gevonden in 62% (71/114) van GC gevallen. Klinisch-pathologische correlaties RPRM expressie worden getoond in Tabel 1. Progressie van fase I GC stadium II-IV (p = 0,006) en lymfeknoop metastasen (p = 0,037) waren significant geassocieerd met verlies van expressie van gen RPRM eiwitproduct. Echter, logistische regressie-analyse blijkt dat slechts de progressie van fase I naar II-IV significant geassocieerd met het verlies van RPRM gen-proteïne product (p = 0,020).

Functionele test van RPRM bij maagkanker (vorming kolonie en ankerplaatsen -onafhankelijke groei)

Aangezien het verlies van RPRM expressie geassocieerd met GC en vooral met de progressie van trap I tot II-IV, kan een tumor suppressor rol RPRM aannemelijk. Daarom functionele assays zoals in vitro
kolonievorming en verankering-onafhankelijke groei assays werden uitgevoerd in AGS cel getransfecteerd met pCMV6 /RPRM (figuur 3A). Niet tot expressie AGS cellijnen getransfecteerd met expressieplasmiden RPRM een significant verminderd aantal kolonies in vergelijking met lege-vector getransfecteerde cellijnen getransfecteerd met lege vector pCMV6-pCMV6- (p < 0,05) (Figuur 3B). Het effect van RPRM overexpressie op verankering-onafhankelijke groei in zachte agar kolonie formatie test werd ook beoordeeld in stabiele getransfecteerde AGS cellijn klonen. Kolonies werden geteld na de eerste zaaien en incubatie in zachte agar gedurende 4 weken. Cellen die met lege vector vertoonden sterke kolonie groei van het aantal en de grootte van de kolonies. Dit is aanzienlijk verminderd wanneer RPRM werd opnieuw gebracht in AGS cellen (Figuur 3C).

Vereniging RPRM expressie en p53 /p73 tumor suppressor eiwitfamilie bij maagkanker

RPRM is gedefinieerd als een p53-gemedieerde gen in embryonale fibroblast cellen [18]. Er is echter gerapporteerd dat regulering van expressie RPRM onafhankelijk van p53-gen staat mogelijk in neuronale cellen behandeld met koper [19]. Anderzijds kan de p73 transcriptie van p53-responsieve genen [20] te activeren. Rekening houdend met deze instelling, evalueerden we de expressie van p53 en andere leden van het p53-eiwit familie, p73 TSG. Expressie van p53 in de kernen van cellen maagslijmvlies. Positieve p53 expressie werd gedetecteerd in 23,5% (20/114) van GC gevallen. Slechts tumorgrootte werd geassocieerd met de expressie van p53 (p = 0,035, zie tabel 2). Expressie van p73 werd in de celkern en cytoplasma van epitheelcellen. Positieve p73 expressie werd gevonden in 30,6% (34/114) van GC monsters. Interessant significant klinisch-correlaties van p73 expressie werden geassocieerd met invasieve fase (fase I 55,6%, 10/18 tot stadium II-IV 25,8%, 24/93, p = 0,012) en lymfeknoop metastasen (p = 0,038) (Tabel 2 ). Sinds het verlies van expressie van RPRM en p73-gen eiwitproducten hebben soortgelijke clinicopathologische correlaties, evalueerden we associatie tussen uitingen van niveaus van beide eiwitten. Hiertoe gevallen werden gescheiden in vier groepen op basis van de expressie van p73 en RPRM eiwitproducten. De analyse toonde aan dat 22 van 111 GC gevallen waren positief voor zowel RPRM en p73-eiwitten, terwijl 57 uit 111 negatief waren. Deze associatie was statistisch significant (p < 0,0001). Met een kappa waarde van 0,363 (tabel 3)

Discussie

RPRM is een sterk geglycosyleerd eiwit cytoplasmatisch, aanvankelijk geïdentificeerd als een stroomafwaartse effector van p53 geïnduceerde celcyclus in G2 /M. Eerder is voorgesteld dat RPRM wordt gedempt door promotor-methylering, hoewel het zwak gecorreleerd met expressie [5,8]. Daarnaast is RPRM voorgesteld als potentieel tumor suppressor gen in niercelcarcinoom en hypofysetumoren [5,6]. In deze studie hebben we aangetoond dat RPRM genexpressie sterk geassocieerd met promotorgebied methylatiestatus suggereert epigenetische inactivatie van RPRM genexpressie. Bovendien tonen wij dat RPRM gen eiwitproduct werd verminderd in vergelijking met GC weefsel kankerachtige maagslijmvlies. Deze resultaten zijn vergelijkbaar met die van Luo et al
. [11], die verlies van RPRM in GC gerapporteerd in vergelijking met maagzweer weefselmonsters. Verder onze bevinding betrekking verlies van expressie van RPRM in de overgang van fase I naar fase II-IV is klinisch relevant. Luo et al
. [11] rapporteerden een vergelijkbare bevinding, maar in een klein aantal gevallen GC stadium I (n = 15). Deze bevindingen kunnen klinische significantie als een voorspellende factor voor de voortgang van GC hebben. Dienovereenkomstig met dit verlies aan RPRM expressie in de progressie van GC, onze functionele assays (vorming en verankering-onafhankelijke groei kolonie) voorgesteld potentieel tumor suppressor rol RPRM GC.

