Plos ONE: MIR-29a zavira celično proliferacijo in inducira Cell Cycle prijetje prek downregulation za p42.3 v humani Rak želodca

Povzetek

Kot novo opredeljene in značilna gena, p42.3 je povezana s celično proliferacijo in tumorjev. Izraz p42.3 je povečana pri človeškega raka želodca (GC), vendar pa njegove temeljne mehanizmi delovanja niso dobro razumeli. MicroRNAs (miRNAs) je znano, da igrajo ključne regulativne vloge v številnih celičnih procesov. Tu smo uporabili bioinformatiko in eksperimentalnih pristopov, da razišče regulativni razmerje med miRNAs in gena p42.3. Pokazali smo, da lahko miR-29a zatirajo p42.3 izraz na ravni mRNA in koncentracije proteina z neposredno vezavo na svojo 3'UTR. Poleg tega so opazili v obratnem sorazmerju pokoj-29a in p42.3 izražanja v želodcu raka celičnih linij in vzorcev GC tkiva, še posebej v primerih, ko je navzdol reguliranih p42.3. Skupaj smo pojasnili že nepriznavanje vloge pokoj-29a in navedla, da lahko miR-29a deluje, vsaj delno, z osredotočanjem na p42.3 gena v človeški GC

Navedba. Cui Y Su WY , Xing J Wang YC Wang P Chen XY, et al. (2011) MIR-29a zavira celično proliferacijo in inducira Cell Cycle prijetje prek downregulation za p42.3 v humani želodca raka. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10,1371 /journal.pone.0025872

Urednik: Alfons Navarro, Univerza v Barceloni, Španija

Prejeto: 28. februar 2011; Sprejeto: 13. september 2011; Objavljeno: 5. oktober 2011

Copyright: © 2011 Cui et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz državnega Temeljni raziskovalni program Kitajske 973 program (2010CB5293, National High Technology raziskovalni in razvojni program Kitajske (863 Program) (2006AA02A402, National Natural Science Foundation Key programa (št 30830055) in ministrstva . za varovanje zdravja RS, Kitajska (št 200802094), da FJY blagajnami imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi. avtorji so izjavili da ne obstajajo konkurenčni interesi.

Uvod

p42.3 je nov gen, ki je bila pred kratkim izolirali in označene z mRNA diferencialno zaslonu (mRNADD) tehniko. cDNA po vsej dolžini od p42 0,3 približno 4,0 kb, in gen kodira 389 amino kislin (aa) protein, ki je ocenjeno, da ima molekulsko maso 42,3 kDa. Nadaljnje raziskave so pokazale, da je njegov izraz celični cikel, odvisno v želodcu raka (GC) celičnih linijah. Njene beljakovine izraz vrhovi v fazi M celičnega ciklusa, preden se postopoma zmanjšuje po delitvi celic; to pomeni, da se p42.3 lahko sodeluje pri regulaciji celičnega cikla. Poleg tega, utišanje p42.3 malih interferenčne RNA (siRNA) rezultatov v uravnavanjem CHK2 in downregulation za ciklin B1, ki so dve ključni proteinov, ki sodelujejo pri regulaciji celičnega cikla [1], [2]. Medtem ko so RT-PCR in imunohistokemično Analize so pokazale, da p42.3 je povečana pri GC primerjavi z običajnimi vzorcev tkiva, je funkcionalna raziskave kažejo, da izčrpavanje p42.3 ne sme povzročiti samo inhibicijo GC celično proliferacijo in tvorbe kolonij vitro
, lahko pa tudi bistveno zmanjša pojav tumorjev pri golih miših [3]. Čeprav so prejšnje študije kažejo, odločilno vlogo p42.3 gena v patologije GC, posebne temeljne mehanizme njenega delovanja je treba še pojasniti.

