Pozadie
galektinu-3 je známe, že regulovať nádorových metastáz. Avšak, nebol definovaný základný mechanizmus. Prostredníctvom štúdií DNA microarray po galektinu-3 a umlčanie, tu Preukázali sme, že galektin-3 hrá kľúčovú úlohu v up-reguláciu výrazy proteázy-activated receptor-1 (PAR-1) a matrix metaloproteinázy-1 (MMP-1) PAR-1 a tým podporovať žalúdočné nádorových metastáz.
Metodické /hlavných zistení
skúmali sme expresných hladín galektinu-3, PAR-1 a MMP-1 v žalúdočných tkanivách pacientov s nádorovým ochorením a tiež účinky umlčanie tieto proteíny so špecifickými siRNA a k ich nadmernou expresiou s použitím špecifických Lenti-vírusové konštrukty. Máme tiež zamestnaný zebrafish modelu embryí pre analýzu in vivo Závery /Význam galektinu-3 hrá kľúč role aktivácia povrchový receptor buniek cez výrobu proteázy a zvyšuje žalúdočnú nádorových metastáz. Galektinu-3 má potenciál slúžiť ako užitočný farmakologický cieľ pre prevenciu žalúdočných nádorových metastáz Citácia :. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Park SH, et al. (2011) galektinu-3 Uľahčuje pohyblivosť buniek v rakoviny žalúdka až regulujúca Protease-activated receptor-1 (PAR-1) a matrix metaloproteinázy-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10,1371 /journal.pone.0025103 Strih: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Francúzsko prijatá: May 18, 2011; Prijaté: 23 augusta 2011; Uverejnené: 22. septembra 2011 Copyright: © 2011 Kim et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané Financovanie :. Táto štúdia bola podporená National Cancer Center (NCC) republiky grantu Kórea (NCC-0910150 a NCC-0810060), inovatívne výskumného ústavu pre bunkovej terapie, Kórejská republika (A062260) a tento výskum bol podporovaný Basic442 Science Research Program skrze Národná nadácia pre výskum (NRF), financovaného Ministerstvom školstva, vedy a technológie (1031790-1), Kórejská republika. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú Úvod rakoviny, ktoré sa šíria (metastázovať) zo svojho pôvodného miesta na iné oblasti tela, sa nazývajú metastázujúcej rakoviny. metastázujúce karcinómy majú zlú prognózu a vysokú úmrtnosť [1]. Plné pochopenie biologickej mechanizmus (y) podieľajúce sa metastázy a racionálne prístupy k prevencii alebo kontrole metastáz môže viesť k praktickým prístupov pre zlepšenie miery prežitia pacientov postihnutých metastázujúcej rakoviny. V predchádzajúcich štúdiách sme zistili, že galektinu-3 zvyšuje karcinómu žalúdka pohyblivosti buniek až regulujúca Fascino-1, aktínu-zväzovanie cytoskeletálne proteín [2]. Galektinu-3 je 31 kDa sacharidy rozpoznávania proteín, podieľajúce sa na vzniku nádorov, rast nádorových buniek a metastáz [3], [4], [5] a jeho vysoká expresie v niekoľkých ľudských nádorov sa zistilo, že koreluje s zlé prognóze metastázujúcej rakoviny. Ak chcete objasniť úlohu galektinu-3 v nádorových metastáz, zrazil dole sme jeho expresiu v rakovinových bunkách žalúdka pomocou jeho siRNA a skúmal výsledky v génovej expresie analýzou DNA mikročipov [6]. Medzi predchádzajúcich výsledkov sme zistili, významné zníženie úrovne proteázy-activated receptor-1 (PAR-1), člen rodiny transmembránových G-proteínom spojený receptorov [7], a jeho aktivátora, matričnej metaloproteinázy-1 ( MMP-1) (obr S1). Rozštiepený PAR-1 je auto-fosforylovaný a transdukovány extracelulárnym signálom (y) prostredníctvom rôznych ciest, a hrá rozhodujúcu úlohu v nádorových metastáz [7], [8], [9]. Nadmerná expresia PAR-1 bola popísaná v niekoľkých nádorov, vrátane melanómu, rakoviny prsníka a rakoviny žalúdka. MMP-1 sa tiež up-regulovaný v širokej palete pokročilých nádorov, a významná negatívna korelácia bola pozorovaná medzi jeho expresie a prežitie pacientov [10], [11], [12], [13]. Tiež zistil, niekoľko štúdií, že MMP-1 hrá kľúčovú úlohu v metastázovanie karcinómu prsníka [14], pečene a hrubého čreva [15], a karcinómov žalúdka [16], [17], medzi ostatnými. Zdá sa, že raz vylučovaný, MMP-1 podporuje rakovinová bunka inváziu cez degradácie