Als nei identifizéiert a charakteriséiert Gentherapie, p42.3 ass mat Zell Prolifératioun an tumorigenicity assoziéiert. Den Ausdrock vun p42.3 ass am mënschleche gastric Kriibs (GC), mee seng Basisdaten Mechanisme vun Aktioun sinn net gutt verstanen upregulated. MicroRNAs (miRNAs) si bekannt kruzial reglementaresche Mesuren an vill bewosst Prozesser ze spillen. Hei geheescht mir Bioinformatik an experimentell Approche de reglementaresche Relatioun tëscht miRNAs an der p42.3 Gentherapie ze ermëttelen. Mir weisen dass Mir-29a souwuel um p42.3 Ausdrock der mRNA an FAQ Niveauen via direkt bindend fir hir 3'UTR géint konnt. Doriwwer eraus, war en ëmgedréit, et gesäit Relatioun tëscht Mir-29a an p42.3 Ausdrock vun gastric Kriibs Zell Linnen an GC Otemschwieregkeeten Echantillonen, virun allem am Fäll observéiert wou p42.3 downregulated war. Geholl zesummen, mir hu virdrun dei Rollen vun Mir-29a opgekläert an uginn, datt Mir-29a Funktioun kann, op d'mannst deelweis, duerch d'p42.3 Gentherapie zu Mënsch GC gezielt VerfÜgung
Fro:. CUI Y, Su em , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) Mir-29a bremst Zell Zouhuelen an Induces Zell Cycle Arrest duerch d'Downregulation vun p42.3 zu Mënscherechter Gastric Cancer. PLoS NËMMEN 6 (10): e25872. Doi: 10.1371 /journal.pone.0025872 VerfÜgung
Redakter: Alfons Navarro, Universitéit vu Barcelona, Spuenien VerfÜgung
Arnaque: 28. Februar 2011; Akzeptéiert: 13. September, 2011; Publizéiert: Oktober 5, 2011 VerfÜgung
Copyright: © 2011 CUI et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung
Funding:. Dës Aarbecht war déi Subventioune vun der National Grondakommes Research plangen vu China 973 Programm (2010CB5293 ënnerstëtzt, den National Natural Science Foundation vun Key plangen (Nr 30830055) an de Ministère vun der nationaler High Technology Fuerschung an Entwécklung plangen vu China (863 plangen) (2006AA02A402, . d'ëffentlech Gesondheet, China (Nr 200802094) ze FJY d'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung
Wettsträit Interessen:. d'Auteuren deklaréiert hunn datt keng Competitioun Interessen existéieren. VerfÜgung
p42.3 ass eng Verfilmung Gentherapie datt kuerzem isoléiert an identifizéiert vun der mRNA Ënnerscheed Ecran (mRNADD) Technik. d'voll-Längt cDNA vun p42 gouf .3 ass ongeféier 4,0 kB, an der Gentherapie encodes eng 389 Aminosaier (AA) FAQ datt e molekulare Mass vun 42,3 kDa ze hunn ass geschat. Weider Fuerschung huet verroden, datt hiren Ausdrock Zell Zyklus-ofhängeg vun gastric Kriibs (GC) Zell Linnen ass. Seng FAQ Ausdrock Moundalpen nëmmen während der M Phase vun der Zell Zyklus, ier no der Zell Divisioun falender; dëst weist datt p42.3 zu Zell Zyklus Regulatioun Équipe kann. Ausserdeem, silencing vun p42.3 duerch kleng interfering RNS (siRNA) Resultater am upregulation vun CHK2 an der downregulation vun cyclin B1, deen zu Zell Zyklus Regulatioun Équipe zwee Schlësselwierder Proteinen sinn [1], [2]. Iwwerdeems RT-Hinnen alleguer an immunohistochemical Analysë gewisen hunn, datt p42.3 am GC Verglach mat normal Otemschwieregkeeten Echantillon upregulated ass, huet funktionell Fuerschung ugeholl, datt d'Ausschöpfung vun p42.3 an der inhibition vun GC Zell Prolifératioun a Kolonie Équipe net nëmmen Resultat kann kënschtlech VerfÜgung, mee