PLoS One: Mir-29a gátolja a sejtek proliferációs és sejtciklusleállást keresztül downregulációját p42.3 Humán gyomorkarcinóma

absztrakt

Mint újonnan azonosított és jellemzett gén, p42.3 kapcsolatban áll a sejt proliferációt és tumorgenézisre. A kifejezés a p42.3 felülszabáiyoződik humán gyomorrák (GC), de megtartották annak hatásmechanizmusa még nem teljesen tisztázottak. A mikroRNS (miRNS-ek), amelyekről ismert, hogy játszani létfontosságú szabályozó szerepet számos sejtes folyamatot. Itt kihasználtuk a bioinformatika és kísérleti megközelítések vizsgálatára szabályozási kapcsolatát miRNS és a p42.3 gént. Kimutattuk, hogy a miR-29a is elnyomják p42.3 kifejezés mind az mRNS és fehérje szinten keresztül közvetlenül kötődését 3'UTR. Továbbá, egy inverz összefüggés volt megfigyelhető a miR-29a és p42.3 expresszió gyomorrák sejtvonalakon és GC szövetminták, különösen azokban az esetekben, ahol a p42.3 volt downregulált. Mindent összevetve, már felderítették korábban fel nem ismert szerepei a miR-29a, és jelezte, hogy a miR-29a működhet, legalábbis részben, megcélozva p42.3 gén humán GC. Katalógusa

Citation: Cui Y, Su WY Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) a miR-29a gátolja a sejtek proliferációs és sejtciklusleállást keresztül downregulációját p42.3 Humán gyomorrákban. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10,1371 /journal.pone.0025872 katalógusa

Szerkesztő: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanyolország katalógusa

Beérkezett: Február 28, 2011; Elfogadva: szeptember 13, 2011; Megjelent: október 5, 2011 katalógusa

Copyright: © 2011 Cui et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka ben támogatták a Nemzeti Alap Research Program Kína 973 programot (2010CB5293, a National High Technology Kutatási és Fejlesztési Program of China (863 program) (2006AA02A402, a Nemzeti Természettudományi Alapítvány kulcs Program (No. 30830055) és a minisztérium Közegészségügyi, Kína (No. 200802094) a FJY. a finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. katalógusa

Érdekütközés: a szerzők kijelentették hogy nem versengő érdekek léteznek.

Bevezetés

p42.3 egy új gén, amely a közelmúltban izolált és azonosított, az mRNS-t differenciális display (mRNADD) technikával. a teljes hosszúságú cDNS-t a p42 0,3 kb 4,0 kb, és a gén egy 389 aminosavból (aa) fehérje, amely a becslések szerint molekulatömege 42,3 kDa. További kutatások során kiderült, hogy az expressziója sejtciklus-függő a gyomorrák (GC) sejtvonalakban. A fehérje expressziója csúcsok M fázisában a sejtciklus, mielőtt fokozatosan csökkent után a sejtosztódást; ez azt jelzi, hogy p42.3 lehet vonni a sejtciklus szabályozásában. Továbbá csendesítése p42.3 kis interferáló RNS-t (siRNS-t) eredményezi a túlszabályzását CHK2 és a downregulációját ciklin B1, amely két kulcsfontosságú szerepet játszó fehérjék a sejtciklus szabályozásában [1], [2]. Míg RT-PCR és immunhisztokémiai elemzések kimutatták, hogy a p42.3 felülszabályozott GC képest normális szövetminták, funkcionális kutatás azt javasolta, hogy a kimerülése p42.3 nemcsak eredményezheti gátlását GC sejtproliferáció és telepképződést in vitro katalógusa, de az is jelentősen csökkentheti tumorképző meztelen egerekben [3]. Bár a korábbi vizsgálatok arra utaltak, döntő szerepet játszik az p42.3 gén kóroktanával GC, az adott mögöttes mechanizmusok a keresete még tisztázásra vár. Katalógusa