MicroRNAs (miRNAs) sestavljena iz razreda majhnih (~ 22 nukleotidov), endogeni, nekodiran RNA, ki je znano, da igrajo pomembno regulativne vloge v izražanju genov [4]. Primarni miRNA transkript se imenuje pri-miRNK [5], ki je prepisana z RNA polimerazo II ali III [6] [7]. JŽI-miRNK nato cepimo z mikroprocesorja kompleks Drosha-DGCR8 da dobimo molekulo prekurzor lasnic (pre-miRNA), ki se nato izvožen iz jedra v citoplazmo ga Exportin-5 /Ran-GTP. S pomočjo kompleksa, ki vsebuje RNaze Kocka in dvojnoverižno RNA-vezavni protein, TRBP se ~70-nukleotid predhodno miRNK predela v zrelo miRNA [8]. Funkcionalna sklop zrelega miRNA je naložen v RNA-inducirano dušenje kompleksno (RISC), ki vsebuje beljakovine, argonaute (nazaj) in Tnrc6, medtem ko je drugi sklop običajno razgradi [9]. Zrel miRNA vodi RISC na nepopolnih komplementarnih sekvenc v ciljnih mRNA za zatiranju kognaten prevajanje mRNA, spodbujanje prepis gnilobe ali oboje [10]. Ocenjuje se, da je večina, ki kodirajo geni verjetno ureja miRNAs in, medtem ko lahko miRNA uravnavajo več kot enega ciljnih genov, lahko nekateri geni ureja več miRNAs [11].

Gojenje dokazi kažejo, da gre za miRNAs v številnih fizioloških in patoloških procesov, vključno z razvojem, diferenciacijo, proliferacijo in apoptozo [12.13,14,15]. Čeprav so bile nepravilnosti miRNA izražanja določena v številnih človeških tumorjev, vključno z debelega črevesa, želodca in dojk raka [16], [17], se je število teh tumorjev se še vedno širi. Vendar se podrobna funkcije miRNA v tumorjih je treba še pojasniti.

Nedavne študije so pokazale, da ima miR-29 kompleksne funkcije v različnih bolezni. MIR-29a lahko obnaša kot supresorski tumorja v obeh pljuč in trebušne slinavke, rak celičnih linij in s tem eksogeni prekomerno rezultatov miR-29a v znatno zmanjšanje invazivni potencial in širjenje teh celičnih linij [18]. Vloga tumor supresorski miR-29a je po svoji opaziti downregulation podpirajo tudi v širokem spektru solidnih tumorjev, vključno nevroblastom, sarkomov in možganskih tumorjev [19]. V nasprotju s tem je miR-29a povečana pri indolentni človek B-celično kronično limfocitno levkemijo (B-KLL) [20] in akutno mieloično levkemijo (AML) [21], kar kaže na morebitno vlogo promotorja tumor. Poleg tega lahko abnormalnih miR-29a najdemo v mnogih nemaligne bolezni, vključno jetrna fibroza [22], diabetes [23] in Alzheimerjeve bolezni [24]. Čeprav so mnogi geni že potrdili, da so neposredne tarče pokoj-29a, kot PPM1D [25], PI3K [26] in nevron navigator 3 [24], saj predstavljajo zelo majhen del vseh genov, ki miR-29a cilji.

v tem poročilu smo dokazati, da je p42.3 izraz nadzorom na ravni tako mRNA in proteina s pokoj-29a preko neposrednega usmerjanju 3'UTR p42.3. MIR-29a lahko zavre celično proliferacijo in inducira aretacijo celičnega ciklusa, vsaj delno preko downregulation za p42.3 izražanja. Poleg tega smo ugotovili, da je bil izraz p42.3 beljakovin obratno povezana z miR-29a izražanja v človeških GC tkivih.