och vill tumorigenicity an Sauna mais reduzéiere kënnen [3]. Obwuel virdrun Studien enger kritescher Roll fir d'p42.3 Gentherapie an der wirklech vun GC proposéiert hunn, bleiwen d'spezifesch Basisdaten Mechanisme vun hirer Aktioun Keess ze ginn. VerfÜgung MicroRNAs (miRNAs) vun enger Klass vu klenge begräifen (~ 22 nucleotides), endogenous, net-coding RNAs datt wichteg reglementaresche Rollen vun der Gentherapie Ausdrock ze spillen si bekannt [4]. Der Primärschoul miRNA ët ass pri-miRNA [5] genannt, déi vun RNS polymerase II oder III ausserdeem ass [6], [7]. D'pri-miRNA ass dann déi Drosha-DGCR8 microprocessor komplex eenalecn Virleefer hairpin Protein (Précoce-miRNA) deen aus ervirgaangen ass dunn duerch exportin-5 /Ran-GTP dem Zytoplasma exportéiert ze produzéieren. Mat der Hëllef vun enger komplexer datt d'RNase Dicer an der double-gekëmmert RNS-verbindlech FAQ enthält, TRBP, déi ~70-Nukleotid Pre-miRNA ass an eeler miRNA Filteren [8]. Déi funktionell staarkt vun der eeler miRNA ass nees komplex (RISC), silencing entschlof RNS-iwwerlaascht wat d'Proteinen enthält, argonaute (Deeg) an Tnrc6, während déi aner staarkt normalerweis deforméiert ass [9]. Déi eeler miRNA Guiden der RISC dem bruëcht ergänzen Message vun Zil- mRNAs der cognate mRNA Iwwersetzung ze géint, ët Zerfall förderen, oder béiden [10]. Et gëtt ugeholl, datt déi meescht coding Genen wahrscheinlech duerch miRNAs regulariséiert ginn, an während enger miRNA vläicht méi wéi een Zil Genen regléieren, bestëmmte Genen kann duerch verschidde miRNAs regulariséiert ginn [11]. VerfÜgung Volume Beweiser hindeit datt miRNAs Équipe sinn zu engem Netzwierk vu gestallt an agebousst Prozesser, dorënner Entwécklung, dat, Prolifératioun an apoptosis [12.13,14,15]. Obwuel abnormalities vun miRNA Ausdrock an vill mënschlech erhéijen bestëmmt goufen, dorënner colorectal, gastric an Broscht Cancers [16], [17], ass d'Zuel vun esou erhéijen nach ausbauen. Allerdéngs bleiwen déi detailléiert Funktiounen vun miRNA zu erhéijen opgekläert ze ginn. VerfÜgung rezenten Etuden hu proposéiert, datt Mir-29 komplexe Funktiounen am verschidde Krankheete huet. Mir-29a kann als entholl suppressor zu souwuel haett an pancreatic Kriibs Zell Linnen, an domat d'exogenous overexpression vum Mir-29a Resultater an engem däitleche Minus an der invasiv Potential an Verbreedung vun dësen Zell Linnen [18] mécht. D'entholl suppressor Roll vum Mir-29a ass och duerch seng observéiert downregulation zu engem breede Spektrum vun zolidd erhéijen, inklusiv neuroblastoma, sarcomas an Gehir erhéijen [19] ënnerstëtzt. Am Géigesaz, ass Mir-29a zu indolent Mënsch B-Zell chronescher Rezepter Leukämie (B-CLL) [20] an de Fouss Servicer sinn Leukämie (AML) [21], upregulated déi eng méiglech entholl Promoteur Roll mobiliséiert. Ausserdeem kann den aberrant Ausdrock vu Mir-29a zu vill Net-malignant Krankheete fonnt ginn, dorënner Liewer fibrosis [22], Diabetis [23] an Alzheimer [24]. Obwuel vill Genen schonn confirméiert gouf den direkten Ziler vum Mir-29a, wéi PPM1D ginn [25], PI3K [26] an neuron Séifuerer 3 [24], representéieren se eng ganz Ëmwandlung vun der total Genen dass Mir-29a Ziler. VerfÜgung am Moment Rapport, weisen mir dat p42.3 Ausdrock um Niveau vun den zwou mRNA an FAQ vum mir-29a via direkt