A mikroRNS (miRNS) áll egy osztály a kis (~ 22 nukleotid), endogén, nem kódoló RNS-ek, amelyekről ismert, hogy játszanak fontos szabályozási szerepet génexpresszió [4]. Az elsődleges miRNS transzkriptum nevezzük pri-miRNS [5], amely az RNS-polimeráz-II vagy III [6], [7]. A pri-miRNS ezután hasítjuk a Drosha-DGCR8 mikroprocesszor komplex előállítására a prekurzor hajtű molekula (pre-miRNS), amelyet majd exportált a sejtmagból a citoplazmába által exportin-5 /Ran-GTP. A segítséget egy komplex, amely tartalmazza az RN-áz Dicer és a kettős szálú RNS-kötő fehérje, TRBP, a ~70-nukleotid pre-miRNS feldolgozásra kerül érett miRNS [8]. A funkcionális szála az érett miRNS betöltjük az RNS által indukált silencing komplex (RISC), amely tartalmazza a fehérjéket, argonaute (AGO) és Tnrc6, míg a másik szál általában lebomlik [9]. Az érett miRNS irányítja a RISC a tökéletlen komplementer szekvenciák cél mRNS elnyomni a rokon mRNS fordítás, elősegítik átirat bomlás, vagy mindkettő. [10] Úgy becsülik, hogy a legtöbb kódoló gének valószínűleg szabályozza miRNS-ek, és miközben egy miRNS szabályozhatják egynél több megcélzott gének, bizonyos gének lehet szabályozni többszörös miRNS [11].

Egyre több bizonyíték azt sugallja, hogy miRNS részt egy sor élettani és kóros folyamatokat, beleértve a fejlesztési, a differenciálódást, proliferációt és az apoptózist [12.13,14,15]. Bár rendellenességek miRNS expressziós állapították meg sok emberi tumorok, beleértve a vastagbél-, gyomor- és emlőrák [16], [17], hogy hány ilyen tumorok is bővül. Azonban a részletes funkcióit miRNS tumorokban még tisztázásra szorul. Katalógusa

A legújabb vizsgálatok arra utaltak, hogy a miR-29 komplex feladatokat a különböző betegségek. MiR-29a viselkednek, mint egy tumorszuppresszor mind a tüdő és a hasnyálmirigy rákos sejtvonalak, és így az exogén overexpressziója miR-29a eredményez jelentős csökkenését az invazív potenciál és proliferációját ezen sejtvonalak [18]. A tumor szuppresszor szerepe miR-29a is alátámasztják annak megfigyelt downregulation a széles spektrumú szilárd tumorok, beleértve a neuroblasztóma, szarkómák és agydaganatok [19]. Ezzel szemben, a miR-29a felülszabályozott indolens humán B-sejt krónikus limfocitás leukémia (B-CLL) [20] és akut mieloid leukémia (AML) [21], ami azt sugallja, egy lehetséges tumor promoter szerepet. Ezen túlmenően, a rendellenes expressziója miR-29a megtalálható sok nem rosszindulatú betegségek, többek között májfibrózis [22], a cukorbetegség [23] és az Alzheimer-kór [24]. Bár sok gén már megerősítette, hogy a közvetlen célpontjai miR-29a, például PPM1D [25], PI3K [26] és a neuron navigátor 3 [24], akkor csak nagyon kis töredéke a teljes gének miR-29a célokat.

a jelentés azt bizonyítjuk, hogy p42.3 expressziót mutatott a szintje egyaránt mRNS és fehérje miR-29a direkt célzás a 3'UTR a p42.3. MiR-29a lehetett elnyomni sejtproliferáció és indukál sejtciklus, legalábbis részben, keresztül a downregulációját p42.3 kifejezés. Sőt, azt találtuk, hogy a kifejezés a p42.3 fehérje fordítottan arányos miR-29a-expresszió emberi GC szövetekben.

