abstraktné
Pozadie
mikroRNA (miRNA) sú široko študované nekódujúca RNA, ktoré modulujú génovú expresiu. Mierny sú deregulované v rôznych nádorov vrátane rakoviny žalúdka (GC) a majú potenciálne diagnostické a prognostické dôsledky. Cieľom štúdie bolo zistiť, miRNA profil GC tkaniva, s následným hodnotením deregulovaných miRNA v plazme pacientov GC. Použitie dostupných databáz a bioinformatika metódy sme tiež za cieľ vyhodnotiť potenciálne cieľové gény potvrdenej rozdielne vyjadrené miRNA a overiť tieto poznatky v GC tkanivách.
Do štúdie bolo zahrnutých 51 pacientov GC a 51 kontrol. Spočiatku sme screening miRNA profil expresie v 13 vzorkách tkaniva z GC a 12 normálne žalúdočné tkaniva s nízkou hustotou TaqMan pole (TLDA). V druhom stupni, rozdielne exprimované miRNA boli overené v replikácie kohorty pomocou QRT-PCR v tkanív a plazmy. Následne sme analyzovali potenciálne cieľové gény deregulovaných miRNA pomocou bioinformatiky prístup, ktorý určuje ich vyjadrenie v GC tkanivách a vykonal porovnávaciu analýzu so zameraním miRNA.
Profilovanie s TLDA odhalila 15 deregulované miRNA v GC tkaniva v porovnaní s normálnou žalúdočnú sliznicu. Analýza replikácie potvrdila, že mier-148a-3p, MIR-204-5p, mier-223-3p a mier-375 boli dôsledne deregulované v GC tkanivách. Analýza vzoriek plazmy GC pacientov vykazovali významný down-reguláciu MIR-148a-3P MIR-375 a up-reguláciu MIR-223-3p v porovnaní so zdravými jedincami. Ďalej, pomocou bioinformatiky nástroje, ktoré možno identifikovať ciele replikovaných miRNA a vykonal choroby spojené s analýzou génu obohatenia. Nakoniec sme hodnotili potenciálny cieľový gén BCL2 stroje a DNMT3B Naša štúdia ukázala, miRNA profil GC tkanivách a ukázal, že mier-148a-3p, mier-223-3p a mier-375 sú deregulované vo vzorkách GC plazmy, ale tieto cirkulujúci miRNA ukázali relatívne slabý diagnostický výkon ako jediný biomarkerov. Cieľový gén analýza ukázala, že BCL2 stroje a DNMT3B Citácia :. Juzėnas S, Saltenienė V, Kupcinskas J, prepojiť , Kiudelis G, Jonaitis L, et al. (2015) Analýza deregulovaný mikroRNA a ich cieľových génov v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10,1371 /journal.pone.0132327 Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, Spojené štáty prijatá: 22. apríla 2015, Prijaté: 13.června 2015; Uverejnené: 14.července 2015 Copyright: © 2015 Juzėnas et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory Financovanie :. Toto dielo JK, LJ, Siju, LK, JS bol podporený Európskym sociálnym fondom č VP1-3.1-SMM-07-k-01 -156. Práca PM je podporovaná nemeckým Spolkovým ministerstvom pre vzdelávanie a výskum v ERA-Net PathoGenoMics. Grant No: BMBF-0315905D. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú Úvod objav mikroRNA (miRNA) a stanovenie ich úloha v molekulárnych dráh prinieslo veľký pokrok v molekulárnej biológii [1] [2]. Tieto malé nekódujúca RNA zložené z ~ 22bp sú zapojené do post-transkripčný regulácia génovej expresie. Mierne sa vyznačujú vysokou stabilitou v biologických vzoriek tvoriacich tieto molekuly atraktívny cieľ v biomarker oblasti výskumu [3] [4]. Hromadia sa dôkazy ukazujú, že miRNA sú zapojené do hlavných karcinogenézy dráh [5]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že deregulácia miRNA sa vyskytuje prakticky vo všetkých hlavných typov rakoviny [5], [6]. Okrem toho, miRNA bolo preukázané, že majú diagnostický alebo prognostický úlohu a dokonca aj potenciálne klinické dôsledky pre cielenú génovú terapiu u pacientov s rakovinou [7] [8]. Výskyt rakoviny žalúdka (GC) v západných krajinách má poklesla v