Rezultati

p42.3-3'UTR je domnevno tarča miR -29a

Domnevna miRNAs, ki so napovedali, da ciljajo na p42.3 gen za več kot eno bazo podatkov smo analizirali. V prvih dveh miRNAs, ki so bile predvidene za trikrat so bili izbrani za nadaljnjo potrditev in ostalih treh miRNAs, vključno pokoj-29a, katerega domnevni zavezujoča strani so bile podobne tistim iz prvih dveh so bili izbrani tudi kandidati za potrditev. MIR-29a je napovedoval podatkovnih baz TargetScan in miRGEN, ki so pokazali, da je bil njegov domnevni vezavno mesto na mestih 213-219 od p42.3-3'UTR (slika 1A). Drugi kandidati niso navedene tukaj.

neposredno ciljanje p42.3-3'UTR s miR-29a

reporterski gen test je bil zaposlen, da bi preverili, ali je p42.3 neposreden cilj miR-29a. Divjega tipa in mutant p42.3-3'UTR vsebuje domnevnega vezavno mesto miR-29a smo klonirali v posameznih plazmidov in zlit z reporterskega gena. Fluorescentna intenzivnost reporterskega gena je bila v skupini, ki je sočasno transfektirana z WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 in pcDNA3.1 /pri-miR-29a v primerjavi s kontrolo znatno zmanjšal. Poleg tega ni bilo veliko zmanjšanje fluorescenčne intenzitete v skupini, ki je co-transfekciji s MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (slika 1B), dodatno potrjuje, da miR-29a povzročilo nastanek downregulation za p42.3 izražanja genov preko specifične vezave domnevnega mestu p42.3-3'UTR.

Izražanje pokoj-29a in p42.3 je obratno sorazmerna v celičnih linijah GC

Da bi ugotovili povezavo med p42 0,3 in miR-29a, smo proučevali endogene izraz pokoj-29a in p42.3 v šestih GC humanih celičnih linijah (GSS-7901, podjetja MKN-28, podjetja MKN-45, MGC-803, snu-1 in AGS) in eno normalno epitel celične linije želodca (GES-1; Slika 2A-C). Ugotovili smo, da je bila stopnja p42.3 mRNA bistveno višja od normalne nadzor v vseh linijah GC celic z izjemo SGC-7901, kjer razlika ni bila statistično značilna. Nivo izražanja p42.3 je spremenljivka na ravni proteina, vendar je bil občutno višji v vseh celičnih linij GC primerjavi z GES-1.We tudi pokazala, da je bil miR-29a izraz nizko štirih vodov GC celic ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 in AGS), ki se je pokazala v obratnem sorazmerju z p42.3 izražanja. Čeprav je bila ekspresija miR-29a visoko snu-1, to ni bilo statistično pomembna. Treba je omeniti, da je bila visoka izraz pokoj-29a v MKN-28 je izjema.

MIR-29a ureja p42.3 izraz

Za oceno, ali je p42.3 zatrta s miR -29a smo obdelan MKN 45 celic z mimiko in inhibitorjev pokoj-29a za 48 ur, da se eksogeno gor in upocasnjujejo izražanje pokoj-29a posebej; izraz p42.3 je bilo nato določeno. Po transfekcija MKN-45 celic z posnema, izraz MIR-29a poveča za približno 10-krat, medtem ko je zdravljenje z zaviralci zmanjšal nivo miR-29a za več kot 50% (slika 3A-B). Ta je predlagal, da obe posnema in zaviralci pokoj-29a učinkovito delovala v naših poskusih. Čezmernim miR-29a lahko bistveno zatreti izražanje p42.3 tako na mRNA in beljakovin ravni, ki je bil podoben učinek za utišanje p42.3 ga p42.3 siRNA (SI-p42.3). tudi Zaznali smo, da je bila CHK2 molekul in cyclinB1 je navzdol reguliranih po utišanje p42.3 ga p42.3 siRNA. Zanimivo je, da so bili podobni učinki, ki deluje na CHK2 in cyclinB1, ki jih prekomerno pokoj-29a v MKN-45 celice (slika 3C-D). Poleg tega transfekciji zaviralcev miR-29a močno zmanjšala CHK2 izraz in povečana p42.3 in cyclinB1 izraz (Slika 3E-F). Ta je predlagal, da bi lahko MIR-29a uravnavajo ekspresijo gena p42.3 v MKN-45 celic.