Eredmények

p42.3-3'UTR van feltehetően által megcélzott miR -29a katalógusa

a vélt miRNS hogy jósoltak a cél a p42.3 gén több adatbázist elemeztek. A felső két miRNS amelyeket jósolnak háromszor választottak ki további megerősítése és a másik három miRNS, köztük a miR-29a, melynek feltételezett kötőhelyek közel hasonló volt az első kettő is kiválasztott jelöltek érvényesítésre. MiR-29a jósolta a TargetScan és miRGEN adatbázisok, ami azt jelezte, hogy a feltételezett kötőhely volt pozíciókban 213-219 A p42.3-3'UTR (1A). A többi jelölt nem szerepel itt. Katalógusa

Közvetlenül célzó p42.3-3'UTR által miR-29a katalógusa

A riporter gén assay-t alkalmazunk annak megerősítését, hogy p42.3 volt közvetlen célpontjai a miR-29a. A vad típusú és mutáns p42.3-3'UTR tartalmazó feltételezett kötőhely miR-29a klónoztuk az egyedi plazmidok és olvasztott a riporter gént. A fluoreszcens intenzitás a riporter gén szignifikánsan csökkent a csoportban, amelyet együtt transzfektáltuk WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 és pcDNA3.1 /pri-miR-29a a kontrollhoz képest. Ezen felül, nem volt szignifikáns csökkenés a fluoreszcens intenzitás a csoportban volt kotranszfektáltuk MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (1B ábra), továbbá megerősíti, hogy a miR-29a indukálta a downregulációját p42.3 génexpresszió keresztül specifikus kötődését a feltételezett helyén a p42.3-3'UTR. katalógusa

Expression miR-29a és p42.3 fordítottan arányos a GC sejtvonalak

Annak tisztázására, közötti kapcsolat p42 0,3 és miR-29a, tanulmányoztuk az endogén expresszióját miR-29a és p42.3 hat az emberi GC sejtvonal (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 és AGS) és egy normál gyomornyálkahártya sejtvonal (GES-1; ábra a 2A-C). Azt találtuk, hogy a szint a p42.3 mRNS szignifikánsan magasabb volt, mint a normál kontroll minden GC sejtvonalak a következők kivételével SGC-7901, ahol a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns. Az expressziós szintjének p42.3 változó volt a fehérje szinten, de szignifikánsan nagyobb volt minden a GC sejtvonalak képest GES-1.We is kimutatta, hogy a miR-29a expresszió alacsony volt a négy GC sejtvonalak ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 és AGS), amely feltárta, inverz összefüggést p42.3 kifejezést. Bár a kifejezés a miR-29a magas volt SNU-1, ez nem volt statisztikailag szignifikáns. Érdemes megemlíteni, hogy a magas szintű expresszióját miR-29a a MKN-28 volt kivétel. Katalógusa

miR-29a szabályozza p42.3 kifejezése katalógusa

Annak eldöntésére, hogy p42.3 ben leverte miR -29a, mi kezelt MKN-45 sejtek az utánozza és inhibitorai miR-29a 48 órán annak érdekében, hogy exogén módon fel- és downregulate expresszióját miR-29a specifikusan; a kifejezés a p42.3 Ezután meghatároztuk. Miután a transzfekciója MKN-45 sejtek az utánozza, a miR-29a expresszió növekedése mintegy 10-szeres, míg a kezelés az inhibitorok csökkent a miR-29a szint több, mint 50% (ábra a 3A-B). Ez arra utal, hogy mind az utánzók és inhibitorok miR-29a hatékonyan dolgozott a kísérletekben. Túlexpressziója miR-29a jelentősen elnyomják a kifejezés p42.3 mind mRNS, mind fehérje szinten, ami hasonló hatást érhetünk el a hangtompító a p42.3 által p42.3 siRNS (si-p42.3). Azt is kimutatták, hogy a CHK2 volt túlszabályozott és cyclinB1 volt downregulált után elhallgattatása p42.3 által p42.3 siRNS. Érdekes, hogy hasonló hatást gyakorolt ​​CHK2 és cyclinB1 a túltermelése miR-29a a MKN-45 sejtek (ábra 3C-D). Emellett transzfekciója miR-29a-gátlók jelentősen csökkent CHK2 kifejezés és fokozott p42.3 és cyclinB1 kifejezés (ábra 3E-F). Ez arra utal, hogy a miR-29a lehetne szabályozni a kifejezés a p42.3 gén MKN-45 sejtekben. Katalógusa