posledných desaťročiach; Avšak, tento typ rakoviny stále tvoria takmer jeden milión nových prípadov ochorenia na celom svete a nesie veľmi vysokú úmrtnosť [9]. Nedávny výskum ukázal, GC mnoho nových poznatkov do vzniku tejto malignity. Avšak presné mechanizmy malígny transformácii zo Helicobacter pylori Zásadný role miRNA v GC bola preukázaná v rôznych štúdiách [12]. Volinia et al. poskytli jeden z prvých miRNA profily expresie v tkanive GC ukazuje konkrétny deregulačné vzorec [13]. Ďalšie štúdie tiež vykázali výrazný deregulácie miRNA, ktoré patria k MIR-17, MIR-21, MIR-223, mier-135 a mnoho iných rodín. Medzi publikovaných štúdií na GC tkanivách, Mir-21, MIR-25, MIR-92, MIR-223 boli najviac dôsledne up-regulované miRNA, zatiaľ čo Mir-375 a mier-148 boli najviac konzistentne down-regulované [14] [ ,,,0],15] [16]. Väčšina z týchto štúdií sa pozrel na miRNA profilu u pacientov s GC a spárované priľahlé normálne žalúdočnú sliznicu [14]. Dôležité štúdie ukázali, že miRNA sú už deregulované v raných fázach žalúdočnej karcinogenézy, vrátane H Cieľom našej štúdie bolo zistiť, miRNA profil GC tkanivách a porovnať ho s normálne zdravé žalúdočnej sliznice pomocou širokého pokrytie miRNA TaqMan nízku hustotu poľa. V ďalšej analýze sme sa zamerali overiť naše výsledky profilovanie v tkanivách a plazme viacej pacientov GC a zdravých kontrol európskeho pôvodu. Nakoniec sme hodnotili potenciálnych cieľových génov potvrdených rozdielne vyjadrené miRNA a vykonal ochorení asociačné gén obohatenie analýzu ich cieľových génov. Ethics vyhlásenie štúdia bola schválená Krajským pre biomedicínsky výskum etickou komisiou Kaunas (protokol č BE-2-10). Všetci pacienti podpísali informovaný súhlas formulár na účasť v štúdii. Tkanivové vzorky boli odobrané výhľadovo medzi rokmi 2011 a 2014 v departementoch gastroenterológie a chirurgia, Nemocnica litovského University of Health Sciences (Kaunas, Litva). Do štúdie bolo zaradených celkom 51 kontrolných orgánov a 51 pacientov GC, ktoré boli rozdelené do profilovanie (GC, n = 13; ovládacích prvkov, n = 12) a overovací kohorty (GC, n = 38; ovládacích prvkov, n = 39). Všetky predmety boli z európskeho pôvodu. Žalúdočné biopsie vzorky boli získané od antrálnej časti brucha od kontrolných orgánov, ktoré boli odoslané na hornom GI endoskopia kvôli dyspeptických príznakov, a preto nemal v anamnéze malignity. Vzorky GC tkaniva boli získané z chirurgických vzoriek bezprostredne po resekcii od pacientov, ktorí podstúpili chirurgický výkon pre GC bez predoperačné ožarovanie a chemoterapia. Adenokarcinóm žalúdka u pacientov s GC bola overená histologicky a bol klasifikovaný podľa Lauren do difúzna a črevnej typov [22]. H Príprava vzorky tkaniva a RNA extrakcia vzorky žalúdočné tkaniva boli uložené v RNAlater (Ambion, Austin , TX, USA) pri teplote + 4 ° C a 24 hodín neskôr, skladované pri teplote -80 ° C. 30 mg tkaniva sa homogenizuje v sterilnom stave pred úplnej izolácii RNA s Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) pre profilovanie štúdium a miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) pre overovaciu štúdiu, presne podľa inštrukcie výrobcov. Kvalita RNA bola hodnotená pomocou Nanodrop 2000 spektrofotometra (Thermo Scientific, USA). Kvalitatívne vyšetrenie integrity RNA bola vykonaná elektroforéza na agarózovom gélu (5%). Príprava vzorky plazmy a RNA extrakcia Vzorky plazmy boli odobraté od zdravia pacientov a pacientov s GC. Expresie miRNA v plazme kohorta obsahuje vzoriek plazmy od 38 pacientov s rakovinou žalúdka a 39 zdravých dobrovoľníkov. Žilová krv