Reklamme vun der 3'UTR vun p42.3 kontrolléiert gouf. Mir-29a konnt Zell Prolifératioun oofgesinn an Zell Zyklus verhaft induce, op d'mannst zu engem Deel, via d'downregulation vun p42.3 Ausdrock. Desweideren, fonnt mir dass den Ausdrock vun p42.3 FAQ inversely mat Mir-29a Ausdrock vun mënschlecher GC Stoffer soll war. VerfÜgung p42.3-3'UTR ass putatively geziilte vum Mir -29a VerfÜgung Putative miRNAs datt d'p42.3 Gentherapie vun méi wéi eng Datebank ze viséieren virausgesot huet sech analyséiert. Déi zwou bescht miRNAs wat fir dräimol virausgesot huet sech fir weider Bekräftegung an déi aner dräi miRNAs ausgewielt, dorënner Mir-29a, hir putative bindend Siten hätten déi vun der erop zwee och als Kandidaten fir Confirmatioun ausgewielt goufen. Mir-29a war vun der TargetScan an miRGEN Datenbanken virausgesot, déi uginn, datt seng putative bindend Site bei Positiounen war 213-219 vun der p42.3-3'UTR (Dorënner 1A). Déi aner Kandidaten sinn net hei opgezielt. VerfÜgung gezielt direkt d'p42.3-3'UTR vum Mir-29a VerfÜgung De Rapporteur Gentherapie assay agestallt war ze validéieren, ob p42.3 engem direkten Zil war vum Mir-29a. Wild-Typ an Mann- p42.3-3'UTR der putative bindend Site vum Mir-29a wou sech an eenzelne plasmids gekloonten a mat de Rapporteur Gentherapie Method. D'unisse Intensitéit vun de Rapporteur Gentherapie war ofgeholl vill am Grupp, déi mat WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 an pcDNA3.1 /pri-Mir-29a Verglach zu der Kontroll Co-transfected war. Ausserdeem war et kee groussen Ënnergang vun der unisse Intensitéit vun der Grupp, déi mat MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (Dorënner 1B), weider confirméiert, dass Mir-29a entschlof de downregulation vun p42.3 Gentherapie Ausdrock via de Co-transfected war spezifesch bindend vun der putative Site vun der p42.3-3'UTR. VerfÜgung Expression vum mir-29a an p42.3 sinn inversely am GC Zell Linnen Zesummenhang VerfÜgung fir de Lien tëscht p42 Gewerkschaften .3 an mir-29a, studéiert mir de endogenous Ausdrock vu mir-29a an p42.3 zu sechs Mënsch GC Zell Linnen (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 an AGS) an eng normal gastric epithelium Zell Linn (GES-1; Dorënner 2A-C). Mir hu fonnt, datt de Niveau vun p42.3 mRNA bedeitend méi héich wéi déi normal Kontroll vun all GC Zell Linnen mat der Ausnam vun SGC-7901 war, wou d'Differenz net statistesch relevant war. Den Ausdrock Niveau vun p42.3 op d'FAQ Niveau Variabel ass, mee war an all de GC Zell Linnen bedeitend méi héich wéi am Verglach mat GES-1.We zougedréckt och dass Mir-29a Ausdrock zu véier vun de GC Zell Linnen héich war ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 an AGS), déi en ëmgedréit, et gesäit Relatioun mat p42.3 Ausdrock verroden. Obwuel den Ausdrock vun Mir-29a zu SNU-1 héich war, war dat net statistesch relevant. Et ass derwäert ze ernimmen, datt d'héich Ausdrock vu Mir-29a zu MKN-28 eng Ausnam war. VerfÜgung Mir-29a p42.3 Ausdrock VerfÜgung reguléieren ob ze diskutéieren p42.3 duerch Mir repressed war -29a, mir behandelt MKN-45 Zellen mat der mimics an inhibitors vum mir-29a fir 48 h an Uerdnung ze exogenously Bastelen a downregulate den Ausdrock vun mir-29a speziell; den Ausdrock vun p42.3 war dunn alles. No der transfection vun MKN-45 Zellen