extracelulárnej matrice a /alebo submukóznymi vrstiev lymfatického systému [10], [14]. Početné štúdie preukázali, že inhibícia MMP vedie k inhibícii invázie buniek [18], [19]. ieto výsledky nás viedli k hypotéze, že galektin-3, PAR-1 a MMP-1 sa môže zúčastniť zvyšovanie migrácii a invázii karcinómu žalúdka. Pre testovanie tejto hypotézy sme vykonali štúdie pre ich úlohu v rakovinových bunkách žalúdka. V oboch in vitro stroje a in vivo Vypnutie galektinu -3 alebo PAR-1 znižuje migráciu a inváziu buniek ľudského karcinómu žalúdka hladiny expresie galektinu-3 a PAR-1 boli vysoká vo väčšine žalúdočných nádorových bunkových línií. umlčaný sme galektinu-3 a PAR-1 v MKCH 28-bunkách používajúceho príslušné siRNA. Liečba galektinu-3 siRNA zníženej hladiny expresie oboch galektinu-3 a PAR-1, vzhľadom k tomu, PAR-1 ošetrenie siRNA sa znížila iba PAR-1 expresiu, keď nebol pozorovaný žiadny rozdiel v galektinu-3 (obrázok 1A). Transfekcia SNU-638 buniek, ktoré pôvodne prázdne žiadna expresie galektinu-3, s galektinu-3-plazmid kódujúci viedlo k zvýšenej expresiu oboch PAR-1 a galektinu-3 (obrázok 1B). Tlmenie hluku buď galektinu-3 alebo PAR-1 znížila celkový počet migrujúcich ( p Hotel &0,001) (obrázok 1C) a inváziu buniek ( p Hotel &0,001) (obrázok 1D), takmer o polovicu. Tieto dáta ukazujú, že galektin-3 zvýšila PAR-1 expresie a jednak z galektinu-3 a PAR-1 modulované žalúdočné migráciu nádorových buniek a inváziu. sme skúmali vzťah medzi galektinu-3-indukovanej zvýšenie bunkovej migrácie a invázie na jednej strane a PAR-1 expresie na strane druhej. infikované sme SNU638 bunky s lentivirus, ktorý obsahuje expresné kazetu galektinu-3, a skúmal výrazy galektinu-3 a PAR-1, a namerané migráciu buniek. Zistili sme, že sa v priebehu expresie galektinu-3 sprevádzaný zvýšenými PAR-1 mRNA a proteín výrazy (Obrázok 2A), ako aj migráciu buniek ( p Hotel &0,001) (obrázok 2B) a invázie buniek ( p Hotel < 0,001) činnosti (Obrázok 2C). Tieto nárasty boli znížené o PAR-1 umlčania. Tieto výsledky naznačujú, že galektin-3 podporoval migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom up-regulácia PAR-1. a potom sa pokúsil objasniť, ako galektinu-3 reguluje PAR-1 výraz. Vzhľadom na to, že bolo oznámené, že AP-1 transkripčný aktivita je regulovaná galektinu-3 [20], sme sa zamerali na úlohu tohto transkripčného faktora v tejto oblasti (pozri obrázok 2D). Vykonali sme imunoprecipitačních štúdie a zistili, že galektinu-3 priamo v styku s oboma Fra-1, a c-Jun v komplexe AP-1, a že táto interakcia je spojená s up-reguláciou AP-1 transkripčný aktivity (obrázok 2E). Ďalej sme skúmali väzbovú aktivitu DNA AP-1 s alebo bez galektinu-3 čipom testoch (obr 2f). Zistili sme, že AP-1 komplex viaže promótor PAR-1 v prítomnosti galektinu-3, ale nie v jeho neprítomnosti. Tiež hodnotená transkripčné aktivitu AP-1 luciferasovou skúškou po transfekciu reportérovým plazmidom obsahujúcim AP-1 väzbové sekvenciu pred luciferázy-hnacie minimálneho promotora v LacZ alebo galektinu-3 s nadmernou expresiou sna-638 buniek ( p Hotel <0,001) (obr 2G). Transkripční aktivitu AP-1 významne zvýšil v galektinu-3 v priebehu-exprimujúce bunky, ale nie viac ako LacZ-exprimujúcich buniek. Tieto výsledky naznačujú, že galektin-3 uľahčená väzba promótorom PAR-1 interakcií s AP-1 komplex, čím sa zvyšuje PAR-1 expresiu reguláciu transkripcie. MMP-1 bola označená na reguláciu PAR-1 aktiváciu prostredníctvom štiepením PAR-1 priviazané intracelulárnej signalizácie, a ovplyvňovať invázie buniek [21]. Ako je uvedené na obrázku S1 sme ukázali, že galektin-3 regulované MMP-1 expresie. Z tohto dôvodu sme potvrdili vzájomné vzťahy galektinu-3, MMP-1 a PAR-1. Analyzovali sme úrovne expresie mRNA MMP-9, ktorý je po smere cieľom PAR-1 [8], po umlčanie galektinu-3, MMP-1 a PAR-1 individuálne (obrázok 3a). Kým galektinu-3 tlmenie hluku znižuje expresiu všetkých troch molekúl (MMP-1, PAR-1 a MMP-9), MMP-1 tlmenie hluku znížená len MMP-9 expresiu a nie z galektinu-3 a PAR-1. Je zaujímavé, že PAR-1 umlčanie produkoval