bola odobratá do EDTA antikoagulačnej elektrónok a bol centrifugován pri 3500 otáčkach za minútu po dobu 15 minút pri teplote miestnosti; oddelí plazma sa prevedie do 1,5 ml skúmaviek a uloží sa do -80 ° C mrazničky na krátkodobé skladovanie. Svet malých RNA bola extrahovaná z 200 ul plazmy pomocou miRNeasy Serum /Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Mirna profilovanie bola vykonaná s TaqMan Array Mirny Card ľudského a v2.1, ktorý umožnil vyčísliť 377 ľudských miRNA katalogizované v miRBase V20 [23]. V stručnosti, 350 ng celkovej RNA bola spočiatku reverznej transkripcii pomocou Megaplex RT set bazén verzia 2.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) a 800 ul produktu cDNA potom bola nanesená na TaqMan Array Mirna Card Human a spustiť na VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Primárna analýza bola vykonaná pomocou VIIa 7 Software (Applied Biosystems) získať vyjadrenie, pokiaľ ide o Ct. Analýza dát bola vykonaná s použitím Bioconductor HTqPCR balíčku [24]. Mierne s hodnotou Ct > 37 boli považované za unamplified. Mierne, ktoré neboli amplifikovanej vo viac ako 25% vzoriek boli považované za chudobný exprimovaný, a teda vylúčené z ďalšej analýzy. Mirna výraz dáta boli normalizovať pomocou hodnosť nemenný normalizácie. NormFinder a GENOR algoritmy boli použité na identifikáciu referenčnej gén z dát TLDA pre overovacej štúdie [25]. Podľa algoritmov MIR-127-3p ukázalo najnižšie Ct rozptyl a bol vybraný ako referenčný gén pre validačné štúdie. Nedávne štúdie ukazujú, že hladiny expresie RNU6A a niektorých ďalších malých jadrových RNA, môže byť nestabilný v niektorých tkanivách a podmienkach a nemôže slúžiť ako najlepší referenčný gény, [26] [27] [28] [29]. Jedna nedávna publikácia tiež identifikoval MIR-127-3p ako dobrý kandidát pre výber referenčného génu [30]. reverznej transkripcie (RT ) reakcie boli vykonané za použitia TaqMan Mirna reverznej transkripcie Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) a miRNA-špecifických kmeňových RT-slučka priméry (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA). Singleplex reakcie boli vykonávané v objeme 7,5 ul. Každá reakcia zahŕňala 2.08 il nukleázám voľnej vody, 0,74 ul 10 x RT pufru, 0,08 ul dNTPs (100 mM), 1,5 ul 5 x miRNA špecifickej RT primery, 0,1 ul RNase inhibítor, 0,5 ul Multiscribe reverznej transkriptázy a fixné objem miRNA šablóna (2,5 ul). RT bola vykonaná v termocykléri za nasledujúcich podmienok: 16 Cislo C počas 30 minút, 42 ° C počas 45 minút a 85 ° C počas 5 minút, po ktorom nasleduje priestoru pri teplote 4 ° C TaqMan reálne. -time PCR reakcie boli vykonané v duplicitných reakciách obsahujúcich 6,25 ul TaqMan 2 × Universal PCR master mix s No AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) 0,625 ul 20 x miRNA-špecifický primer a sonda mix Kit TaqMan Mirna puncového (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA), 3 ul reverznej transkripcie produktu a 2.625 ul nukleázy voľnej vody. RT-PCR bola vykonaná s použitím 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) za nasledujúcich podmienok: 95 ° C počas 10 minút, potom 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd, 60 ° C počas 60 s, nasleduje držaním pri 4 ° C. Každá vzorka bol spustený v dvoch vyhotoveniach. Dáta boli analyzované s automatickým nastavením pre priradenie základnej línie, a priemerná Ct a SD hodnoty boli vypočítané. Hladina expresie miRNA v tkanive bola normalizovala Mir-127-3p a úroveň expresie v plazme bola normalizovala na HSA-MIR-16-5p. Výsledky boli vypočítané metódou