mat der mimics, de Mir-29a Ausdrock vun ongeféier 10-fantastesch, iwwerdeems d'Behandlung mat der inhibitors fräi Mir-29a Niveau ofgeholl vun méi wéi 50% (Dorënner 3A-B). Dëst ugeholl, datt souwuel de mimics an inhibitors vum Mir-29a effizient an eisem Experiment geschafft. Overexpression vum Mir-29a konnt den Ausdrock vun p42.3 souwuel d'mRNA an FAQ Niveau däitlech géint, déi engem ähnlechen Effekt op d'silencing vun p42.3 vun p42.3 siRNA war (si-p42.3). Mir nogewise och dass CHK2 war upregulated an cyclinB1 war no der silencing vun p42.3 vun p42.3 siRNA downregulated. Spannen, waren ähnlech Effekter Nofolleg op CHK2 an cyclinB1 vun der overexpression vum Mir-29a zu MKN-45 Zellen (Dorënner 3C-D). Zousätzlech, transfection vum Mir-29a inhibitors ofgeholl dramatesch CHK2 Ausdrock a fräi p42.3 an cyclinB1 Ausdrock (Dorënner 3-F). Dëst ugeholl, datt Mir-29a den Ausdrock vun der p42.3 Gentherapie zu MKN-45 Zellen regléieren konnt. VerfÜgung Mir-29a Zell Prolifératioun bremst kënschtlech VerfÜgung Laut den Donnéeë vun der Zell Prolifératioun assay, ausgestreckt mir de saugfäheg Kéiren op der Wellelängt vun 450 nm der transfection fir verschidden durations. Mir hu fonnt, datt Zell Prolifératioun däitlech no der transfection vun MKN-45 Zellen mat p42.3 siRNA fir 48 h an 72 h inhibited war, an engem ähnleche Muster war fest no Zellen mat mimics vum Mir-29a transfected goufen. d'Ausmooss vun der Repressioun vum Mir-29a mimics erreecht Allerdéngs war méi grouss wéi p42.3 siRNA-entschlof downregulation (Dorënner 4A). Am Géigendeel, war Zell Wuesstem vun ongeféier 10% Opstieg, am Verglach zu den negativen Kontroll wann mat inhibitors vum Mir-29a fir 48 h transfected, mä et war e Réckgang um 72 h (Dorënner 4B). Dëst uginn dass Mir-29a Zell Prolifératioun via repressing den Ausdrock vun p42.3 inhibit konnt. VerfÜgung Mir-29a Bleck Zell Zyklus Werdegang VerfÜgung Silencing vun p42.3 vun p42.3 siRNA Resultat kann am Cycle verhaft Zell; also, mir propagéieren ob Mir-29a der Zell Zyklus Werdegang via gezielt p42.3 Gene betreffen konnt. No MKN-45 Zellen fir 48 h mat p42.3 siRNA transfected waren, hunn mir dass d'Zell Zyklus um G1 Phase gespaart gouf (75.93%, P VerfÜgung &Si besteet; 0,05), am Verglach mat den negativen Kontroll ( 66,18%). Mir hu fonnt, datt mimics vum Mir-29a och G1 Phase verhaft an MKN-45 Zellen induce hätt wann den 48 h behandelt (75.56%, P VerfÜgung &Si besteet; 0,05; Dorënner 5). VerfÜgung Expression vum Mir-29a an p42.3 FAQ am GC an hir Korrelatioun mat clinicopathological Charakteristiken VerfÜgung eng grouss real-Zäit Hinnen alleguer Technik benotzt, Mir-29a war zu 60 Puer GC Stoffer an hir gepasst Net-Kriibs bascht fonnt Stoffer, iwwerdeems p42.3 FAQ Niveau war och an dëse Stoffer déi Western blotting bewäert. Out vun 60 GC Stoffer Echantillonen, war p42.3 Ausdrock an 35 Fäll héich (35/60, 58,33%) relativ zu hire reagéiert Net-Kriibs bascht Stoffer. An der 25 Fäll an deenen p42.3 Ausdrock downregulated war, gouf Mir-29a Ausdrock an 21 Fäll héich. Mir-29a Ausdrock war an 27 Fäll niddereg (27/60, 45%). D'virun Date proposéiert en ëmgedréit, et gesäit Relatioun tëscht Mir-29a an p42.3 FAQ Ausdrock an Otemschwieregkeeten Echantillon ( P VerfÜgung = 0,000, Table 1 an Dorënner 6), mä déi Korrelatioun souguer