rovnaké účinky ako MMP-1 umlčania. Tiež sme detekoval fosforylácii paxillinu cytoskeletu bielkovín (pY181), punc PAR-1 aktiváciu [22], [23]. Po umlčanie galektinu-3, MMP-1 a PAR-1 jednotlivo, phosphorylaion z paxillinu bola znížená, čo navrhol galektinu-3 tiež regulovať PAR-1 aktivity. Tiež sme kontrolovali zníženie MMP-9 aktivity po tlmenie hluku z galektinu-3, MMP-1 a PAR-1 individuálne (obrázok 3A). galektinu-3 s nadmernou expresiou SNU638 bunky vykazovali zvýšené hladiny expresie MMP -1 a PAR-1 proteín, ako aj ich mRNA, okrem fosforylovanej paxillinu (pY181). V týchto bunkách, MMP-1 tlmenie hluku znižuje fosforyláciu paxillinu bez toho aby sa zmenila expresia galektinu-3 alebo PAR-1 (obrázok 3B). Okrem toho, MMP-1 tlmenie hluku znížená invázie buniek, ktorá je spustená galektinu-3 v priebehu expresie ( p Hotel &0,001) (obrázok 3C), čo znamená, že galektin-3 zvyšuje MMP-1 expresie vedie k aktivácia PAR-1 signalizácia. Zvýšená expresia MMP-1, v nádorových bunkách zvyšuje invázie buniek prostredníctvom aktivácie PAR-1 signalizácia sme potvrdili, že up-regulácia MMP-1 podľa galektinu-3 je dôležité pre aktiváciu PAR-1 signalizácie a zvýšenej žalúdočnej rakovinové bunky inváziu. Lentivirus (pLECE3 vektor) obsahujúci MMP-1 expresné kazetu regulovaná promótorom CMV bol pripravený a infikované v AGS buniek karcinómu žalúdka (obrázok 4A-B). Ako sa dalo očakávať, MMP-1 nadmernej expresie zvyšuje invázie potenciál buniek karcinómu žalúdka, a PAR-1 tlmenie hluku významne zvrátiť toto zvýšenie ( p Hotel &0,001) (obrázok 4B). To bolo tiež potvrdené tým, že zvýšená expresia MMP-1, zvýšenú fosforylácii paxillinu, a že ďalšie umlčanie PAR-1 blokovaného také fosforylácie (Obrázok 4A). V MMP-1 exprimujúce bunky, galektinu-3 tlmenie hluku znižuje expresiu PAR-1, ale nie, že MMP-1, a tiež fosforylácii paxillinu a buniek invazívne potenciál (obrázok 4A-B). Tieto pozorovania naznačujú, že zvýšená expresia MMP-1 zvýšená invazívnosti nádorových buniek aktiváciou PAR-1 signalizácie. Vziať dohromady, tieto výsledky naznačujú, že galektin-3 zvýšila expresiu ako PAR-1 a MMP-1, a že zvýšené MMP-1 expresie aktivovanej PAR-1 signalizácia, čo, uľahčilo rakoviny invázie buniek. Tieto udalosti sú schematicky znázornené na obrázku 4C. Transgénnej zebrafish, Tg (kdrl: EGFP) s843 Prejavy galektinu-3, PAR-1 a MMP-1 sú zvýšené, paralelne, v malígnych tkanivách pacientov s karcinómom žalúdka Zistili sme, mRNA a úrovne expresie proteínov z galektinu-3, PAR-1 a MMP-1 v normálnych a malígnych tkanív 20 pacientov s rakovinou žalúdka, potom použité RT-PCR s použitím analyzátora obrazu J. Ako je znázornené na obrázku 5C a obr S3, 73,7% pacientov s rakovinou ukázala vyššie hladiny expresie galektinu-3 a 70% z nich vykazovali vyššie hladiny PAR-1 a MMP-1 v ich malígnych tkanivách ako v ich normálnych náprotivkov. Okrem toho, medzi galektinu 3-pozitívnych pacientov, 71,4% boli tiež PAR-1 pozitívne, zatiaľ čo 64,3% bolo tiež MMP-1 pozitívne (Obr 5D). Tieto údaje naznačujú, že je paralelné zvýšenie expresie galektinu-3, rovnako ako PAR-1 a MMP-1 v malígnych tkanivách žalúdku. Tiež sme zistili, že tieto proteíny spoločne lokalizované v oblastiach malígnych tkanivách a nie v non-malígnych oblastiach (obr 5c). Galektinu-3 bol prítomný ako v cytosolu a jadra, pričom PAR-1 a MMP-1 boli pozorované zvyčajne cytosolické a membránou v rovnakej oblasti (obrázok 5C). Tieto nálezy naznačujú, že obaja PAR-1 a MMP-1 výrazy významne koreluje s galctin-3 prejavu u pacientov s rakovinou žalúdka. Táto štúdia preukázala, že galektinu-3 zvýšenú žalúdočné migrácie rakovinových buniek a invázie. Mechanicky, to spojené galektinu-3, up-regulácia povrchového PAR-1 bunkového receptoru a aktivity MMP-1 proteázy. To je v súlade s správy, ktoré preukazujú koreláciu medzi expresiou PAR-1 a invázie tumoru a metastáz v žalúdočných a niekoľkých ďalších druhov rakoviny [25], [26], [27]. Táto štúdia je prvou, ktorá ukazujú na priamu interakciu galektinu-3 a AP-1 zložitých súčiastok, c-Jun a Fra-1, a reguláciu PAR-1 