PLoS ONE: MiR-29a Remt Cell proliferatie en wekt de celcyclus door de negatieve regulatie van p42.3 in Human Gastric Cancer

Abstract

Als een nieuw geïdentificeerd en gekarakteriseerd gen, p42.3 wordt geassocieerd met cel proliferatie en tumorgeniciteit. De expressie van p42.3 opgereguleerd in menselijke maagkanker (GC), maar de onderliggende werkingsmechanismen zijn niet goed begrepen. MicroRNA (miRNAs) zijn bekend om essentiële regulerende rol spelen in tal van cellulaire processen. Hier benut we bio-informatica en experimentele benaderingen om de regelgeving relatie tussen miRNAs en de p42.3 gen te onderzoeken. We toonden aan dat miR-29a p42.3 uitdrukking aan zowel de mRNA en eiwit niveaus kon onderdrukken via direct binding aan de 3'UTR. Verder werd een omgekeerd verband waargenomen tussen miR-29a en p42.3 expressie bij maagkanker cellijnen en samples GC weefsel, vooral in gevallen waarin p42.3 werd neerwaarts gereguleerd. Bij elkaar genomen, hebben we niet eerder opgenomen rol van miR-29a toegelicht en aangegeven dat miR-29a kan functioneren, althans gedeeltelijk, door zich te richten de p42.3 gen in het menselijk GC

Visum:. Cui Y, Su WY , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) MiR-29a Remt Cell proliferatie en wekt de celcyclus door de negatieve regulatie van p42.3 in Human maagkanker. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10.1371 /journal.pone.0025872

Editor: Alfons Navarro, Universiteit van Barcelona, ​​Spanje

Ontvangen: 28 februari 2011; Geaccepteerd: 13 september 2011; Gepubliceerd: 5 oktober 2011

Copyright: © 2011 Cui et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Nationale Basic Research Program van China 973-programma (2010CB5293, het National High Technology Research en Development Program van China (863 Program) (2006AA02A402, de National Natural Science Foundation van Key Program (nr 30830055) en het Ministerie . van volksgezondheid, China (No. 200.802.094) naar FJY de financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Introductie

p42.3 is een nieuw gen dat onlangs is geïsoleerd en geïdentificeerd door het mRNA differential display (mRNADD) techniek. de volledige lengte cDNA van p42 0,3 ongeveer 4,0 kb, en het gen codeert voor een 389 aminozuur (aa) proteïne, dat wordt geschat op een molecuulmassa van 42,3 kDa. Verder onderzoek heeft aangetoond dat de expressie celcyclus-afhankelijke bij maagkanker (GC) cellijnen. De eiwitexpressie pieken in de M fase van de celcyclus, daarna geleidelijk terugloopt na celdeling; Dit geeft aan dat p42.3 betrokken kan zijn bij de celcyclus. Bovendien silencing van p42.3 door kleine interfererende RNA (siRNA) leidt tot een opregulatie van CHK2 en downregulatie van cycline B1, waarbij twee belangrijke eiwitten betrokken bij regulering van de celcyclus zijn [1], [2]. Terwijl RT-PCR en immunohistochemische analyses blijkt dat p42.3 opgereguleerd in GC vergelijking met de normale weefselmonsters, is functioneel onderzoek suggereerde dat de uitputting van p42.3 kan niet alleen bij het remmen van proliferatie GC cel- en kolonievorming in vitro
, maar kan ook een aanzienlijke vermindering van tumorvorming in naakt muizen [3]. Hoewel eerdere studies een cruciale rol voor de p42.3-gen in de pathologie van GC hebben gesuggereerd, de specifieke onderliggende mechanismen van haar optreden nog moeten worden opgehelderd.