gemaach war net gutt (r = -0,316 ). VerfÜgung Weideren Mir-29a an p42.3 FAQ Ausdrock mat Bezuch zu der clinicopathological Charakteristiken vun de 60 Patienten aus där Otemschwieregkeeten Echantillon waren geholl bewäert huet. Eis Conclusiounen ugeholl, datt et keng kloer kennenzeléieren tëscht p42.3 FAQ an Mir-29a Ausdrock huet, respektiv, mat clinicopathological Funktiounen (Table 2). VerfÜgung D'p42.3 Gentherapie ass héich zu Mamendéieren conserved an, wéi en oncogene, kann et eng wichteg Roll an der II Transformatioun vun normal gastric epithelium Zellen zu Kriibs Zellen Leeschtung. Seng Ënnerscheed Ausdrock während der Zell Zyklus Etappen verréid eis, datt p42.3 zu Zell Zyklus Regulatioun Équipe kann. Dëst gouf weider vun eise Resultater bestätegt, déi weisen, datt p42.3 silencing den Ausdrock vun zwou Schlëssel Proteinen ofzeänneren konnt, CHK2 an cyclin B1, déi am Zell Zyklus Reglement bedeelegt sinn. Benotzt Verloscht-vun-Funktioun Experimenter, hien mir dass p42.3 bewosst Prolifératioun stimuléieren kann a wéi gemellt, eis Resultater weisen, datt p42.3 am GC Stoffer overexpressed war wéi mat der bascht Net-Kriibs mucosa verglach [3]. Allerdéngs ass de molekulare Mechanismen geplatzt an dëser aberrant Ausdrock vun p42.3 Gentherapie am GC ganz wéineg verstan, wéi aus dem Manktem u sinn Literatur. MiRNAs kann Gentherapie Ausdrock regléieren vun der bindend Siten an der Zil- mRNAs [27] an, an mënschlechen Cancers gezielt, hu vill miRNAs schonn agebonne ginn. Allerdéngs huet d'Funktioun vun nëmmen e puer ze Datum verstane ginn, virun allem am GC [28]. VerfÜgung An dësem Rapport, mir ausgewielt Mir-29a fir weider Enquête vun engem Rapporteur Gentherapie System an schlussendlech déi p42 identifizéiert. 3 war eng direkt uschwätzt Gentherapie vum Mir-29a. Eis Date proposéiert, datt déi véier Datenbanken (TargetScan, microRNA.org, Aart Ziler Version 5 an miRGen) benotzt huet efficace, mee net perfekt, Handwierksgeschir fir d'Cepheid vun miRNA Ziler a gëtt experimentéierte Beweis fir Verbesserungen un der Basisdaten sind. VerfÜgung Mir weisen datt p42.3 Ausdrock inversely mat Mir-29a Ausdrock zu véier GC Zell Zeilen ze dinn huet. An dräi vun dësen, MKN-45, MGC-803 an AGS, dat war evident souwuel d'mRNA an FAQ Niveau, mä dat war net de Fall an der SGC-7901 Zell Linn. Ausserdeem gouf Mir-29a Ausdrock am MKN-28 an SNU-1 Zell Linnen net héich. Geholl zesummen, erlaabt dësen Observatioune eis dass de reglementaresche Roll vum Mir-29a zu hypothesize ass am GC Zell Linnen komplizéiert an dat Mir-29a vläicht verschidde Rollen a verschiddene bewosst Hannergrënn Leeschtung. Allerdéngs, Chinesen den detailléierte Mechanisme vum Mir-29a Funktiounen am GC Zell Zeilen weider Enquête. VerfÜgung An eiser Etude, Mir-29a overexpression ähnlechen Effekter zu deene vun der silencing vun p42.3 vun p42.3 erreecht induce kéint siRNA. Souwuel vun p42.3 mRNA an FAQ sech downregulated der Zellen mat p42.3 siRNA transfected waren oder Mir-29a mimics an der Zell Prolifératioun an Zell Zyklus opgeléist huet, wann Zellen der selwechter Amëschen mécht. Et gëtt ugeholl, datt Mir-29a kann an der pathogenesis vun GC via d'Repressioun vun p42.3 Gentherapie Ausdrock Équipe ginn. Allerdéngs fonnt mir aus dem Wuesstem Kéiren, datt d'Ausmooss vun der