A miR-29a gátolja sejtburjánzást in vitro katalógusa

Az adatok szerint a sejtburjánzás assay, felhívtuk a nedvszívó görbék a 450 nm hullámhossznál a transzfekció után különböző ideig. Azt találtuk, hogy a sejtproliferációt szignifikánsan gátolta a transzfektálás után a MKN-45 sejtek p42.3 siRNS 48 óra és 72 óra, és hasonló mintát után észlelték, sejteket transzfektáltunk a utánozza a miR-29a. Mértéke azonban az elnyomás által elért miR-29a utánozza nagyobb volt, mint p42.3 siRNS által indukált alulszabályozottsághoz (4A). Éppen ellenkezőleg, a sejtnövekedést került elő mintegy 10%, míg a negatív kontroll, amikor transzfektált inhibitorok miR-29a, 48 órán, de volt a csökkenés 72 óra (4b ábra). Ez azt jelzi, hogy a miR-29a gátolhatja sejtburjánzást keresztül elnyomja a kifejezés p42.3. Katalógusa

miR-29a blokkolja a sejtciklus előrehaladását katalógusa

elhallgattatása p42.3 által p42.3 siRNS eredményezhet sejtciklus leállítását; Ezért megvizsgáltuk, hogy a miR-29a befolyásolhatja a sejtciklus előrehaladását keresztül megcélzó p42.3 gént. Miután MKN-45 sejteket transzfektáltunk p42.3 siRNS 48 órán át, azt találtuk, hogy a sejtciklus blokkolva volt a G1 fázisban (75,93%, p
< 0,05), míg a negatív kontroll ( 66,18%). Azt találtuk, hogy utánozza a miR-29a is indukálja G1 fázisban letartóztatását MKN-45 sejtek kezelés során 48 óra (75,56%, P katalógusa < 0,05; 5. ábra). Katalógusa

Expression miR-29a és p42.3 fehérje GC és korrelációja klinikopatológiai jellemzők katalógusa

a kvantitatív valós idejű PCR-technikával, a miR-29a kimutatható volt 60 pár GC szövetek és kiegyenlített, nem daganatos szomszédos szövetek, míg p42.3 fehérje szinten is vizsgálták ezekben a szövetekben Western-blottal. 60-ból GC szövetek minták p42.3 kifejezés magas volt 35 esetben (35/60, 58,33%) képest a párosított nem rákos környező szöveteket. A 25 esetben, amelyben p42.3 kifejezést downregulált, miR-29a kifejezés magas volt, 21 esetben. MiR-29a expresszió alacsony, 27 esetben (27/60, 45%). A fenti adatok azt sugallják, inverz kapcsolata miR-29a és p42.3 fehérje expresszió szövetminták ( P katalógusa = 0,000, az 1. táblázat és a 6. ábra), de a korrelációs együttható nem volt jó (r = -0,316 ).

Továbbá, miR-29a és p42.3 fehérje expresszióját vizsgáltuk, tekintettel a klinikopatológiai jellemzőit 60 beteg, akinek szöveti mintát vettünk. Eredményeink azt, hogy nem volt egyértelmű korrelációt p42.3 fehérje és miR-29a kifejezés, illetve a klinikopatológiai jellemzők (2. táblázat). Katalógusa

Vita katalógusa

A p42.3 gén igen konzervált emlősökben, és mint egy onkogént, előfordulhat, hogy fontos szerepet játszanak a progresszív átalakulás normál gyomornyálkahártya sejtek rákos sejteket. A differenciális expresszió a sejtciklus során szakaszai során kiderül, hogy p42.3 lehet vonni a sejtciklus szabályozásában. Ezt alátámasztotta az eredményeink, amely azt mutatta, hogy a p42.3 silencing amelyek megváltoztathatják a kifejezés a két kulcsfontosságú fehérjék, CHK2 és ciklin B1, hogy részt vesznek a sejtciklus szabályozásában. Segítségével loss-of-funkció Kísérleteink igazolták, hogy p42.3 is stimulálja a sejtek proliferációját és jelentett, eredményeink azt mutatták, hogy p42.3 volt túltermelõdik GC szövetekben, ha összehasonlítjuk a szomszédos, nem rákos nyálkahártya [3]. Azonban a molekuláris mechanizmusok eredményeként ebben aberráns expresszióját p42.3 gén GC nehezen érthető, mivel nyilvánvaló az nem a rendelkezésre álló irodalom. MiRNS génexpressziót megcélzásával a kötőhelyek a megcélzott mRNS-ek [27], és a humán rákok számos miRNS már érintett. Azonban a függvény csak néhány került érteni a mai napig, különösen a GC [28]. Katalógusa