expresiu AP-1 transkripčného faktoru. Vzhľadom na to, že už bolo preukázané, iní, že nadmerná expresia Fra-1 podporuje rakovinových buniek invázie a metastáz [28], up-regulácia PAR-1 c-Jun a FRA-1 sa zdalo byť možný mechanizmus vysvetľujúci väzby galektinu-3 vyvolané up-regulácia povrchového PAR-1 bunkového receptoru a aktivity MMP-1 proteázy. Táto možnosť je podporená zistením našej paralelných a ko-lokalizované prejavov galektinu-3 a PAR-1 v malígnych tkanivách pacientov s rakovinou žalúdka. Je nové pozorovania, že galektin-3 sa zvyšuje MMP-1 expresie , Je zrejmé, že zvýšená expresia MMP-1 sa môže zvýšiť žalúdočnej invázie aktivity nádorových buniek tým, že blokuje bunky do bunky a bunky do interakcie matrice degradáciou ECM. Preto zvýšenie MMP-1 expresie presadzuje galektinu-3 môže mať dvojaký účinok, a to, PAR-1 aktiváciu a degradáciu ECM, a to ako sú rozhodujúce pre žalúdočné nádorových metastáz. Avšak, ako galektinu-3 reguluje MMP-1 expresie je stále nejasná, pretože expresia MMP-1, je upravená rad komplexných udalostí vrátane presluchu medzi niekoľkými transkripčných faktorov, ako je napríklad AP-1, prevodníkom signálu a aktivátor transkripcie-3, MAP kinázy, a hypoxiou indukovatelný faktor-1 v hypoxia [29], [30], [31]. Stanovenie zebrafish ( Danio rerio Na záver, naše štúdie preukázali, že galektin-3 zrýchlené karcinómu žalúdka pohyblivosti buniek až usmerňovanie PAR-1 a MMP-1. Ďalšie štúdie jasne vyplýva potreba objasniť úlohu galektinu-3 v nádorových metastáz a jeho vhodnosť ako terapeutický cieľ pri vybraných druhov rakoviny. tkanív Páry 2 mm boli získané veľké biopsie z adenokarcinóme žalúdka tkanív 20 pacientov podstupujúcich diagnostické endoskopii a endoskopické submukóznu pitvu, National Cancer Center v Kórei, po získaní svoje písomné informovaný súhlas. Vzorky tkaniva boli zmrazený v kvapalnom dusíku pri teplote -70 ° C a bezprostredne po biopsii až do použitia. Niektoré z tkanivových vzoriek boli paraffindized pre imunohistochemické štúdie, podľa potreby. Tieto štúdie boli schválené Institutional Review Board Národného centra rakoviny (# NCCNSH 03-024). Stredne diferencovaný adenokarcinóm ľudské bunkové línie žalúdka AGS, MKN- 28 a SNU-638 boli získané z Kórey bunkovej línie Bank a udržiavané, ako bolo opísané skôr [35]. siRNA používaný v transfekciu boli všetky poskytnuté Invitrogen (Carlsbad, CA). Ich sekvencie sú galektinu-3 (LGAL3) siRNA; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', PAR-1 siRNA; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', a MMP-1 siRNA; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Transfekcia boli vykonané za použitia Lipofectamine RNAiMAX činidla (Invitrogen), podľa inštrukcií výrobcu. Indukciu prechodné galektinu-3 nadmernú expresiou v SNU-638 buniek bolo dosiahnuté za použitia pcDNA3.1 /NT-galektinu-3 s pcDNA3.1 /NT-GFP. Na liečbu riadiace normalizácie, žalúdočné rakovina bunkové línie boli ošetrené s 1 ug podľa LTX činidiel (Invitrogen). Celková RNA bola izolovaná z ľudských buniek karcinómu žalúdka a pacientské vzorky tkaniva, využívajúce TRIzolu činidlo (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. Reverznej transkriptázy PCR sa vykonáva za použitia systému reverznej transkripcii (Promega Corp. USA), podľa inštrukcií výrobcu. Boli použité primery: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(sense) a 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3 "(anti-sense) pre ľudskú génovú LGAL3 (galektin-3); 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(sense) a 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3 "(anti-sense) pre ľudský gén F2R (PAR-1); 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(sense) a 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3 "(anti-sense) pre ľudské MMP-1 génu; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(sense) a 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3 "(anti-sense) pre ľudské MMP-9 génu; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(sense) a 