Repressioun vum Mir-29a mimics war méi grouss wéi déi vun p42.3 siRNA. An eiser Meenung no, kann den Haaptgrond fir dës gin dass bestëmmten miRNAs honnerte vu Genen regléieren hätt bewosst Funktioun ze kontrolléieren. Am Moment studéieren, vläicht Mir-29a Zell Prolifératioun inhibit, op d'mannst zu engem Deel, vun p42.3 gezielt. VerfÜgung Eis Donnéeë gewisen, datt wann den Taux vun héich Ausdrock vu Mir-29a war 55% (33 /60) an GC, p42.3 Ausdrock war an 21 vun deene Fäll niddereg. Dëst ugeholl, datt Mir-29a eng wichteg Roll am GC Stoffer mat niddereg Ausdrock Niveau vun p42.3 hun kann. VerfÜgung Am Moment studéieren, mir validéiert datt p42.3 ass en direkte Zil vum Mir-29a. Mir hunn och bewisen, dass Mir-29a Zell Prolifératioun inhibit kann an Spär der Zell Zyklus, op d'mannst zu engem Deel, iwwer d'Repressioun vun p42.3 Ausdrock am GC. Mir schléissen dass Mir-29a enger kritescher Roll spille kann den Ausdrock vun p42.3 am GC zu Regulatioun. Spannen fonnt mir dass p42.3 Gentherapie och den Ausdrock vun Mir-29a regléieren hätt (d'Donnéeë si net hei gewisen), mä d'Basisdaten reglementaresche Mechanismus wäert an Zukunft lant ginn. VerfÜgung Bioinformatik VerfÜgung Véier efficace computational Approche dass verschidden Evaluéieren Systemer Räich [29] - [32] fir d'Cepheid vun der reglementaresche miRNAs benotzt goufen, datt d'p42.3 Gentherapie Zil, dorënner TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), Ziler Aart Version 5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv /Aart /htdocs /Ziler /v5 /) an miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Ziler sech fir weider Bekräftegung vun der Grupp vun miRNAs ausgewielt, déi zu de Resultater gemeinsam huet entsteet aus méi wéi ee Sich. VerfÜgung Ray Echantillon VerfÜgung siechzeg Puer histopathologically bestätegt GC an bascht Net-Kriibs Otemschwieregkeeten Echantillon sech vu Patiente kritt deen chirurgesch resection um Renji Hospital gehéiert zu de Shanghai Jiaotong University School of Medezin, China tëscht Juli 2007 a Januar 2009. déi reagéiert net-Kriibs bascht Stoffer kritt huet op d'mannst 5 cm ewech vun der entholl Site mécht. D'Etude gouf vun der Fuerschung IFLA- Comité vun Shanghai Jiaotong University guttgeheescht an Awëllegung war vun all Patienten kritt, während schrëftlech Erlaabnes vun all Patient kritt huet. VerfÜgung Zell Linnen a Kultur Konditiounen VerfÜgung Mënscherechter GC Zell Linnen, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 an AGS, an de GES-1 normal Linn gastric epithelium Zell, déi aus ATCC (USA) kaaft huet, sech an RPMI 1640 haten mëttel- (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) ergänzt mat 10% an et Bovine serum (Invitrogen, Karlsbad CA, USA). Zellen sech op 37 ° C an engem 5% CO cultured 2 incubator. Eng Léisung vun trypsin (0,25%) war fréier d'Zellen aus der Kultur flask zu Lassmaachen. VerfÜgung Vecteure Konstruktioun VerfÜgung den Ausdrock vectors pri-Mir-29a éischt mat primers Implikatioune war ze bauen Designerin Primer Premier 5.0 Software (Table 3) an dann gekloonten an pcDNA3.1 (Invitrogen). Fir d'plasmids produzéiere datt d'putative bindend Site vum Mir-29a Texter, souwuel Wildwest-Typ an Mann- Message aus Positiounen 111 bis 380 vun der p42.3-3'UTR sech chemesch Wierderbuch (Dorënner 