Ebben a jelentésben a kiválasztott miR-29a további vizsgálatot a riporter gén rendszert, és végül megállapította, hogy p42. 3 volt a közvetlen cél gén miR-29a. Adataink azt javasolta, hogy a négy adatbázis (TargetScan, microRNA.org, mikrokozmosz Targets 5-ös verzió és miRGen) a következők voltak hatékonyak, de nem tökéletes, eszközök a jóslat miRNS célokat, és feltéve, kísérleti bizonyítékot javulást a mögöttes algoritmus. Katalógusa

Megmutattuk, hogy p42.3 kifejezés fordítottan arányos a miR-29a kifejezés négy GC sejtvonalak. Ezek közül háromban, MKN-45, MGC-803 és AGS, ez nyilvánvaló volt mind az mRNS és fehérje szinten, de nem ez volt a helyzet az SGC-7901 sejtvonal. Ezen túlmenően, a miR-29a expresszió nem volt alacsony a MKN-28 és SNU-1 sejtvonalak. Együttesen ezek a megfigyelések lehetővé tette számunkra, hogy azt feltételezik, hogy a szabályozó szerepét miR-29a bonyolítja GC sejtvonalak és miR-29a játszhat különböző szerepeket különböző celluláris háttérrel. Azonban a részletes mechanizmusai miR-29a funkciók GC sejtvonalak további vizsgálatokat igényel. Katalógusa

Vizsgálatunk miR-29a túltermelése idézhet hasonló hatást ezek által elért elhallgattatása p42.3 által p42.3 siRNS. Mindkét p42.3 mRNS és fehérje voltak downregulált után sejteket transzfektáltunk p42.3 siRNS vagy miR-29a utánozza, és a sejt proliferációt és sejtciklus elnyomták, amikor a sejteket ment ugyanazon interferencia. Azt javasolta, hogy a miR-29a lehet vonni patogenezisében GC keresztül elnyomása p42.3 génexpresszió. Ugyanakkor azt találtuk, a növekedési görbék, hogy a mértéke elnyomása miR-29a utánozza nagyobb volt, mint a p42.3 siRNS. Véleményünk szerint a fő oka az lehet, hogy egyedi miRNS lehetne szabályozni száz gén irányítani a sejtműködést. A jelen vizsgálatban, miR-29a gátolhatja a sejtproliferációt, legalábbis részben, megcélzásával p42.3.

adatok azt mutatták, hogy bár az arány a magas expressziós miR-29a 55% volt (33 /60) a GC, p42.3 kifejezés alacsony volt 21 esetben. Ez arra utal, hogy a miR-29a lehet létfontosságú szerepet GC szövetekben szintje alacsony p42.3. Katalógusa

A jelen tanulmányban azt igazolta, hogy p42.3 közvetlen célpontja a miR-29a. Azt is kimutatták, hogy a miR-29a képes gátolni a sejtproliferációt, és blokkolja a sejtciklust, legalábbis részben, keresztül a elnyomása p42.3 expresszió GC. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a miR-29a játszhat fontos szerepet expresszióját szabályozó p42.3 GC. Érdekes módon azt találtuk, hogy p42.3 gén is expresszióját szabályozzák miR-29a (az adatokat nem mutatjuk be), de az alapvető szabályozási mechanizmust fogják vizsgálni a jövőben. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Bioinformatikai katalógusa

Négy hatékony számítási módszerek, hogy kihasználja a különböző értékelési rendszerek [29] - [32] használtuk a jóslat a szabályozási miRNS érint, melyek az p42.3 gént, amely tartalmazza TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/) mikrokozmosz Targets 5-ös verzió (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv /mikrokozmosz /htdocs /célok /v5 /) és miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Célokat választottunk ki további megerősítést a csoport miRNS, amelyek közösek a eredményekből egynél több keresést. Katalógusa