ΔΔCT [31]. Dáta boli analyzované s automatickým nastavením pre priradenie základnej línie, a priemerné hodnoty Ct a SD boli vypočítané. cDNA pre BCL2 stroje a DNMT3B zoznamy schválených cieľových génov kandidátskych miRNA boli získané z miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) a miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) databáz. Údaje o pridružení medzi génmi a ochorenia boli získané z databázy DisGeNET (http://www.disgenet.org/~~HEAD=pobj). Aby bolo možné určiť GC-spojených génov, termín "adenokarcinóme žalúdka" (UMLS: C0278701), bol použitý ako dotaz na databázu. Biologické siete boli vytvorené pomocou Cytoscape v3.2 open-source softvér s aplikáciou CyTargetLinker [32]. V klinickej charakteristiky medzi skupinami boli porovnané pomocou χ Mirna expresie profilovanie GC a zdravé žalúdočnej sliznice tkaniva TLDA TaqMan Human miRNA s nízkou hustotou pole analýza bola vykonaná na identifikáciu kandidátnych miRNA, ktoré vykazujú zmenenú expresiu v žalúdočnej rakoviny tkaniva. Tkanivové miRNA profily od pacientov s GC sa porovnali s profilmi žalúdočnej sliznice od zdravých jedincov. Po filtrácii za nízkych bohaté miRNA (Ct hodnota > 37 a non-zistiteľných vo viac ako 25% vzoriek), sada 193 miRNA (z celkových 377) zostal na ďalšiu analýzu. Porovnanie rakovinové tkanive v porovnaní s normálnou označené 15 rozdielne exprimovaných miRNA, z ktorých 7 sa up-regulované a 8 boli down-regulované s FDR upraví hodnota p < 0,01 a zložiť zmenu zlúčenina, 2 (tabuľka 2). Výsledky sú demonštrované v sopky pozemku (obr.1). Medzi nimi, 6 miRNA (MIR-135a-5p, MIR-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-375, mier-223-3p a mier-155-5p), ktorý má najvyššiu dôležitosť a zložiť zmenu hodnôt, boli vybrané pre overovaciu štúdiu. Hierarchickej zhlukovaniu v euklidovskej vzdialenosti vybraných miRNA normalizovaná expresia dát odhalila dve podskupiny: jeden zodpovedajúce kontrolnou skupinou a druhý zodpovedajúci najmä do skupiny pacientov. (Obr.2). šiestich kandidátnych miRNA vybraných na overenie boli kvantifikované pomocou QRT-PCR. Pre výber referenčného génu boli dáta TLDA analyzujú za použitia dvoch rôznych algoritmov (NormFinder a GENOR) pre identifikáciu referenčných génov. Mir-127-3p ukázal najvyšší výraz stability naprieč všetkými vzoriek v dátach TLDA a kvôli tejto funkcie MIR-127-3p bol vybraný ako referenčný gén pre normalizáciu dát qPCR. Hladiny expresie MIR-148a-3P, MIR-204-5p, mier-223-3p a mier-375 vykazovali významné diferenciálnej expresii v rovnakom smere, ako v štúdii objavu (FDR upraveného p menšie ako 0,05), zatiaľ čo žiadne významné rozdiely boli detekované v expresných hladín Mir-135a-5p a mier-155-5p (FDR upraví pri p 0,05; obrázok 3) Plasma miRNA potenciálnych biomarkerov rakoviny žalúdka cieľový gén predikcie Ak chcete ďalej skúmať možných cieľov MIR-148a-3P MIR-204-5p, Mir-223- 3p a mier-375, všetky ich experimentálne overených miRNA-cieľových interakcie boli získané z dvoch rôznych databázach (miRTarbase a miRecords). Dáta boli vizualizované v Cytoscape ako biologický siete, ktorý obsahuje všetky z uvedených miRNA a ich cieľové interakcií (obrázok 5). Každá interakcia v sieti sa skladala z dvoch uzlov, regulačné miRNA uzol (červená) a cieľovej mRNA uzla (ružová) pripojený cez jeden smerujúci hrane. Celkovo možno povedať, sieť zahŕňala 593 overených cieľov, 419 z nich priradená MIR-375, 88 priradená MIR-204-5p, 83 priradená MIR-148a-3P a 21 priradený Mir-223-3p. Analýza ukázala, že sieť MIR-148a-3p a mier-375 bolo šesť spoločných cieľov (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 a RAB10), mier-204-5p a mier-375 tiež mal šesť spoločných cieľov (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 a IL1RAP), mier-148a-3p a mier-204-5p mal dve spoločné ciele (AURKB a cdc25B), mier-223-3p a mier-148a-3p tiež mal dve zdieľané ciele (HSP90B1 a IRS1), mier-223-3p a mier-375 mal jednu zdieľaný cieľ (PARP1) a mir-148A-3P MIR-204-5p a mier-375 tiež mal jeden spoločný cieľ (bcl2). Cieľové gény, ktoré boli upravené súčasne dvoma alebo troma miRNA sú zastúpené v oranžovej a zelenej farby, v uvedenom poradí (obrázok 5). Aby bolo možné určiť, či choroby -associated gény boli významne obohatené v našej sade miRNA cieľov, bola vykonaná analýza obohatenie. Po prvé, zoznam gén bol získaný z databázy DisGeNet. Ako dotazu pre databázu sme použili termín "adenokarcinómom žalúdka" (UMLS: C0149826). Po odfiltrovaní Mirna, lncRNA a gény, ktoré neboli v miRTarbase a miRecords bolo identifikovaných 115 génov, ktoré majú byť spojené s GC. V sieťovej analýzy 20 génov GC-spojený sa prekrývali, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 a JAG1) z nich priradená MIR-375, 6 (IL8, MMP9, IL1B, CDX2, SERPINE1 a SPARC) priradená MIR-204 -5p, 4 (CDKN1B, APC, NR1I2 a CCKBR) priradená MIR-148a-3p a 2 (STMN1 a IGF1R) priradená MIR-223-3p. Cieľové gény, ktoré boli spojené s GC sú zastúpené v modrom (obr.5). Konečne, ochorenia súvisiace s analýza génu obohatenie sa vykonáva za použitia testu Hypergeometrické distribučnej báze, ktorá viedla na posúdenie, či je počet génov GC asociovaných je väčší, než sa očakávalo v sade cieľových génov vybraných miRNA. Obohatenie GC analýza ukázala, že spojené s génmi boli výrazne zastúpení (p menšie ako 0,05) v MIR-148a-3P, mier-204-5p a mier-223-3p, zatiaľ čo žiadne významné obohatenie bolo pozorované MIR 375 cieľových génov (p > 0,05) (tabuľka 3) BCL2 stroje a DNMT3B Diskusia Pozmenené Mirna expresné profily majú. boli hlásené u tkanív a krvných vzoriek GC [13] [20] [14] [38]. Niektoré z týchto deregulovaných miRNA boli spojené s prežitím, metastatického správanie nádoru a iných prvkov, klinicko-GC [39] [40]. Okrem toho bolo preukázané, miRNA regulovať rast nádoru ovplyvnením proliferácie, adhézie, migrácie a invázie v bunkových líniách GC [41]. Ešte dôležitejšie je, cieľové gény deregulovaných miRNA v GC sa zúčastňuje apoptózy, bunkového cyklu a ďalších kľúčových karcinogenézy dráh [12]. Z tohto dôvodu vyšetrovania miRNA a ich potenciálnych cieľových génov v GC môže slúžiť pre ďalší vývoj dôležitých diagnostických a liečebných alternatív. Je zrejmé, že miRNA sú hlavnými hráčmi v žalúdočnej karcinogenéze, ale stále chýba presné údaje o mechanizmy a potenciálnej klinickej aplikácie týchto molekúl v GC. Naša súčasná štúdie bolo určiť profil deregulovaných miRNA v GC tkaniva, hodnotí ich vo vzorkách plazmy a zhodnotiť potenciálne cieľové gény deregulovaných miRNA. Použitie TaqMan miRNA TLDA karty, zahŕňajúce 377 miRNA priméry, sme zistili, 15 rozdielne exprimovaných miRNA medzi rakovinové GC a zdravé žalúdočné tkanív. Osem miRNA boli down-regulované (let-7a-5p, dajte-7g-5p, Mir-26b-5p, MIR-30b-5P, MIR-135a-5p, MIR-148a-3p, MIR-204-5p, mier -375), zatiaľ čo sedem miRNA bola up-regulovaná (MIR-146B-5p, MIR-155-5p, MIR-214-3p, MIR-223-3p, MIR-224-5p, mier-331-3p a spätných 484). Naše výsledky profilovanie neodhalilo niektoré z bežne deregulovaných miRNA, ktoré boli predtým hlásených ako deregulované v iných štúdiách, vrátane MIR-21-5p, MIR-25-3p, MIR-92a-3P, MIR-29c-3P, a niektoré ďalšie [15] [19] [14]. Jedno z možných