MicroRNAs (miRNAs) bestaan ​​uit een klasse van kleine (~ 22 nucleotiden), endogene, niet-coderende RNA's waarvan bekend is dat belangrijke regulerende rol in genexpressie [4]. De primaire miRNA transcript wordt pri-miRNA [5], die wordt getranscribeerd door RNA polymerase II of III [6], [7]. De PRI-miRNA wordt dan gesplitst door de Drosha-DGCR8 microprocessor complex aan de voorloper hairpin molecule (pre-miRNA), die vervolgens van de kern naar het cytoplasma door export van-5 /Ran-GTP wordt geëxporteerd. Met de hulp van een complex dat de RNase Dicer en de dubbelstrengs RNA-bindende eiwitten, TRBP bevat, wordt de -70-nucleotide pre-miRNA verwerkt tot volwassen miRNA [8]. De functionele onderdeel van de rijpe miRNA wordt geladen in de RNA-geïnduceerd silencing complex (RISC), die eiwitten bevat, Argonaute (Ago) en Tnrc6, terwijl de andere streng gewoonlijk afgebroken [9]. De rijpe miRNA stuurt de RISC de onvolmaakte complementaire sequenties in doelwit mRNA aan het cognate mRNA translatie onderdrukken bevorderen transcript bederf of beide [10]. Geschat wordt dat de meeste coderende genen waarschijnlijk gereguleerd door miRNAs en terwijl een miRNA meerdere doelgenen kan reguleren, kan bepaalde genen worden gereguleerd door meerdere miRNAs [11].

Groeiend bewijs suggereert dat miRNAs betrokken in een groot aantal fysiologische en pathologische processen, zoals ontwikkeling, differentiatie, proliferatie en apoptose [12.13,14,15]. Hoewel afwijkingen miRNA expressie hebben in vele menselijke tumoren, zoals colorectale, maag- en borstkanker [16], [17] is vastgesteld, wordt het aantal van dergelijke tumoren nog uitgebreid. De gedetailleerde functies van miRNA in tumoren nog worden opgehelderd.

Recente studies hebben gesuggereerd dat miR-29 heeft complexe functies bij verschillende ziekten. MiR-29a kan gedragen als een tumor suppressor zowel long- en pancreaskanker cellijnen, en dus de exogene overexpressie van miR-29a resulteert in een significante vermindering van de invasieve potentieel en de proliferatie van deze cellijnen [18]. De tumor suppressor rol van miR-29a wordt ook ondersteund door de waargenomen downregulatie in een breed spectrum van solide tumoren, zoals neuroblastoma, sarcomen en hersentumoren [19]. Daarentegen wordt miR-29a opgereguleerd in indolente humane chronische lymfatische leukemie (B-CLL) [20] en acute myeloïde leukemie (AML) [21], die een eventuele tumorpromotor rol suggereert. Bovendien kan de afwijkende expressie van miR-29a te vinden in vele niet-maligne aandoeningen, zoals leverfibrose [22], diabetes [23] en de ziekte van Alzheimer [24]. Hoewel veel genen zijn reeds bekend om de directe doelwitten van miR-29a, zoals PPM1D [25], PI3K [26] en neuron navigator 3 zijn [24], zij een zeer kleine fractie van de totale genen die miR-29a targets.

In het voorliggende rapport, tonen we aan dat p42.3 expressie werd gecontroleerd op het niveau van zowel mRNA en eiwit door miR-29a via directe targeting van de 3'UTR van p42.3. MiR-29a kon celproliferatie onderdrukt en induceren celcyclus, ten minste gedeeltelijk, via de neerwaartse regulatie van expressie p42.3. Bovendien vonden we dat de expressie van p42.3 eiwit omgekeerd werd gecorreleerd met miR-29a expressie in menselijke weefsels GC.

Resultaten

p42.3-3'UTR is vermoedelijk het doelwit van miR -29a

Vermeende miRNAs die werden voorspeld aan de p42.3 gen met meer dan één database doelwit werden geanalyseerd. De bovenste twee miRNAs die werden voorspeld driemaal werden geselecteerd voor verdere bevestiging en de andere drie miRNAs, zoals miR-29a, waarvan de vermoedelijke bindingsplaatsen waren dicht bij die van de bovenste twee werden gekozen als kandidaten voor validatie. MiR-29a werd voorspeld door de TargetScan en miRGEN databases, waaruit bleek dat de vermeende bindingsplaats was op posities 213-219 van de p42.3-3'UTR (Figuur 1A). De andere kandidaten zijn die hier niet vermeld.