MIR-29a zavira proliferacijo celic in vitro

Po podatkih iz celične proliferacije test, smo pripravili vpojnosti krivulje pri valovni dolžini 450 nm po transfekciji za trajajo različno dolgo. Ugotovili smo, da je celična proliferacija pomembno inhibirana po transfekciji MKN-45 celic z p42.3 siRNA za 48 h in 72 h, in podoben vzorec je bilo ugotovljeno, potem ko so celice transficirane z posnema za miR-29a. Vendar je bila stopnja zatiranja dosežemo z miR-29a posnema večja od p42.3-siRNA inducirane downregulation (slika 4A). Nasprotno se je rast rakavih celic napredoval za približno 10%, v primerjavi z negativno kontrolo, kadar transfektirana z zaviralci miR-29a 48 ur, vendar je bil padec po 72 urah (slika 4B). To kaže, da bi lahko miR-29a inhibira proliferacijo celic preko zatiranje izražanja p42.3.

MIR-29a blokira celični cikel napredovanje

utišanje p42.3 s p42.3 siRNA lahko povzroči pri prijetju celičnega cikla; Zato smo raziskovali, ali bi miR-29a vpliva na napredovanje na celičnega ciklusa po ciljnih gen p42.3. Potem ko so bile MKN-45 celice transficirane z p42.3 siRNA za 48 h, smo ugotovili, da je cikel celične blokirane v fazi G1 (75.93%, P
< 0,05), v primerjavi z negativno kontrolo ( 66,18%). Ugotovili smo, da lahko posnema Mir-29a povzroči tudi G1 fazi aretaciji v MKN-45 celic pri zdravljenju za 48 ur (75.56%, P
< 0,05; slika 5).

Expression miR-29a in p42.3 beljakovin v GC in njihovi povezavi z clinicopathological značilnosti

s kvantitativno PCR v realnem času tehniko, je miR-29a odkrili pri 60 parov GC tkiv in njihova ujema non-rak, ki mejijo tkiva, raven p42.3 protein, medtem ko je bila ocenjena tudi v teh tkivih z metodo Western blot. Od 60 GC tkiva vzorcev, je p42.3 izraz visoka v 35 primerih (35/60, 58.33%) glede na njihove ujema nerakave sosednjih tkiv. V 25 primerih, v katerih je navzdol reguliranih p42.3 izraz, je miR-29a izraz visoko v 21 primerih. MIR-29a izraz je bil v 27 primerih (27/60, 45%) nizka. Navedeni podatki kažejo obratno sorazmerje med pokoj-29a in izražanja p42.3 beljakovin v vzorcih tkiv ( P
= 0,000 Tabela 1 in Slika 6), vendar je koeficient korelacije ni bil dober (r = -0.316 ).

Poleg tega so miR-29a in izraz p42.3 beljakovin ocenjevali glede na zastavljene clinicopathological značilnosti 60 bolnikov, od katerih so bili odvzeti vzorci tkiva. Naše ugotovitve kažejo, da ni bilo očitne povezave med p42.3 beljakovin in miR-29a izražanja, oziroma, z clinicopathological funkcij (tabela 2).

Pogovor

Gen p42.3 je zelo ohranja pri sesalcih in kot onkogen, lahko igrajo pomembno vlogo pri postopnem transformacije normalnih želodčne epitelija celic v rakave celice. Njegova razlika izraz v fazah celičnega ciklusa razkriva, da se p42.3 lahko sodeluje pri regulaciji celičnega cikla. To je bilo potrjeno z našimi rezultati, ki so pokazale, da bi lahko p42.3 za dušenje zvoka spremeni izražanje dveh ključnih proteinov, CHK2 in ciklin B1, ki so vključene v uredbo celičnega cikla. Uporabljajo za izgubo funkcije poskuse smo pokazali, da lahko p42.3 stimuliranje celične proliferacije in kot poročajo, naši rezultati kažejo, da je bila p42.3 prekomerno v GC tkivih v primerjavi s sosednjim sluznico brez raka [3]. Vendar pa naj bi se molekularni mehanizmi, ki izhajajo iz tega odklonskega ekspresijo p42.3 gena v GC slabo razumemo, kot je razvidno iz pomanjkanja razpoložljive literature. MiRNAs lahko uravnavajo izražanje genov z usmerjanjem veznih mest v ciljnih mRNA [27], v oblikah raka, so že bili vpleteni številni miRNAs. Vendar je bila funkcija le nekaj razumeti doslej, zlasti v GC [28].