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3 "(anti-sense) pre ľudský gén beta-aktínu; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(sense) a 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3 "(anti-sense) pre ľudskú glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH). PCR bola vykonávaná v objeme 20 ul za použitia Ex Taq (Takara). Amplifikačnej cyklus (denaturácia 95 ° C po dobu 1 minúty, teplotná hybridizácia 60 ° C po dobu 1 minúty a kroku extenzia pri 72 ° C po dobu 2 min) bol opakovaný 32-krát nasleduje konečné predĺženie počas 10 minút pri teplote 72 ° C. Výstavba galektinu-3 vyjadrujúce Lenti-vírusového vektora a infekcie plnej dĺžky ľudského galektinu-3 vyjadrujúce postaviť pcDNA3.1-NT-GFP-gal3 sa pcDNA3.1-NT-GFP vektor a Lenti-vírusový vektor so zvýšenou expresiou LacZ, galektinu-3 (1 - 250) v pLL3.7 už boli popísané [2]. Ľudský F2R bol klonovaný do pLECE3 do miest pre reštrikčné enzýmy a BamH1 Not1, vytvárať pLECE3-F2R (PAR-1) konštruktu. Full-length cDNA z F2R, MMP-1, a riadiace mRFP boli použité pre PCR amplifikáciu, spolu s primermi uvedenými v dát S1, a vzniknuté fragmenty PCR boli klonované do vektora pLECE3 za použitia miesta obmedzenia enzýmy Pac1 a Hpa1, vytvorenie pLECE3 -MMP-1 konštruktu. Tiež miesto mRFP z pGEM-T-Easy vektora bola prevedená na pLL3.7 vektora, ktorý nahradí oblasť GFP pomocou Age1 a miesta obmedzenia enzýmy EcoR1, aby pLL3.7-mRFP. Lenti-vírusový vektor výroba bola predtým popísané [2] Western blot analýza bunkového lyzátu extrakcie boli pripravené s pufrom RIPA (1% NP-40 ,. 0,1% dodecylsulfát sodný, 0,5 % deoxycholátu, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5) a proteázy inhibiter kokteil. 20 ug celkového proteínu z každého lyzátu bol vyriešený vo 8-12% SDS PAGE géloch a elektro-prevedené na PVDF membránu a potom blokované v 5% odstredeného mlieka v 0,05% Tween-20 s 1 x PBS (PBST). Polyklonálne primárnej protilátky, anti-galektinu-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 a anti-β-aktínu (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxillinu a anti-fosfo paxillinu (pY181) (Epitomics) boli inkubované s blot na 1: 1000 riedenie v minimálnom objeme 5% BSA (bovinnej sérový albumín) v PBST pufrom o teplote 1 h miestnosti alebo cez noc pri 4 ° C. Anti-myšou alebo anti-králičie sekundárne protilátky kozí-HRP-konjugovanou (GE Healthcare UK Limited) sa inkubujú pri 1: 5000 zriedenie 5% BSA v PBST pufrom po dobu 1,5 hodiny pri teplote miestnosti. Proteínov, boli detekované zvýšenej chemiluminiscencie (ECL) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA). bunkového lyzátu boli pripravené extrakty sa IP + pufrom (20 mM HEPES, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM pyrofosfát sodný, 1 mM orthovanadičnanu sodného, 0,2 mM PMSF, 10 ug /ml proteázy inhibítor cocktail) na ľade počas 30 minút. Po odstránení nečistôt odstreďovaním (13200 otáčok za minútu pri teplote 4 ° C počas 20 min), supernatanty boli podrobené preclearing kroku sa proteín A /G agarózových guľôčok pri 4 ° C počas 30 minút na rotátora. Supernatanty, získané po krátkom odstredenia (2000 otáčok za minútu pri teplote 4 ° C po dobu 4 min) boli podrobené imunoprecipitáciou s použitím anti-galectin3 a normálne myšou IgG (negatívna kontrola). Imunoprecipitáty boli dvakrát premyté v IP-pufri (20 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM pyrofosforečnan sodný). Po 30 ul 2 x SDS-vzorky pridaním pufra, následne vriacej pri teplote 95 ° C počas 5 min. Po supernatanty získané po krátkom odstreďovania, ich úrovne expresie proteínu boli stanovené pomocou analýzy western blot vykonané. galektinu-3 a PAR-1 imunohistochémia, deparafinizovány žalúdočné pacientov s nádorovým ochorením tkanivovej rezy boli ponechané v mikrovlnnej rúre po dobu 15 minút v citrátovom pufri (Vector Laboratories), a potom inkubované s 3% H 2O 2 po dobu 15 minút k zablokovaniu endogénnej peroxidázy, nasledovanou inkubáciou s 10% normálnym kozím sérom (Vector laboratória) v 1 x PBS po dobu 10 minút. Primárne