A szövetminták

hatvan pár szövettanilag is megerősítették GC és a szomszédos, nem rákos szövetet vettünk átesett betegek sebészi eltávolítását a Renji kórház csatlakozott a Shanghai Jiaotong Orvostudományi Egyetem, Kína között 2007 júliusa és 2009. január kiegyenlített, nem rákos szomszédos szöveteket szereztünk legalább 5 cm-re a daganat helyén. A tanulmány által jóváhagyott Kutatási Etikai Bizottságának Shanghai Jiaotong Egyetem és beleegyezését adta az összes betegnél, míg írásos beleegyezése kaptuk a betegnél. Katalógusa

Sejtvonalak és tenyésztési körülmények katalógusa

Az emberi GC sejtvonalak, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 és AGS, valamint a GES-1 normál gyomornyálkahártya sejtvonal, amely az ATCC-től (USA), RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A sejteket 37 ° C hőmérsékleten, 5% CO _{2 inkubátorban. Ezután tripszin (0,25%) használtunk, hogy elválassza a sejteknek a tenyésztő lombikba.}

vektorkonstrukció

A konstrukció expressziós vektorok pri-miR-29A-t először amplifikáljuk primerekkel által tervezett Primer Premier 5.0 szoftver (3. táblázat), majd klónoztuk pcDNA3.1 (Invitrogen). Előállításához a plazmidok, amely tartalmazta a feltételezett kötőhely miR-29a, mind a vad típusú és mutáns szekvenciákat helyzetben 111-380 a p42.3-3'UTR kémiailag szintetizált (1a ábra), majd klónoztuk a downstream az EGFP gén Bam katalógusa HI és Eco RI katalógusa helyek a pcDNA3 /EGFP vektorba (Saierbio, Tianjin, Kína). katalógusa

Riporter gén vizsgálata katalógusa

MKN-45 sejteket beoltottuk három párhuzamos lyukból a 24 lyukas lemez napján a transzfekció előtt. PcDNA3.1 (+) /primer-miR-29a kotranszfektáltunk vad típusú és MUT-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR volt. Ezután 0,5 ng pcDNA3.1 (+) /primer-miR-29a és 0,5 ug pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR adtunk mindegyik a kutak, míg a 0,1 ug vektort pDsRed-C1 (Clontech ), amelyek kifejezték az RFP, adunk minden valamint egy endogén referencia. A sejteket, amelyek csak a transzfektált pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR vagy pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+) használunk az ellenőrzéseket. A sejteket összegyűjtöttük 48 órával a transzfekció után, és megvizsgáljuk az intenzitása EGFP és RFP fluoreszcencia detektáltuk fluoreszcens spektrofotométerrel F-4500 (Hitachi, Japán).

Cell transzfekció

transzfekciója MKN-45 sejtek segítségével végeztük Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) protokollt követve a gyártó. MKN-45 sejteket oltottunk 6 mérőhelyes lemezekre vagy 96-lyukú lemezeken, 30% összefolyás előtti napon a transzfekció. Utánzók (100 nM, GenePharma) és gátlók (200 nM, RIBOBIO) miR-29a használták külsőleg fel és downregulate kifejezése miR-29a. Elnémításához p42.3 génexpresszió, az MKN-45 sejteket transzfektáltunk elleni siRNS p42.3 (Si-p42.3, 100 nM, GenePharma). A kontroll RNS (néven NC) volt, a nem homológ bármely humán genom szekvenciáját. Szekvenciáit az oligo nukleotidok 4. táblázatban mutatjuk be