vysvetlení pre tieto chýbajúce miRNA by mohli byť spojené s veľmi prísnych štatistických kritérií, ktoré boli použité pre analýzu TLDA našich dát (FDR nastavenú hodnotu p < 0,01 a zložiť zmenu zlúčenina, 2). Okrem toho, niektoré úroveň rozdielu v miRNA profilovanie medzi výsledky štúdií by mohlo byť spôsobené rozdielmi v anatomickej polohe žalúdka, histologické subtypu, štatistické analýzy a to najmä profilovanie metódy [18]. Štúdia Mestdagh et al. ukazuje, že rôzne platformy miRNA profilovanie majú rôzne sadzby detekcie, špecifickosti a reprodukovateľnosti, a že najvhodnejšie platformou by mal byť vybraný na základe laboratórnych podmienkach a konkrétnych výskumných otázok (Mestdagh et al., 2014). v druhej etape našej štúdii sme použili QRT-PCR v kohorte replikácie, vrátane šiestich najviac deregulovaných miRNA z tvarovacieho fáze (MIR-135a-5p, MIR-148a-3p, MIR-155-5p, MIR-204-5p Mir-223-3p a mier-375). Ukázali sme, že mier-148a-3p, MIR-204-5p, mier-223-3p a mier-375 boli dôsledne deregulované medzi normálnou a rakovinové tkanivá GC. Výsledky nášho replikácie kohorty sú podporované predchádzajúcimi správami. Niekoľko štúdií ukázalo, že mier-148a-3p významne down-regulované v bunkových líniách a GC vzoriek tkaniva v porovnaní so susednými normálne tkanive [42] [43]. Nízke hladiny expresie MIR-375 boli tiež uvádza štúdia, hypotézu, že mier-375 bolo spojené s žalúdočnej karcinogenéze [44] [16]. Zistili sme, že mier-223-3p bola významne up-regulovaný v GC tkanive v porovnaní s normálnou tkanív, ako je navrhnuté v niekoľkých predchádzajúcich správach [15] [19]. Mir-204-5p bola menej často hlásená u GC miRNA profilovanie štúdií; Avšak, naše výsledky sú v súlade s predchádzajúcou štúdiu, ktorá ukázala významné down-reguláciu tohto miRNA v GC tkanív a bunkových línií GC [45]. MIR-135a-5P expresie bola v GC tkanivách nižšie ako u kontrolných orgánov; Avšak, pozorované down-regulácia trend bol podobný ako v predchádzajúcich správach [15] a mohol by dosiahli požadované význam s väčším počtom osôb v rámci skupiny. Je potrebné zdôrazniť, že sme nenašli rozdiely pre mier-155-5p v našom replikácie kohorty porovnávajúce kontrolných orgánov a pacientov GC. S najväčšou pravdepodobnosťou toto zistenie súvisí s tým, že v počiatočnej profilovanie kohorty, kontrolné orgány boli H Ak chcete skúmať potenciálnu úlohu odlišne exprimovaných miRNA ako biomarkery GC sme analyzovali deregulovaný miRNA v vzorky plazmy. Cirkulujúci miRNA, najmä kombinácia viacerých miRNA, sa môžu prejavovať ako sľubné biologické markery pre diagnózu gastrointestinálnych nádorov [21]. Štúdia Zhu et al. preukázali, že panel piatich miRNA môže slúžiť ako potenciálny biomarker na detekciu skorej fáze GC [47]. K dnešnému dňu hlásených Mirna profily GC sére alebo plazme u samostatných štúdiách [21] značne líšia.
expresie QRT-PCR v GC tkanive, čo koreluje s miRNA zacielenia výraz.
Závery
výraz v GC tkanive korelovala s ich výrazu zacielenia miRNA
( H
. pylori
) infekcia chronickou atrofickou gastritídu, črevné metaplázia a GC je ešte úboho dohodnutá [10 ]. Aktuálne hypotéza vývoja GC zahŕňa kombinované účinky bakteriálneho, hostiteľom a nutričných faktorov; Avšak, k dnešnému dňu, táto teória navrhne veľmi málo klinicky zdravé translačný dôsledky [11]. Väčšina prípadov GC je diagnostikovaná v neskorých štádiách choroby, ktorá je spojená so zlými výsledkami pacientov. Preto je jedným z hlavných zameriava GC výskumu je zhodnotenie možných molekulárnych biomarkerov, ktoré by mohli byť použité pre skoré neinvazívnu diagnostike tejto malignity.