protilátky boli použité na anti-galektinu-3 (1: 200) anti-MMP1 (Epitomics) a anti-PAR-1 (1: 200) protilátky (Santa Cruz), a ďalším krokom bolo vykonané v súlade s pokynmi Vectastain®ABC kit (Vector Laboratories). Produkty boli vizualizované pomocou Diaminobenzidine (DAB) sady (Vector Laboratories). kondiciovaného média boli získané z kultúr MKN-28 bunkových línií karcinómu žalúdka a koncentruje za použitia Vivaspin 6 (Sartorius ). Koncentrované supernatanty v 6 x Foz pufra boli separované na 10% SDS géloch s obsahom 1 mg /ml želatíny. Každý sa inkubuje v 100 ml zymografie reakčným pufru a zafarbené Bio-safe Coomassie ™ G-250 (Bio-Rad Laboratories). Po odfarbenie, ostré priehľadné pásky indikujúce aktivitu gelatinolytic boli vizualizované na modrom pozadí. Pre prechod transfilter a invázie testu sme použili MKN-28 a SNU-638 buniek. Bunky boli transfekovány molekulami siRNA na 1 deň, izolované a pridá sa do hornej komory póru vložky Transwell sa kolagénu typu l (BD) BioScience potiahnutých filtre v teste migrácie, a Matrigelu (BD Bioscience) potiahnutých filtre, invázia testy. RPMI 1640 s 10% FBS a 1% antibiotiká (Gibco) bolo pridané do dolnej komory, s následnou inkubáciou počas 20 hodín. Migrujúci a napadajúce bunky boli kvantifikované po H &E farbenie. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach a údaje uvedené ako stredné hodnoty. chromatín Imunoprecipitácia (čip) test bol vykonaný za použitia čipovej testovací kit (Millipore). Vzorky boli nanesené na riad po galektinu-3 siRNA ošetrenie a testy sa vykonávali podľa pokynov výrobcu. Anti-galektinu-3, anti-c-Jun, anti-Fra-1 a normálny myší /králičie IgG boli použité pre imunoprecipitáciou DNA obsahujúce komplexy. Pred PCR priméry boli pripravené na AP-1 sa záväznými PAR-1 promótor miest -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') a PAR-1 promótor miesto -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). PCR bola vykonaná s Ex Taq (Takara). AP-1 luciferázy reportér plazmid bol získaný od Dr. Sung-Pil Yoon Národného centra pre výskum rakoviny v Kórei a štúdie účinkov galektinu-3 na AP-1 transkripčný aktivity v lacZ a galektinu-3 v priebehu exprimujúce bunky boli vykonané v súlade s predchádzajúcej správe [2]. Po 48 hodinách boli bunky zozbierané a aktivita luciferázy bola meraná s použitím luciferázového testovacieho systému (Promega) podľa inštrukcií výrobcu. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach a údaje uvedené ako stredné hodnoty Migrácia buniek test s použitím modelu zebrafish Transgénne línie zebrafish Tg (kdrl: EGFP). s843 Microarray bola vykonaná v AGS, rakovina žalúdka bunková línia po tlmenie hluku z galektinu-3, ako bolo opísané skôr [6]. Výsledky microarray bol nahraný na GEO (GSE29630). Dáta bola prezentovaná ako priemer ± SD z aspoň 5-10 snímok získaných z troch nezávislých pokusov použitím mikroskopu (x 100 x 200), pokiaľ nie je uvedené inak. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou jednocestnej ANOVA testu pomocou softvéru Prism. Dáta bola považovaná za významnú, ak p Podporné informácie
žalúdočné rakovina invázie buniek. Tieto štúdie preukázali, že: a) galektinu-3 tlmenie hluku sa znižuje expresiu PAR-1. b) galektinu-3 nadmerná expresia zvyšuje migráciu a inváziu buniek a tento nárast môže byť zmenený prostredníctvom PAR-1 umlčanie, čo naznačuje, že galektinu-3 zvyšuje migráciu a inváziu buniek prostredníctvom PAR-1 up-regulácia. c) galektinu-3 priamo interaguje s AP-1 transkripčného faktora, a tento komplex sa viaže k PAR-1 promótor a poháňa PAR-1 transkripciu. d) galektinu-3 tiež zosilňuje fosfo-paxillinu, s PAR-1 downstream cieľ tým, že zvyšuje MMP-1 expresie. MMP-1 tlmenie hluku bloky fosfo-paxillinu zosilnenie a invázie buniek spôsobené galektinu-3 v priebehu expresie. e) Umlčanie buď galektinu-3, PAR-1 alebo MMP-1 významne znižuje migráciu buniek do ciev v modeli zebrafish embrya. f) galektinu-3, PAR-1 a MMP-1 je veľmi exprimovaný a ko-lokalizované v malígnych tkanivách pacientov s karcinómom žalúdka.