Hoewel p53 aanvankelijk beschreven als een RPRM spoel [10], klinische studies uitgevoerd up-to-date zijn niet in staat om een ​​dergelijke conclusie [6,18] bevestigen geweest. Hier hebben we vastgesteld dat het verlies van RPRM expressie correleert met het verlies van de expressie van een ander lid van de p53 familie, p73. Hoewel p73 TSG is vastgesteld op een zeer laag niveau in normale humane weefsels [21], tot overexpressie wordt gebracht in vele menselijke kankers zoals borst-, neuroblastoom, longen, slokdarm, maag, colon, eierstokken en blaas [14,22]. Daarnaast is gerapporteerd dat p73 de transcriptie van p53-responsieve genen, waaronder p21waf1 /Cip1, bax, mdm2, cycline-G, GADD45 en IGFBP3 [20] activeert. Dus, op basis van onze bevindingen, stellen wij voor dat RPRM expressie kan worden gereguleerd door p73 in een p53-onafhankelijke wijze.

In het kort, onze gegevens suggereren dat epigenetische silencing van RPRM-gen door promoter methylatie wordt geassocieerd met het verlies van RPRM expressie en derhalve functionele testen voorgesteld potentieel tumor suppressor rol van RPRM in GC. In klinische monsters wordt RPRM verloren invasieve stadia van GC en de expressie correleert met die van p73 suggereert dat andere leden van de p53-genfamilie kan deelnemen aan de regulatie van expressie RPRM. Verder onderzoek is geboden om de rol van RPRM in de progressie van GC karakteriseren en valideren van de biologische regulering van RPRM door p73.

Ondersteunende informatie
S1 Data. . De gegevens die ten grondslag liggen aan de studie
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s001
(ZIP)
S1 Fig. Effecten van Tunicamicyn op RPRM eiwit.
RPRM is een sterk geglycosyleerd cytoplasmatisch eiwit gevisualiseerd tot 25 kD door Western Blot, de glycosylering remmer tunicamycine (TK) verdringt de 25 kD RPRM band tot en met 15 kD in AGS cellen met RPRM overexpressie (pCMV6 /RPRM) (RPRM voorspelde grootte 12 kD). Cellen werden gedurende 24 uur in RPMI1640 met 10% FBS, in aanwezigheid of afwezigheid van de remmer van N-glycosylering tunicamicyn (10 ng /ml). RPRM expressie werd bepaald door Western blotting onder toepassing van een RPRM polyklonaal antilichaam (bovenste paneel, verdunning 1: 1000, Sigma-Aldrich). De expressie van β-actine (onderste paneel, verdunning 1: 2000, Santa Cruz) vertegenwoordigt eiwit laden
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s002
(TIF)
S2 Afb. Lokalisatie van RPRM expressie in overexpressie AGS cellijn Immunofluorescentie van RPRM bij maagkanker AGS-cellijn getransfecteerd met pCMV6 codeert RPRM.
24 uur na transfectie werden de cellen gefixeerd in paraformaldehyde 4% en geïncubeerd met anti-RPRM-konijn (1 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) en secundaire antilichaam Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). Een positieve uitdrukking van RPRM (GREEN) wordt voornamelijk gezien in het cytoplasma. Beelden werden vastgelegd met behulp van Axio Vision4 multichannel software in fluorescentie microscoop Axio Scope.A1- Zeiss
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s003
(TIF)
S3 Fig. RPRM expressie wordt het zwijgen opgelegd door promoter methylering. Hotels A) RT-PCR-analyse van RPRM mRNA expressie in AGS maagkanker cellijn met en zonder de DNA-methylatie inhibitor 5-azacytidine (1 uM gedurende 72 uur). GAPDH werd gebruikt als controle. B) Versterking van RPRM door Methylatie Specifieke PCR in AGS maagkanker cellijn. Amplificatie van gemethyleerde MYOD1 werd als controle. AGS cellijn werd gemethyleerd in de promoter regio. NC: negatieve controle
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s004
(TIF)
S4 Fig. RPRM expressie wordt het zwijgen opgelegd door promoter methylering (origineel gel). Hotels A) RT-PCR-analyse van RPRM mRNA expressie in AGS maagkanker cellijn met en zonder de DNA-methylatie inhibitor 5-azacytidine (1 uM gedurende 72 uur). GAPDH werd gebruikt als controle. B) Versterking van RPRM door Methylatie Specifieke PCR in AGS maagkanker cellijn. Amplificatie van gemethyleerde MYOD1 werd als controle. AGS cellijn werd gemethyleerd in de promoter regio. NC:. Negatieve controle
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s005
(TIFF)

Dankwoord

Wij willen Sabina Magedson bedanken voor haar bijdrage in de bouw weefsel Microarrays. We willen ook graag Hiroshi Kawachi bedanken voor histologische beoordeling van de gevallen, Ignacio Wichmann voor hun waardevolle commentaar op onze manuscript en Oslando Padilla voor zijn belangrijke steun in de statistische analyse.

• PLoS ONE: affiniteitsrijping monoklonaal antilichaam 1E11 door Gerichte randomisatie in CDR3 regio optimaliseert therapeutisch antilichaam Targeting van HER2-positieve maagkanker
• PLoS ONE: Chrysin Remt Tumor-Promoter Induced MMP-9 Expressie door het blokkeren van AP-1 via Onderdrukking van ERK en JNK Pathways bij maagkanker Cells