. pylori
gastritídu a premalígne etapy žalúdočné atrofia a intestinálnej metaplázia [17] [18]. Je zaujímavé, že niektoré miRNA majú opačný smer deregulácie v prítomnosti GC, ako samostatné štúdie profilovanie ukazujú významný rozdiel medzi deregulovaných miRNA [14]. Mir-9 bolo zistené, že up-regulované v dvoch štúdiách [15] [19], zatiaľ čo ďalšie dva dokumenty ukázali významné down-reguláciu tohto miRNA v GC tkanív [13] [20]. Tieto rozdiely týkajúce opačnej výsledky deregulácii pre mier-9 a mnoho ďalších miRNA sú pravdepodobne spojené s rozdielmi v anatomické miesto GC, histologické subtypu, štádiu ochorenia, profilovanie platformy, štatistické analýzy a mnoho ďalších možných mätúcich faktorov. Okrem toho, že väčšina aktuálne zverejnených štúdií o miRNA profile v GC tkanivách pokrytie predmety z ázijských krajín; Medzitým, údaje o európskych pacientov GC je stále málo [21].
materiáloch a metódach
Štúdium populácie
. pylori
stav bol hodnotený v GC a kontrolných orgánov za nepriameho testu ELISA na zistenie sérové IgG špecifických pre antigén (Virion /Serion GmbH, Wünrzburg, Nemecko). Klinické a patologické charakteristiky kohorty pacientov, vrátane veku, pohlavia a fáze ochorenia sú zhrnuté v tabuľke 1.
Mirna profilovanie s použitím TaqMan Low Density-Array
Kvantitatívne reverznej transkripcie PCR (PCR) qRT-
analýza génovej expresie bola syntetizovaná z 500 ng RNA za použitia High-Capacity cDNA reverznej transkripcie Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA). Singleplex reakcie boli vykonávané v objeme 7,5 ul. Každá reakcia zahŕňala 2,1 ul nukleázám voľnej vody, 1 ul 10 x RT pufru, 0,4 ul dNTPs (100 mM), 1 ul 10 x RT Náhodné priméry, 0,5 ul Multiscribe reverznej transkriptázy a stály objem miRNA šablóny (2,5 ul). RT-PCR bola vykonaná v termocykléri za nasledujúcich podmienok: 25 ° C počas 10 minút, 37 ° C počas 120 minút a 85 ° C po dobu 5 minút, nasleduje priestoru pri teplote 4 ° C. Predtým, než boli qPCR cDNA vzorky pomere 1: 1 s nukleázy voľnej vody a 2 ul používaný v 10,5 ul RT-qPCR reakcia spolu s 6,25 ul 2x TaqMan Fast Universal Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA), 0,625 ul 20x TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) a 3,625 ul sterilnej vody. RT-qPCR testy boli vykonané v troch opakovaniach na 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) za nasledujúcich podmienok: 95 ° C počas 10 minút, potom 40 cyklov 95 ° C počas 15 s, 60 ° C počas 60 s, nasleduje držaním pri 4 ° C. Hladiny expresie bcl2 stroje a DNMT3B
v tkanive je normalizované na ACTB
.
cieľový gén sieť analýza
Štatistická analýza
2 test a Fisherov presný test pre kvalitatívne údaje, a t-test pre kvantitatívne údaje. Dáta TLDA bola analyzovaná za použitia t-testu a po korekcii Benjamin Hochberg na falošnú zisťovanie rýchlosťou, že diferenciálnej expresie bola považovaná za významnú, sa P < 0.01. Dáta boli normalizovať pomocou pozičné invariantní normalizáciu [33] a analyzované pomocou balíčka HTqPCR. Validácie a plazmové qPCR expresie dáta boli analyzované za použitia neparametrické Mann-Whitneyho U-testu. Benjamín Hochberg Upravená p < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Pre dáta QRT-PCR, relatívna úrovne expresie každý cieľ miRNA (log2 relatívna úroveň) boli vypočítané podľa rozdielu hodnôt CT medzi cieľovými miRNA a mier-127-3p vo vzorkách tkanív a mier-16-5p vo vzorkách plazmy (ΔCT) [34]. Hypergeometrické test bol použitý pre GC-analýzy spojené cieľovej obohatenie. Prijímač prevádzkové charakteristiky (ROC) krivka bola vytvorená pre každý miRNA použitie dát ΔCT. Plocha pod hodnotou krivkou (AUC) a 95% intervaly spoľahlivosti (CI) boli vypočítané na stanovenie špecificity a senzitivity. Analyzovať diagnostickú hodnotu kombinovaných zmien plazmatické hladiny miRNA, bol použitý jednorozmerné expresie génu priemerný algoritmus [35]. ROC krivky boli vytvorené s použitím ROCR balíka [36]. Všetky dátové analýzy boli vykonané pomocou R verzie 3.1.1 softvér.