V tem poročilu smo izbrali MIR-29a za nadaljnje preiskave na reporterski genski sistema in na koncu ugotovila, da p42. 3 je neposredna ciljni gen miR-29a. Naši podatki kažejo, da so štiri baze podatkov (TargetScan, microRNA.org, mikrokozmos cilji različice 5 in miRGen), so bili uporabljeni učinkovita, vendar ni popoln, orodja za napovedovanje ciljev miRNA in pod pogojem, eksperimentalni dokaz za izboljšave osnovnega algoritma.

Pokazali smo, da je bil p42.3 izraz obratno sorazmerna z miR-29a izražanja v štirih GC celičnih linijah. V treh od teh je bila MKN-45, MGC-803 in AGS, to očitno na ravni mRNA in na ravni proteinov, vendar to ni bilo tako v celični liniji SGC-7901. Poleg tega miR-29a izraz ni bil v MKN-28 in snu-1 celičnih linij nizko. V celoti gledano, te ugotovitve smo lahko hipotezo, da je regulatorno vlogo miR-29a zapletena v celičnih linijah GC in pokoj-29a lahko igrajo različne vloge v različnih mobilnih okolij. Vendar se podrobna mehanizmi miR-29a funkcij v celičnih linijah GC zahtevajo nadaljnje preiskave.

V raziskavi, miR-29a čezmernim lahko povzroči podobne učinke kot sta jih dosegla utišanje p42.3 ga p42.3 siRNA. Oba p42.3 mRNA in proteina, so navzdol reguliranih potem ko so celice transfekciji s p42.3 siRNA ali miR-29a posnema in celično proliferacijo in celično cikla so zatreti, ko celice doživel isto motnje. Je predlagal, da se miR-29a lahko vpleteni v patogenezo GC preko zatiranju p42.3 genske ekspresije. Vendar pa smo ugotovili iz krivulje rasti, ki je bila stopnja represijo miR-29a posnema večja kot v p42.3 siRNA. Po našem mnenju lahko bil glavni razlog za to, da bi posebna miRNAs urediti na stotine genov za nadzor celične funkcije. V tej študiji, lahko miR-29a inhibira celično proliferacijo, vsaj delno, z usmerjanjem p42.3.

Naši podatki so pokazali, da čeprav je bila stopnja visoko ekspresijo miR-29a 55% (33 /60) v GC, p42.3 izraz je bila nizka v 21 od teh primerov. Ta je predlagal, da imajo miR-29a lahko ključno vlogo pri GC tkiv z nizko stopnjo izraženosti p42.3.

V tej raziskavi smo potrjeni, da p42.3 je neposreden cilj pokoj-29a. Prav tako smo pokazali, da miR-29a lahko inhibira celično proliferacijo in blokirajo celični ciklus, vsaj delno preko zatiranju p42.3 izražanja v GC. Sklepamo, da lahko miR-29a ključno vlogo pri uravnavanju izražanja p42.3 v GC. Zanimivo smo ugotovili, da p42.3 gen lahko regulira tudi izraz pokoj-29a (podatki niso prikazani tukaj), vendar je osnovni regulativni mehanizem Raziskane bodo tudi v prihodnje.

Materiali in metode

Bioinformatika

Štirje učinkoviti računalniški pristopi, ki uporabljajo različne sisteme ocenjuje [29] - [32] so bile uporabljene za napovedovanje regulativnih miRNAs, ki ciljajo na p42.3 gen, vključno TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), mikrokozmos cilji Version 5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv~~HEAD=dobj /mikrokozmos /htdocs /cilji /v5 /) in miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Cilji so bili izbrani za nadaljnje potrditve iz skupine miRNAs, ki so skupna rezultatov, pridobljenih iz več kot eno iskanje.