Valós idejű RT-PCR

Teljes RNS-t izoláltunk Trizol reagens (Invitrogen), és ezt követően ezzel kezelik RNáz-mentes DNáz I ( Fermentas, San Diego, CA, USA). A teljes RNS (500 ng) reverz transzkripció révén PrimeScript RT reagens készlettel (Takara, Dalian, Japán). A primer szekvenciák amplifikálására alkalmaztuk p42.3 és GAPDH táblázatban mutatjuk be 3. Annak vizsgálata, a kifejezés az érett miR-29a, 2 ug teljes RNS-t reverz transzkripció segítségével az All-in-One miRNS Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia, Guangzhou, Kína). Kvantitatív valós idejű PCR érett miR-29a és U6 szerint végeztük a gyártó utasításai az ABI 7300 real-time PCR rendszer és a specifikus primerek által tervezett GeneCopoeia, Kína. A relatív expresszióját p42.3 és miR-29a normalizáltuk egy endogén referencia (GAPDH és U6 kis nukleáris RNS -kal), és a kontrollhoz viszonyítva. Az eredményeket mint szeres változást, kiszámítani 2 (-ΔΔCT) módszer [33]; relatív expressziós arány < 1,0 tekintettük alacsony, míg az arány > 1,0 tekintettük magas expressziós [14].

Western blot

Összes fehérje a tenyésztett sejtekből és szövetekből nyerték meg RIPA tartalmazó lízis puffert PMSF, a gyártó utasításai szerint (Beyotime, Shanghai, Kína). A fehérje koncentrációját mértük a Bradford módszerrel [34]. Összességében, 40 ug fehérje elektroforézisnek vetettünk 10% -os SDS poliakrilamid gélen és átvisszük PVDF membránra (Millipore). A membránt inkubáltuk p42.3 antitesttel (1:500, Abmart, Kína), CHK2 antitest (1:1,000, CST), cyclinB1 antitest (1:1,000, CST) vagy GAPDH (1:5,000, Kang Chen, Kína) 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át. Másodlagos antitestek jelölt HRP (Kang Chen, Kína) és a jeleket alkalmazásával detektáltuk ECL kit (Pierce, Biotech., Rockford, IL, USA). Ezt követően a képeket elemeztük ImageJ 1.43 szoftver. A fehérje expresszióját normalizáltuk egy endogén referencia (GAPDH) és a kontrollhoz viszonyítva. A relatív expressziós arány < 1,0 tekintettük alacsony expressziót, míg az arány > 1,0 tekintettük magas expressziós [14].

Cell proliferációs vizsgálati

aratott MKN-45 sejtek (körülbelül 5 x 10 ^{4 sejtek) oltottunk 96 lyukú tenyésztő lemezeken. Sejtburjánzás mértük 24 óra, 48 óra és 72 óra post-transzfekció, illetve a sejtszámlálás Kit-8 (Dojindo, Japán) határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. Az abszorbanciát hullámhosszon 450 nm-es, ami azt mutatja, pozitív kapcsolatban kapacitás sejtproliferáció, határoztuk meg spektrofotométerrel (E-LIZA MAT-3000).}

Sejtciklus esszé

Negyven -eight órával a transzfekció után a sejteket felemelhető 0,25% tripszint és mossuk DPBS-ben (Gibco); ők majd rögzíteni 70% -os etanollal -20 ° C-on 24 órán át. Az áramlási citometriás analízissel (EPICS XL Beckman Coulter), sejteket inkubáltunk RNáz (Fermentas) 37 ° C-on 30 percig kezeljük, PI (Sigma), és szuszpendáljuk 300 ul DPBS.

Statisztikai elemzés

az adatok kimutatták, átlag ± SD legalább három külön kísérletben. Jelentőségét vizsgáltuk a Student-féle t-próbát és nem paraméteres teszteket (Mann-Whitney U teszt és Kruskal-Wallis H teszt). A statisztikai jelentőségét összefüggés kifejezése miR-29a és p42.3 fehérje számítják chi-négyzet próba és Spearman korreláció. A statisztikai elemzést az SPSS 13.0 szoftver (IBM, USA) és a különbségek statisztikailag szignifikánsnak tekintettük át P katalógusa < 0.05. Katalógusa

• PLoS One: elvesztése a promielocitás leukémia fehérjét gyomorrákban: következmények az IP-10 expresszió és tumor-infiltráló Lymphocytes
• PLoS One: prognosztikai miR-181B és a miR-21 gyomorrákban kezelt betegeknél S-1 /oxaliplatin vagy doxifluridin /Oxaliplatin