štúdie sme použili zebrafish modelu embryí na určenie ich vplyv na migráciu a inváziu rakovinových buniek živých organel. Tiež sme zistili, hladiny expresie galektinu-3, PAR-1 a MMP-1 v malígnych tkanivách od pacientov s karcinómom žalúdka pre klinické korelácia medzi týmito proteínmi v ľudských vzorkách.
Výsledky
galektinu-3 podporuje migráciu buniek karcinómu žalúdka /invázii zvýšením PAR-1 výraz
galektinu-3 podporuje PAR-1 transkripciu prostredníctvom interakcie s AP-1 komplexu
galektinu-3 zvyšuje expresiu MMP-1 a aktivácia PAR-1 signalizácia
Umlčanie galecin-3, PAR-1 alebo MMP-1 blokuje žalúdka migrácia rakovinových buniek in vivo
v zebrafish modeli
[24], expresné EGFP konkrétne v ich cievach. Zodpovedajúce zebrafish embryá sú transparentné s zeleného fluorescenčného plavidiel. zamestnaný sme tieto ryby, aby vykonala in vivo
štúdium ľudského žalúdka migrácie nádorových buniek (obrázok 5A). Keď je červený fluorescenčný značené AGS bunky boli injikované do žĺtkového vaku zebrafish embryí na 48 HPF (hodín po oplodnení), u väčšiny transplantovaných AGS bunky boli umiestnené v strede žĺtkového vaku embryí od 4 hodín po transplantácii ( HPT). Po 26 HPT, a to ako normálne a scrn transfekované bunky sa sťahoval do kufra regiónu, a býval v nádobe kufra a /alebo chvoste embryí pri 50 HPT. Avšak, počet migrovaných buniek AGS, v ktorom každá z galektinu-3, PAR-1 alebo MMP-1 sú umlčané, výrazne znížil (obrázok 5B). Tiež počítal počet zebrafish embryí, ktoré zobrazujú migrujú bunky a sú zobrazené výsledky (obr S2). Osemdesiat štyri až deväťdesiat tri percent zebrafish embryí, ktoré boli transplantované s kontrolnými bunkami alebo scrn ošetrené bunky zobrazené bunky, ktoré sa sťahujú do ich trupu a chvostovej ciev pri 50 HPT. Avšak iba 7-11% embryí, ktoré boli transplantované s bunkami, v ktorom boli umlčených galektinu-3, PAR-1 alebo MMP-1, zobrazí sa migráciu buniek. Tieto zistenia navrhol, že prvý model zebrafish embryo môže byť použitý pre sledovanie migrácie buniek karcinómu žalúdka ako živého zvieraťa, a za druhé, že umlčanie každého z galektinu-3, PAR-1 a MMP-1 spôsobilo významné zníženie výskytu žalúdka migrácia rakovinových buniek in vivo
.