Vzorce tkiva

Šestdeset parov histopathologically potrdili GC in sosednjih brez raka tkiva vzorci so bili pridobljeni pri bolnikih, ki so doživeli kirurško resekcijo v bolnišnici Renji povezana s Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Kitajska je med julijem 2007 in januarjem 2009. ujema brez raka sosednja tkiva smo dobili vsaj 5 cm stran od mesta tumorja. Študija je odobril Odbor za etiko raziskovalnega Shanghai Jiaotong University privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikov, medtem ko so bili pisno soglasje pridobljeni iz vsakega bolnika.

Celične linije in Kultura vpliva

Human GC celične linije, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, snu-1 in AGS in GES-1 normalna želodca epitelija celične linije, ki so bile kupljene iz ATCC (ZDA), so se ohranili v RPMI 1640 medij (Gibco, Gaithersburg, MD, ZDA), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Celice smo gojili pri 37 ° C v 5% CO _{2 inkubatorja. Raztopino tripsina (0,25%), je bila uporabljena ločiti celic iz bučke kulture.}

Vektor visoka

Za izdelavo izraz vektorjev pri-miR-29a bila prvič pomnožili s primerji zasnoval premaz Premier 5,0 programsko opremo (tabela 3) in nato kloniramo v pcDNA3.1 (Invitrogen). Za proizvodnjo plazmide, ki so vsebovali domnevnega vezavno mesto Mira-29a, tako divjega tipa in mutant sekvence iz položaja 111 do 380 od p42.3-3'UTR so kemično sintetizirane (slika 1A), nato pa so klonirali na nižji stopnji gena EGFP na Bam
HI in Eco
RI mesta v pcDNA3 /EGFP vektorja (Saierbio, Tianjin, Kitajska).

Reporter gene test

MKN-45 celice smo zasejali v trojnih vdolbino 24 vdolbinami na dan pred transfekcijo. PcDNA3.1 (+) /primarni miR-29a so co-transfekciji s divjega tipa in mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR oz. Nato pa 0,5 ig pcDNA3.1 (+) /primarne-miR-29a in 0,5 ig pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR dodamo v vsako vdolbino, pri čemer 0,1 ig vektorja pDsRed-C1 (Clontech ), ki je izrazil RFP, dodamo vsako tudi endogeni referenco. Celice, ki so transficirane samo z pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR ali pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+) so bile uporabljene kot kontrole. Celice smo zbrali 48 ur po transfekciji in analizirane na podlagi intenzivnosti EGFP in RFP fluorescence določamo z metodo fluorescenčne spektrofotometer F-4500 (Hitachi, Japonska).

Cell transfekciji

Transfekcija MKN-45 celice smo izvedli s pomočjo Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) po protokolu proizvajalca. MKN-45 celice smo zasejali v 6 vdolbinami ali 96 vdolbinami pri 30% konfluence se dan pred transfekcijo. Posnema (100 nm, GenePharma) in inhibitorji (200 nM, RIBOBIO) miR-29a so bili uporabljeni za eksogeno gor in upocasnjujejo izražanje pokoj-29a. Utišati p42.3 izražanje genov, so celice MKN-45 transfekciji s siRNA proti p42.3 (SI-p42.3, 100 nm, GenePharma). RNA nadzor (imenovan kot NC) je bil non-homologne poljubnem zaporedju človeškega genoma. Sekvence iz nukleotidov oligo so prikazani v tabeli 4.