1A) an waren duerno fir den afgerappt gekloonten vun der EGFP Gentherapie op Bam VerfÜgung Salut an Eco VerfÜgung RI Siten an der pcDNA3 /EGFP Vecteure (Saierbio, Tianjin, China). VerfÜgung Reporter Gentherapie assay VerfÜgung MKN-45 Zellen sech am triplicate Wells vun engem 24-gutt Plack op den Dag virun transfection rakommen. PcDNA3.1 (+) /primäre-Mir-29a sech Co-transfected mat Wëld-Typ an Mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR bzw.. Dunn, 0,5 μg vun pcDNA3.1 (+) /primäre-Mir-29a an 0,5 μg vun pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR waren an all de Wells notéiert, iwwerdeems 0,1 μg vun Vecteure pDsRed-C1 (Clontech ), déi de RFP ausgedréckt, sech als eng endogenous Referenz un all gutt dobäi. Zellen, datt nëmmen transfected sech mat pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR oder pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+) goufen als déi Kontrollen benotzt. Zellen sech 48 h der transfection gesammelt an analyséiert op d'Intensitéit vun EGFP an RFP fluorescence baséiert erwëscht andeems Fluorescence Spectrophotometer F-4500 (Hitachi, Japan). VerfÜgung Zell transfection VerfÜgung Transfection vun MKN-45 Zellen war mat der Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) folgenden de Protokoll vun den Hiersteller gesuergt. MKN-45 Zellen sech rakommen an 6-gutt Placken oder 96-gutt Placke bei 30% Niewebaach den Dag virun der transfection. Mimics (100 nm, GenePharma) an inhibitors (200 nm, RIBOBIO) vum Mir-29a benotzt goufen zu exogenously Bastelen a downregulate den Ausdrock vun Mir-29a. Fir p42.3 Gentherapie Ausdrock, déi MKN-45 Zellen sech transfected mat siRNA géint p42.3 (si-p42.3, 100 nm, GenePharma) Hammers. D'Kontroll RNS (genannt den NC) war Net-homologous fir all Mënsch Nepgen Haaptrei. De Message vun der oligo nucleotides sinn an Table gewisen 4. VerfÜgung Real-Zäit RT-Hinnen alleguer VerfÜgung Total RNS isoléiert war mat Trizol reagent (Invitrogen) an dono mat RNase-gratis DNase behandelt ech ( Fermentas, San Diego, CA, USA). Total RNS (500 NG) war ëmgedréint ausserdeem d'PrimeScript RT reagent Kit benotzt (TaKaRa, Dalian, Japan). D'primer Message benotzt p42.3 an GAPDH zu Meenungsfreiheet nennt sinn an Table 3. dës Fir den Ausdrock vun der eeler Mir-29a analyséieren war, 2 μg vun der total RNS ënnerworf Transkriptiouns zu ëmgedréint der All-zu-One MiRNA Q-Hinnen alleguer mat Detectioun Kit (GeneCopoeia, lousoihong, China). Chemeschen real-Zäit Hinnen alleguer fir eeler Mir-29a an U6 war no der Taktik vum Fabrikant standing d'Abi 7300 real-Zäit Hinnen alleguer System a speziell primers Designerin GeneCopoeia, China benotzt. Der relativer Ausdrock vun p42.3 an Mir-29a war fir eng endogenous Referenz (GAPDH an U6 klengen Nuklearsécherheet RNS bzw.) normalized a relativ zu der Kontroll. D'Resultater goufen als fantastesch änneren virgestallt, berechent d'2 (-ΔΔCT) Method benotzt [33]; enger relativer Ausdrock Verhältnis vu &Si besteet; 1.0 war den niddereg considéréiert, während engem Verhältnis vu > 1.0 wéi héich Ausdrock considéréiert gouf [14] VerfÜgung Western blotting VerfÜgung Total FAQ aus cultured Zellen an Stoffer. sech duerch Ripa Lysis Respektiv wouvun PMSF ofgebaut, laut der Uweisunge d'Hiersteller (Beyotime, Shanghai, China). Protein