Direct gericht op de p42.3-3'UTR door miR-29a

De reporter-gen-test werd gebruikt om te valideren of p42.3 was een direct doelwit van miR-29a. Wild-type en mutant p42.3-3'UTR met de vermoedelijke bindingsplaats van miR-29a werden gekloneerd in afzonderlijke plasmiden en gefuseerd met het reportergen. De fluorescentie-intensiteit van het reportergen was significant verminderd in de groep die was gecotransfecteerd met WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 en pcDNA3.1 /miR-29a vergelijking met de controle. Bovendien was er geen significante daling van de fluorescentie-intensiteit in de groep die was gecotransfecteerd met MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (Figuur 1B) bevestigen voorts dat miR-29a induceerde de downregulatie van p42.3 genexpressie via de specifieke binding van de vermoedelijke plaats van de p42.3-3'UTR.

de expressie van miR-29a en p42.3 zijn omgekeerd evenredig in GC cellijnen

Om de link tussen p42 vergewissen 0,3 en miR-29a, bestudeerden we de endogene expressie van miR-29a en p42.3 in zes menselijke GC cellijnen (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 en AGS) en een normale maag epitheel cellijn (GES-1; Figuur 2A-C). We vonden dat het niveau van p42.3 mRNA was significant hoger dan de normale controle in alle GC cellijnen behalve SGC-7901, waarbij het verschil was niet statistisch significant. Het expressieniveau van p42.3 varieerde op het eiwitniveau, maar was significant hoger in alle van de GC cellijnen vergelijking met GES-1.We bleek ook dat miR-29a expressie laag was in vier van de GC cellijnen ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 en AGS), die een omgekeerd verband met p42.3 expressie geopenbaard. Hoewel de expressie van miR-29a was hoog in SNU-1, dit was niet statistisch significant. Het is het vermelden waard dat de hoge expressie van miR-29a in MKN-28 was een uitzondering.

MiR-29a regelt p42.3 uitdrukking

Om te beoordelen of p42.3 werd onderdrukt door miR -29a, we behandeld MKN-45 cellen met het bootst en remmers van miR-29a gedurende 48 uur om exogeen op- en neerwaarts reguleren van de expressie van miR-29a in het bijzonder; de uitdrukking van p42.3 werd vervolgens bepaald. Na transfectie van MKN-45 cellen met het bootst de miR-29a expressie met ongeveer 10-voudig, terwijl de behandeling met remmers verlaagde de miR-29a niveau meer dan 50% (Figuur 3A-B). Dit suggereerde dat zowel nabootst en remmers van miR-29a efficiënt werkte in onze experimenten. Overexpressie van miR-29a aanzienlijk kunnen onderdrukken van de expressie van p42.3 zowel op mRNA en eiwit niveaus, die een soortgelijk effect op de silencing van p42.3 door p42.3 siRNA (si-p42.3) was. We hebben ook ontdekt dat CHK2 werd opgereguleerd en cyclinB1 werd downgereguleerd na de silencing van p42.3 door p42.3 siRNA. Interessant is dat vergelijkbare effecten op CHK2 en cyclinB1 uitgeoefend door de overexpressie van miR-29a in MKN-45 cellen (Figuur 3C-D). Daarnaast transfectie van miR-29a remmers drastisch afgenomen CHK2 expressie en verhoogde p42.3 en cyclinB1 expressie (Figuur 3E-F). Dit suggereerde dat miR-29a de expressie van het gen in p42.3 MKN-45 cellen kunnen reguleren.