realnem času RT-PCR

Celotno RNA smo izolirali s pomočjo TRIzola reagenta (Invitrogen) in nato obdelamo z RNaze proste DNaze ( Fermentas, San Diego, CA, ZDA). Total RNA (500 ng) je bila reverzno prepisana z PrimeScript RT reagenta Kit (Takara, Dalian, Japonska). Se primerji sekvence, uporabljene za pomnoževanje p42.3 in GAPDH so prikazani v tabeli 3. Za analizo ekspresije zrelega miR-29a, 2 pg celotne RNA izpostavimo reverzne transkripcije uporabo All-in-One Mirna Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia, Guangzhou, Kitajska). Kvantitativni PCR v realnem času za zrelo pokoj-29a in U6 je bila izvedena v skladu z navodili proizvajalca z uporabo PCR v realnem času sistem ABI 7300 in posebnih primerji ga je zasnoval GeneCopoeia, Kitajska. Relativna izraz p42.3 in miR-29a preračuna endogenega referenco (GAPDH in U6 majhna jedrska RNA vsakokrat) in glede na kontrolo. Rezultati so bili predstavljeni kot kratno spremembo, izračunano z uporabo (-ΔΔCT) metode 2 [33]; relativna izraz razmerje < 1,0 štela kot nizka, medtem ko je razmerje > je 1,0 šteti visoka ekspresija [14]

Western blotting

Skupna količina beljakovin iz kultiviranih celic in tkiv. so bili pridobljeni s RIPA liznega pufra, ki vsebuje PMSF, v skladu z navodili proizvajalca (Beyotime, Šanghaj, Kitajska). Koncentracija proteina smo merili z metodo Bradford [34]. Na splošno, 40 mikrogramov proteina smo elektroforezo skozi 10% SDS poliakrilamidnih gelih, nato pa se prenese na PVDF membrano (Millipore). Membrana je bila inkubirana z p42.3 protiteles (1:500, Abmart, Kitajska), CHK2 protiteles (1:1,000, CST), cyclinB1 protitelesa (1:1,000, CST) ali GAPDH (1:5,000, Kang Chen, Kitajska) pri 4 ° C preko noči. Sekundarna protitelesa so označena z HO (Kang Chen, Kitajska), signali so odkrili s pomočjo ECL komplet (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Nato so slike analizirali z ImageJ 1,43 programsko opremo. Izraz protein smo normalizirali na endogeni referenco (GAPDH) in glede na kontrolo. Relativna izraz razmerje < 1,0 štela kot nizko izražanja, medtem ko je razmerje med > je 1,0 štejejo za visoko izraz [14]

Cell širjenje test

potrganega MKN-45 celice. (približno 5 x 10 ^{4 celice) smo zasejali v kulturi ploščah s 96 vdolbinami. Cellular orožja je bila izmerjena na 24 h, 48 h in 72 h post-transfekciji, v tem zaporedju, s pomočjo mobilnega Counting Kit-8 (DOJINDO, Japonska) v skladu s protokolom proizvajalca. Absorbanco pri valovni dolžini 450 nm, kar kaže na pozitiven odnos do zmogljivosti celične proliferacije, je bila določena s spektrofotometrom (E-LIZA MAT-3000).}

Celični ciklus test

Štirideset -eight ur po transfekciji smo celice dvigne s pomočjo 0,25% tripsina in izperemo v DPBS (Gibco); so bili nato določena v 70% etanolu pri -20 ° C za 24 h. Za analizo s pretočno citometrijo (ep XL Beckman Coulter), smo celice inkubirali v RNazo (Fermentas) pri 37 ° C za 30 minut, obdelamo z PI (Sigma) in suspendiramo v 300 p.l DPBS.

Statistična analiza

Podatki so prikazani kot povprečje ± SD iz vsaj treh različnih poskusov. Pomen je bil analiziran s strani t-test in ne-parametričnih testov (Mann-Whitney U preskusov in preskusnih Kruskal-Wallis H). Statistična pomembnost korelacije med izražanjem pokoj-29a in p42.3 beljakovin je bila izračunana s testom hi-kvadrat in Spearman je rang korelacije. Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo SPSS 13.0 programske opreme (IBM, ZDA) in razlike so bile upoštevane statistično pomembne na P
< 0.05.

• Plos ONE: Izguba Protein promielocitno levkemijo želodčnega raka: Posledice za IP-10 izražanja in tumor-infiltracije Lymphocytes
• Plos ONE: prognostični pomen miR-181b in pokoj-21, Rak želodca bolnikov, zdravljenih z S-1 /oksaliplatinom ali doksifluridina /Oxaliplatin