Výsledky
validácia Mirna v GC a zdravé žalúdočnej sliznice tkanivo s QRT-PCR
choroba spojená s génom obohacovania analýza
nadmernej expresie a inverzný korelácia s zacielenie miRNA v žalúdočných rakovinových tkanív
ako domnelého cieľ pre mier-148a-3P MIR-204-5p a mier-375 a DNMT3B
pre mier-148a-3P a mier-375. Všetky tieto miRNA v našej štúdii sa zistilo, že down-regulované v žalúdočnej rakoviny tkaniva. Pre ďalšiu podporu týchto výsledkov, prvú analýzu expresie bcl2 stroje a bola vykonaná DNMT3B
gény. Údaje o QRT-PCR ukázala významné zvýšenie hladiny expresie oboch BCL2 stroje a DNMT3B
génov v žalúdočnej tkanive rakoviny. BCL2
vykázala 2,7-násobné zvýšenie, zatiaľ čo DNMT3B
mal 16,7-násobné zvýšenie hladín mRNA (obr 6). Korelačný analýza Pearsonov bola vykonaná s cieľom odhaliť vzťah medzi bcl2 stroje a DNMT3B
mRNA a ich zacielenie úrovne Mirna v normálnych a rakovinových žalúdočných tkanivách (obr 6). Inverzný korelácia bola pozorovaná u oboch predpokladanej DNMT3B
-targeting miRNA: Mir-375 (r = -0,49, p = 0,00001) a mier-148a-3p (r = -0,26, p = 0,0328) , Negatívna korelácia bola pozorovaná medzi BCL2 stroje a Mir-375 (r = -0.32, p = 0,0116), zatiaľ čo sa nezistila žiadna súvislosť medzi BCL2 stroje a Mir-148a-3p (r = -0,06; p = 0,6631), alebo BCL2 stroje a Mir-204-5p (r = -0,02; p = 0,8546)
. pylori
zadarmo, zatiaľ čo v sade replikácie, niektoré z kontrolných orgánov malo pozitívny sérologie na tejto baktériu. Je dobre známe, že mier-155-5p sa zúčastňuje zápalových dráh, vrátane H
. pylori
gastritídu [46]; Preto, to môže poskytnúť určité predpätie pre naše výsledky. Naše výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi štúdiu Link et al. (2015), kde je rozdiel v expresiu Mir-155 v biopsiách od GC v porovnaní s kontrolnou skupinou nebolo štatisticky významné [18]. Vo fáze replikácie našej miRNA profilovanie štúdii sme vybrali len šesť miRNA, ktorá ukázala najvyššiu biologickú relevanciu a štatistickú významnosť. Zhodli sme sa, že by bolo užitočné pozrieť sa na všetko výrazne deregulované miRNA a ktorá by mohla byť potenciálnym cieľom v ďalšom štúdiu.
Receptúra na báze kozieho mlieka je prospešná pre zdravie čriev dojčiat
Bežný genetický variant vysvetľuje, prečo imunoterapia pri Crohnovej chorobe často zlyhá
Strava s nízkym obsahom fermentovaných sacharidov zlepšuje kvalitu života pacientov s IBD
Kyslé pH zvyšuje infekciu SARS-CoV-2 up-reguláciou receptora ACE2
Vedci riešia záhadný prípad syndrómu automobilového pivovaru
Rastúce riziká biologickej obrany, ktoré predstavuje syntetická biológia
Nová štúdia ukazuje lepšie prežitie u pacientov s pokročilým kolorektálnym BRAF-mutantným karcinómom
Výsledky novej klinickej štúdie uverejnenej dnes v New England Journal of Medicine ukazujú, že použitie kombinácie troch liekov zameraných na špecifickú génovú mutáciu BRAF u pacientov s metastatick
Vedie hypertenzia vždy k závažnému ochoreniu COVID-19?
Spôsobené infekčným agensom, závažný akútny respiračný syndróm koronavírus 2 (SARS-CoV-2), koronavírusová choroba 2019 (COVID-19) je často závažnejšia u pacientov so základnými zdravotnými problémami-
Vedci dúfajú, že krvný test, ktorý presne diagnostikuje fibromyalgiu, bude k dispozícii do piatich rokov
Vedci zo Štátnej univerzity v Ohiu majú dôkaz, že vzorky krvi môžu spoľahlivo odhaliť fibromyalgiu, choroba, ktorá je často nesprávne diagnostikovaná kvôli svojim všeobecným symptómom, ktoré charakter