MiR-29a remt celproliferatie in vitro

Volgens de gegevens van de celproliferatie assay, we trokken het absorptievermogen bochten bij de golflengte van 450 nm na transfectie voor verschillende looptijden. We vonden dat celproliferatie significant geremd na de transfectie van MKN-45 cellen met p42.3 siRNA voor 48 uur en 72 uur, en een vergelijkbaar patroon werd waargenomen na cellen werden getransfecteerd met nabootsers van miR-29a. De mate van onderdrukking bereikt door miR-29a bootst groter dan p42.3-siRNA veroorzaakte neerwaartse regulatie (Figuur 4A). Integendeel, werd celgroei gestimuleerd met ongeveer 10%, vergeleken met de negatieve controle wanneer getransfecteerd met remmers van miR-29a voor 48 uur, maar er was een daling bij 72 uur (Figuur 4B). Dit gaf aan dat miR-29a celproliferatie kan remmen via het onderdrukken van de expressie van p42.3.

MiR-29a blokken celcyclus

Silencing van p42.3 door p42.3 siRNA kan leiden in de celcyclus; Daarom hebben we onderzocht of miR-29a kan invloed hebben op de voortgang van de celcyclus via richten op de p42.3 gen. Na MKN-45 cellen werden getransfecteerd met siRNA p42.3 voor 48 uur, vonden we dat de celcyclus geblokkeerd op de G1 fase (75,93%, P
< 0,05), vergeleken met de negatieve controle ( 66,18%). We vonden dat nabootst van miR-29a ook G1-fase arrestatie in MKN-45 cellen kunnen veroorzaken wanneer ze behandeld worden gedurende 48 uur (75,56%, P Restaurant < 0,05; figuur 5).

Expression van miR-29a en p42.3 eiwit in GC en hun correlatie met klinisch-pathologische kenmerken

met behulp van een kwantitatieve real-time PCR-techniek, werd miR-29a gedetecteerd in 60 paren van GC weefsels en hun geëvenaard non-kanker aangrenzende weefsels, terwijl p42.3 eiwitniveau ook geëvalueerd in deze weefsels door Western blotting. Van de 60 GC weefsels monsters, hoog was in 35 gevallen (35/60, 58.33%) ten opzichte van hun geëvenaard non-kanker aangrenzende weefsels p42.3 expressie. In de 25 gevallen waarin p42.3 expressie werd gedownreguleerd, hoog was in 21 gevallen miR-29a expressie. MiR-29a expressie laag was in 27 gevallen (27/60, 45%). Bovenstaande gegevens suggereren een omgekeerde relatie tussen miR-29a en p42.3 eiwit expressie in weefselmonsters ( P
= 0,000, tabel 1 en figuur 6), maar de correlatiecoëfficiënt was niet goed (r = -0,316 ).

Bovendien, miR-29a en p42.3 eiwitexpressie werden geëvalueerd met betrekking tot de klinische en pathologische kenmerken van de 60 patiënten bij wie weefselmonsters werden genomen. Onze bevindingen gesuggereerd dat er geen duidelijke correlaties tussen p42.3 eiwit en miR-29a expressie, respectievelijk met clinicopathologische kenmerken (tabel 2).

Discussie

De p42.3 gen is zeer geconserveerd in zoogdieren en, als een oncogen, kan een belangrijke rol spelen bij de geleidelijke transformatie van normale gastrische epitheel cellen kankercellen. De differentiële expressie tijdens de celcyclus fasen blijkt dat p42.3 kunnen worden betrokken bij de regulatie van de celcyclus. Dit werd ook bevestigd door onze resultaten, waaruit bleek dat p42.3 silencing de expressie van twee belangrijke eiwitten, CHK2 en cycline B1, die betrokken zijn bij regulering van de celcyclus kunnen veranderen. Gebruik loss-of-function experimenten hebben we aangetoond dat p42.3 cellulaire proliferatie kan stimuleren en gerapporteerd, onze resultaten bleek dat p42.3 GC weefsels werd overexpressie in vergelijking met het aangrenzende niet-kanker mucosa [3]. Echter, de moleculaire mechanismen waardoor deze afwijkende expressie van p42.3 gen GC slecht begrepen, zoals blijkt uit een gebrek aan beschikbare literatuur. MiRNAs kan genexpressie reguleren door te richten op de bindingsplaatsen in de doelwit mRNA [27] en in menselijke kankers, veel miRNAs reeds betrokken. Echter, de functie van enkele begrepen tot nu toe vooral in GC [28].