Diskusia
) model pre embryo štúdium migrácie a invázie buniek karcinómu žalúdka je konkrétne vykonanie tejto štúdie, pretože vhodné zvieracie modely boli k dispozícii pre štúdium rakovina žalúdka metastáz až do súčasnosti. Zebrafish modelom pre štúdium geneticky rakoviny a /alebo nádorové xenografe, má mnoho výhod, vrátane uskutočniteľnosti vpred a vzad genetických analýz, transparentnosti embryí [32], a vhodnosti pre GFP označovanie plavidiel [32], [33], [34]. Táto štúdia ukázala, že RFP označené buniek karcinómu žalúdka inváziu krvných ciev, zatiaľ čo galektinu-3, MMP-1 alebo PAR-1 umlčaný buniek karcinómu žalúdka nemohol. To znamená, že zebrafish embryo sa javí ako sľubný model pre štúdium invázie a metastáz nádorových buniek, aj keď ďalšie štúdie sú nevyhnutné pre potvrdenie tohto zistenia.
materiály a metódy
Bunková kultúra a transfekcia siRNA
Izolácia RNA a RT-PCR analýza
Imunoprecipitácia
Imunohistochémia
Želatína zymografie
migračnej Transfilter a invázie testy
chromatínu imunoprecipitační testy
luciferázy testy
[24], v ktorom EGFP je špecificky vyjadrená v cievach, bol udržiavaný v súlade s uznávanými štandardných operačných postupov [36] schválila používanie a ošetrovanie výboru Institutional Animal v National Cancer Center v Kórei; Číslo povolenia: NCC 11-116. Získali sme zebra-rybie embryá z National Cancer stredovej zebrafish aqua-miestnosti. transplantácia nádorových buniek bola vykonaná v súlade s NICOLI et al [37] s miernymi úpravami. Stručne povedané, dechorionated embryá bola podaná anestézie s trikain (Sigma) a rakovinové bunky boli injikované (150 až 200 na embryo) do stredy embryonálnych žĺtka vakov 48 HPF (hodín po oplodnení) za použitia mikromanipulátor (Narishige) a pneumatický Picopump (WPI ) vybavené borosilikátového skla ihly. Embryá bola udržiavaná po transplantácii postupov a boli skúmané na migráciu nádorových buniek fluorescenčnej mikroskopie. Pre zobrazovanie, embryá a larvy boli ošetrené N-phenylthiourea (Sigma) od 12 HPF, aby sa zabránilo pigmentácie a skúmaná fluorescenčným inverzného mikroskopu (Carl Zeiss) pod vhodným pre epifluorescenčné optiky. Fluorescenčné obrazy boli zachytené pomocou CCD kamerou (Carl Zeiss). Stabilné fluorescenčné žalúdočné bunkové línie AGS (mRFP) boli generované Lenti-vírusovej infekcie s pLL3.7-mRFP následným triedením FACS.
Microarray analýza dát
štatistika analýza
. ≪ 0,05
Obrázok S1.
tlmičom galektinu-3 s siRNA v rakovinové bunky žalúdočnej za následok zmeny v pohyblivosti buniek súvisiace génovej expresie. A, Z analýzy DNA microarray, zvolili sme pohyblivosti buniek súvisiace s génom MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascino-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) a ukázala pomer násobnú zmenu , B, Detekcia mRNA expresie MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascino-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) za použitia PCR. β-aktínu bol použitý ako kontrola normalizácia
DOI :. 10.1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF)
Obrázok S2.
počet zebrafish embryí s pomerom migrovaných buniek. Detekcia rakovina žalúdka buniek čísel AGS (RFP) po transplantovaný z AGS (RFP) vo zebrafish rybích embryách s liečbou špecifickou siRNA (galektinu-3, MMP-1 a PAR-1) s negatívna kontrola scrn (Obrázok 5A-B). Ukázalo sa počet preneseného bunky za embyos bol počítaný a zobrazený ako percento
doi :. 10,1371 /journal.pone.0025103.s002
(TIF)
Obrázok S3.
RT-PCR analýza úrovni mRNA galektinu-3, MMP-1 a PAR-1 u pacientov s rakovinou žalúdka.
Črevné bakteriálne zmeny ovplyvňujú výsledky liečby lupusu v tehotenstve
Priebeh tehotenstva, ako v skutočnej láske, nie vždy funguje hladko, keď máte lupus, správne nazývaný systémový lupus erythematosus (SLE). Táto autoimunitná choroba je príležitostne násilná, občas utl
Sliz v sprchových hlaviciach by mohol obsahovať štúdiu o nebezpečných pľúcnych baktériách
Štúdia ukázala, že sprchové hlavice obsahujú sliz, ktorý môže byť domovom potenciálne nebezpečných baktérií, ktoré môžu viesť k závažnému ochoreniu pľúc. Mykobakteriálne baktérie sú zodpovedné za pľúc
Netesné črevo a vesmírny let - mechanizmus odhalený
Nová štúdia o účinkoch simulovanej mikrogravitácie, podmienka, s ktorou sa astronauti stretávajú vo vesmíre, zasahuje do epiteliálnej bariéry čreva, a efekt pretrváva aj potom, čo sa astronaut vráti d