Konzentratioun war mat der Bradford Method gemooss [34]. Insgesamt 40 μg vun FAQ sech duerch 10% SDS polyacrylamide gels electrophoresed a sech dann zu engem PVDF Membran (Millipore) transferéiert. D'Membran war mat p42.3 antibody incubated (1:500, Abmart, China), CHK2 antibody (1:1,000, CST), cyclinB1 antibody (1:1,000, CST) oder GAPDH (1:5,000, Kang Chen, China) bei 4 ° C Iwwernuechtung. Secondaire antibodies sech mat HRP (Kang Chen, China) gekennzeechent an der Signaler benotzt ECL Kit fonnt (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Duerno goufen d'Biller vun ImageJ 1,43 Software analyséiert. D'FAQ Ausdrock war fir eng endogenous Referenz (GAPDH) a relativ zu der Kontroll normalized. Eng famill Ausdrock Verhältnis vu &Si besteet; 1.0 war den niddereg Ausdrock geduecht, während engem Verhältnis vu > 1.0 wéi héich Ausdrock considéréiert gouf [14] VerfÜgung Zell Prolifératioun assay VerfÜgung recoltéiert MKN-45 Zellen. (ongeféier 5 x 10 Zell Zyklus assay VerfÜgung Forty- -eight Stonnen no transfection, goufen d'Zellen mat 0,25% trypsin an gewäsch an DPBS (Gibco) geflunn; se sech dann zu 70% Ethanol fir 24 h bei -20 ° C fix. Fir Flux cytometric Analyse (Epe XL Beckman Coulter), Zellen sech fir 30 min an RNAse (Fermentas) bei 37 ° C incubated, mat PI (Fläch) behandelt an zu 300 μl DPBS gespaart. VerfÜgung statistique Analyse Data sech als mengen ± Fils vun op d'mannst dräi separat Experimenter gewisen. D'Bedeitung war mam T-Test d'Student analyséiert an Net-parametric Tester (Mann-Whitney U Test an Kruskal-Wallis H test). Statistesch Bedeitung vun Korrelatioun tëscht dem Wëllen vum Mir-29a an p42.3 FAQ war vun der Chi-Feld Test an Spearman d'Geleeënheet Korrelatioun berechent. Statistesch Analyse huet mat standing SPSS 13,0 Software (IBM, USA) an Ënnerscheeder waren statistesch relevant Betruecht P VerfÜgung &Si besteet; 0,05. VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
Diskussioun VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
Grouss Studie fënnt datt d'SARS-CoV-2 viral Last déi niddregst bei Kanner ass
Antibiotesch Resistenz verduebelt an nëmmen zwee Joerzéngten
Ongesond Darmmikrobiom reduzéiert de synaptesche Gehir vum Gehir,
Fuerschung weist datt Probiotika hëllefe kënnen Angscht an Depressioun ze bekämpfen
Gutt Nouvelle fir IBS Leider wéi d'Fuerscher "Darm Jucken" identifizéieren
Nei computational Modellermethod virausgesäit wéi Darmmikroben sech mat der Zäit veränneren
Ländlech an urban Mikrobiota ënnerscheede sech vun engem jonken Alter,
fënnt nei Studie Eng nei Studie huet gewisen datt Differenzen am mënschlechen Darmmikrobiom tëscht Leit, déi am ländleche versus städtesche Beräicher vun Nigeria liewen, a ganz jonken Alter ufänken.
Probiotika kënnen therapeutesch Virdeeler fir biopolare Patienten ubidden
Eng Studie vum Baltimores Sheppard Pratt Gesondheetssystem huet gewisen datt Probiotika als potenziell therapeutesch Approche fir bipolare Stéierungen an aner psychiatresch Bedéngungen déngen.
Mëttelmier Diät fördert e gesonde Alterung mat engem méi gesonde Darmmikrobiom
Eng nei Studie online am Journal publizéiert Gutt am Februar 2020 bericht déi markant gesondheetlech fördert Effekter vum Wiessel op eng mediterran Diät fir nëmmen ee Joer. DResultater ware wéinst e