In dit rapport, selecteerden we miR-29a verder onderzoek door een reportergen systeem en uiteindelijk vastgesteld p42. 3 was een direct doelwit-gen van miR-29a. Onze gegevens suggereren dat de vier databases (TargetScan, microRNA.org, MICROKOSMOS doelen Versie 5 en miRGen) gebruikt was efficiënt, maar niet perfect, hulpmiddelen voor de voorspelling van miRNA targets en experimenteel bewijs geleverd voor verbetering van de onderliggende algoritme.

We toonden aan dat p42.3 expressie omgekeerd gerelateerd was met miR-29a expressie in vier GC cellijnen. In drie van deze, MKN-45, MGC-803 en AGS, dit bleek zowel het mRNA als eiwitniveau, maar dit was niet het geval in het SGC-7901 cellijn. Bovendien, miR-29a expressie was niet laag in de MKN-28 en SNU-1 cellijnen. Tezamen bieden deze waarnemingen konden we veronderstellen dat de regulerende rol van miR-29a is ingewikkeld in GC cellijnen en dat miR-29a kan verschillende rollen spelen in verschillende cellulaire achtergronden. Echter, de gedetailleerde mechanismen van miR-29a functies in GC cellijnen vereisen nader onderzoek.

In onze studie, miR-29a overexpressie kunnen vergelijkbare effecten met die bereikt door de silencing van p42.3 door p42.3 induceren siRNA. Beide p42.3 mRNA en eiwit werden na gedownreguleerd cellen werden getransfecteerd met siRNA p42.3 of miR-29a bootst de celproliferatie en celcyclus onderdrukt wanneer cellen dezelfde interferentie ondergaan. Gesuggereerd dat miR-29a betrokken kunnen zijn bij de pathogenese van GC via de onderdrukking van p42.3 genexpressie. Wij vonden echter uit de groeicurven dat de mate van onderdrukking van miR-29a bootst was groter dan in p42.3 siRNA. Naar onze mening kan de belangrijkste reden hiervoor zijn dat specifieke miRNAs honderden genen kan regelen om cellulaire functie regelen. In deze studie, kan miR-29a celproliferatie te remmen, ten minste gedeeltelijk, door zich te richten p42.3.

Onze gegevens toonden aan dat hoewel de snelheid van de hoge expressie van miR-29a was 55% (33 /60) in GC, p42.3 expressie was laag 21 procedure. Dit suggereerde dat miR-29a een vitale rol in GC weefsels met een lage expressie van p42.3 kan hebben.

In de huidige studie, we gevalideerd dat p42.3 is een direct doelwit van miR-29a. We hebben ook aangetoond dat miR-29a celproliferatie kunnen remmen en blokkeren de celcyclus, ten minste gedeeltelijk, via de onderdrukking van p42.3 expressie in GC. We concluderen dat miR-29a een cruciale rol kunnen spelen in het reguleren van de expressie van p42.3 in GC. Interessant genoeg vonden we dat p42.3 gen kan ook de expressie van miR-29a (de gegevens zijn hier niet weergegeven) te regelen, maar de onderliggende regelgeving mechanisme zal worden onderzocht in de toekomst.

Materialen en methoden

Bioinformatics

Vier efficiënte computationele benaderingen die verschillende systemen gebruiken evaluatie [29] - [32] werden gebruikt voor het voorspellen van de regulerende miRNAs de p42.3 gen, waaronder TargetScan (http targeten: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), microkosmos Doelen versie 5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv /microkosmos /htdocs /doelen /v5 /) en miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Targets werden geselecteerd voor verdere bevestiging van de groep van miRNAs die de resultaten die door verscheidene zoekopdrachten voorkwamen.

weefselmonsters

Zestig paren histopathologisch bevestigd GC en naburige niet-kankerweefsel monsters werden verkregen van patiënten die een chirurgische resectie ondergingen in het Renji Ziekenhuis verbonden aan de Shanghai Jiaotong University School of Medicine, China tussen juli 2007 en januari 2009. de aangepaste niet-kanker aangrenzende weefsels werden ten minste 5 cm afstand van de tumor verkregen. Het onderzoek werd goedgekeurd door de Research Ethics Committee van Shanghai Jiaotong University en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten, terwijl de schriftelijke toestemming werd verkregen van elke patiënt.

Cellijnen en kweekomstandigheden

Human GC cellijnen, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 en AGS, en de GES-1 normale maag epitheel cellijn, die werden gekocht van ATCC (USA), werden in RPMI 1640 gehandhaafd medium (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cellen werden gekweekt bij 37 ° C in een 5% CO _{2 incubator. Een oplossing van trypsine (0,25%) werd gebruikt om de cellen los te maken van de kweekfles.}

Vectorconstructie

Voor het construeren van expressievectoren miR-29a werd eerst geamplificeerd met primers gemaakt door primer Premier 5.0 software (Tabel 3) en vervolgens gekloneerd in pcDNA3.1 (Invitrogen). De plasmiden die de vermoedelijke bindingsplaats van miR-29a bevat zowel wildtype en mutante sequenties van positie 111-380 van de p42.3-3'UTR werden chemisch gesynthetiseerd (Figuur 1A) en vervolgens werden gekloneerd op de stroomafwaartse produceren van het EGFP-gen op Bam
HI en Eco
RI plaatsen in het pcDNA3 /EGFP vector (Saierbio, Tianjin, China).

Reporter gen assay

MKN-45 cellen werden in triplo putjes van een plaat met 24 putjes op de dag vóór transfectie. PcDNA3.1 (+) /primaire miR-29a waren gecotransfecteerd met wildtype en mut-pcDNA3 respectievelijk /EGFP /p42.3-3'UTR. Vervolgens 0,5 ug pcDNA3.1 (+) /primaire miR-29a en 0,5 ug pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR werden toegevoegd aan elk van de putjes, en 0,1 ug vector pDsRed-C1 (Clontech ), waarbij de RFP expressie, werden toegevoegd aan elke well wordt een endogene referentie. Cellen die alleen waren getransfecteerd met pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR of pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+) werden gebruikt als controles. Cellen werden 48 uur na transfectie verzameld en geanalyseerd op basis van de intensiteit van EGFP en RFP fluorescentie gedetecteerd met fluorescentie Spectrophotometer F-4500 (Hitachi, Japan).

Celtransfectie

Transfectie van MKN-45 cellen werd uitgevoerd met de Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant. MKN-45 cellen werden gezaaid in platen met 6 putjes of 96 putjes bij 30% confluentie de dag voor de transfectie. Bootst (100 nM, GenePharma) en remmers (200 nm, RIBOBIO) van miR-29a werden gebruikt om exogeen op- en neerwaarts reguleren van de expressie van miR-29a. Om p42.3 genexpressie stilleggen, werden de MKN-45-cellen die met siRNA tegen p42.3 (si-p42.3, 100 nM, GenePharma). Controle RNA (genoemd als NC) werd de niet-homoloog aan een menselijke genoomsequentie. De sequenties van de oligonucleotiden zijn weergegeven in Tabel 4.

Real-time RT-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen) en vervolgens behandeld met RNase-vrij DNase I ( Fermentas, San Diego, CA, USA). Totaal RNA (500 ng) werd reverse getranscribeerd met behulp van de PrimeScript RT reagens Kit (TaKaRa, Dalian, Japan). De primersequenties gebruikt p42.3 en GAPDH amplificeren zijn weergegeven in Tabel 3. Om de expressie van het rijpe miR-29a, 2 pg van de totale RNA te analyseren werd onderworpen aan omgekeerde transcriptie met de all-in-one miRNA Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia, Guangzhou, China). Kwantitatieve real-time PCR voor oudere miR-29a en U6 werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant met behulp van de ABI 7300 real-time PCR systeem en specifieke primers gemaakt door GeneCopoeia, China. De relatieve expressie van p42.3 en miR-29a werd genormaliseerd op een endogene referentie (GAPDH en U6 kleine nucleaire RNA respectievelijk) en opzichte van de controle. De resultaten werden gepresenteerd als voudige verandering, berekend met de 2 (-ΔΔCT) methode [33]; een relatieve expressie verhouding < 1,0 werd als laag beschouwd, terwijl een verhouding > 1,0 werd beschouwd als hoge expressie [14]

Western blotting

Totaal eiwit uit gekweekte cellen en weefsels. werden geëxtraheerd met RIPA lysisbuffer die PMSF, volgens de instructies van de fabrikant (Beyotime, Shanghai, China). De eiwitconcentratie werd gemeten met de Bradford-werkwijze [34]. Overall, 40 ug eiwit werden geëlektroforeerd over 10% SDS-polyacrylamidegelen en werden vervolgens overgebracht naar een PVDF-membraan (Millipore). Het membraan werd geïncubeerd met p42.3 antilichaam (1:500, Abmart, China), CHK2 antilichaam (1:1,000, CST), cyclinB1 antilichaam (1:1,000, CST) of GAPDH (1:5,000, Kang Chen, China) bij 4 ° C overnacht. Secundaire antilichamen werden gelabeld met HRP (Kang Chen, China) en de signalen werden gedetecteerd met ECL-kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Vervolgens werden de beelden geanalyseerd met ImageJ 1.43 software. De eiwitexpressie werd genormaliseerd op een endogene referentie (GAPDH) en opzichte van de controle. Een relatieve expressie verhouding van < 1,0 werd beschouwd als lage expressie, terwijl een verhouding van > 1.0 werd beschouwd als hoge expressie [14]

Cell proliferatie assay

Geoogste MKN-45 cellen. (ongeveer 5 x 10 ^{4 cellen) werden gezaaid in 96-well kweekplaten. Cellulaire proliferatie werd gemeten bij 24 uur, 48 uur en 72 uur na transfectie, respectievelijk, met de Cell Counting kit-8 (DOJINDO, Japan) volgens het protocol van de fabrikant. De absorptie bij een golflengte van 450 nm, die positief verband met het vermogen van cellulaire proliferatie toont, werd bepaald met een spectrofotometer (E-LIZA MAT-3000).}

Celcyclus assay

Forty -Acht uur na transfectie werden de cellen gehesen aan 0,25% trypsine en gewassen in DPBS (Gibco); zij werden vervolgens in 70% ethanol gefixeerd bij -20 ° C gedurende 24 uur. Voor flowcytometrische analyse (EPICS XL Beckman Coulter), werden cellen geïncubeerd in RNAse (Fermentas) bij 37 ° C gedurende 30 minuten, behandeld met PI (Sigma) en gesuspendeerd in 300 gl DPBS.

Statistische analyse

De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD van ten minste drie afzonderlijke experimenten. De significantie werd geanalyseerd met de t-test van de student en niet-parametrische toetsen (Mann-Whitney U-test en Kruskal-Wallis H test). De statistische significantie van de correlatie tussen de expressie van miR-29a en p42.3 eiwit werd berekend door de chikwadraattoets en Spearman rang correlatie. Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS 13.0 software (IBM, USA) en verschillen werden als statistisch significant bij P
< 0.05.

• PLoS ONE: Verlies van de Promyelocytic Leukemie Protein bij maagkanker: Gevolgen voor de IP-10 Expressie en Tumor-Infiltrating Lymfocytes
• PLoS ONE: prognostische betekenis van miR-181b en miR-21 bij maagkanker patiënten behandeld met S-1 /Oxaliplatine of Doxifluridine /Oxaliplatin