PLOS ONE: miR-29a Empêche la prolifération cellulaire et induit un arrêt du cycle cellulaire par la régulation négative de p42.3 dans Human gastrique Cancer

Résumé

Comme un gène nouvellement identifié et caractérisé, p42.3 est associé à la cellule la prolifération et la tumorigénicité. L'expression de p42.3 est régulée positivement dans le cancer gastrique humain (GC), mais ses mécanismes sous-jacents de l'action ne sont pas bien compris. Les microARN (miARN) sont connus pour jouer un rôle de réglementation vitaux dans de nombreux processus cellulaires. Ici, nous avons utilisé la bioinformatique et des approches expérimentales pour étudier la relation réglementaire entre les miARN et le gène p42.3. Nous avons montré que miR-29a peut réprimer l'expression de p42.3 à la fois au niveau des ARNm et de protéines par liaison directement à son 3'UTR. En outre, une relation inverse a été observée entre miR-29a et p42.3 expression dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et des échantillons de tissus GC, en particulier dans les cas où p42.3 a été régulée à la baisse. Pris ensemble, nous avons élucidé les rôles antérieurement non constatés de miR-29a et indiqué que miR-29a peut fonctionner, au moins partiellement, en ciblant le gène p42.3 en GC humaine

Citation:. Cui Y, Su WY , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) miR-29a Inhibe la prolifération cellulaire et induit un arrêt du cycle cellulaire par la régulation négative de p42.3 dans le cancer gastrique humain. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10.1371 /journal.pone.0025872

Editeur: Alfons Navarro, Université de Barcelone, Espagne

Reçu le 28 Février 2011; Accepté le 13 Septembre 2011; Publié 5 Octobre, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Cui et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par des subventions du programme national de recherche fondamentale de la Chine 973 programme (2010CB5293, le programme de recherche et de développement de haute technologie nationale de Chine (programme 863) (2006AA02A402, la national Natural science Foundation du programme clé (n ° 30830055) et le ministère . de la santé publique, la Chine (n ° 200802094) à FJY les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré qu'il n'y a pas des intérêts divergents existent.

introduction

p42.3 est un nouveau gène qui a été récemment isolé et identifié par l'affichage différentiel d'ARNm (mRNADD) technique. l'ADNc pleine longueur de p42 0,3 est d'environ 4,0 kb et le gène code pour une 389 acides aminés (aa) une protéine qui est estimée avoir une masse moléculaire de 42,3 kDa. D'autres recherches ont révélé que son expression est le cycle cellulaire dépendante dans le cancer gastrique (GC) des lignées cellulaires. Ses pics d'expression de protéines pendant la phase M du cycle cellulaire, ce qui diminue peu à peu avant après la division cellulaire; cela indique que p42.3 peuvent être impliqués dans la régulation du cycle cellulaire. En outre, le silençage de p42.3 par de petits ARN interférents résultats (siARN) dans la régulation positive de CHK2 et la régulation négative de la cycline B1, qui sont les deux principales protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire [1], [2]. Alors que la RT-PCR et des analyses immunohistochimiques ont montré que p42.3 est régulée positivement en GC par rapport aux échantillons de tissus normaux, la recherche fonctionnelle a suggéré que l'épuisement de p42.3 peut non seulement conduire à l'inhibition de la prolifération des cellules GC et la formation de colonies in vitro
, mais peut également réduire de manière significative la tumorigénicité chez la souris nude [3]. Bien que des études antérieures ont suggéré un rôle crucial pour le gène p42.3 dans la pathologie de GC, les mécanismes sous-jacents spécifiques de son action restent à clarifier.

Les microARN (miARN) sont constitués d'une classe de petite taille (~ 22 nucléotides), des ARN non codants endogènes qui sont connus pour jouer des rôles régulateurs importants dans l'expression du gène [4]. La transcription miRNA primaire est appelé pri-miRNA [5], qui est transcrit par l'ARN polymérase II ou III [6], [7]. Le pri-miARN est ensuite clivé par le complexe microprocesseur Drosha-DGCR8 pour produire la molécule précurseur en épingle à cheveux (pré-miARN) qui est ensuite exporté à partir du noyau vers le cytoplasme par exportin-5 /Ran-GTP. Avec l'aide d'un complexe qui contient la RNase Dicer et la protéine d'ARN double brin de liaison, TRBP, le ~70-nucleotide pré-miARN est transformé en maturité miRNA [8]. Le brin fonctionnel du miRNA mature est chargé dans le silence (RISC), qui contient les protéines, argonaute complexes (Ago) et Tnrc6, tandis que l'autre brin est habituellement dégradé RNA-induced [9]. Le miARN matures guide le RISC aux séquences complémentaires imparfaites dans les ARNm cibles pour réprimer la traduction de l'ARNm apparenté, promouvoir la transcription désintégration, ou les deux [10]. On estime que la plupart des gènes codant sont probablement régis par les microARN et, tandis qu'un miARN peut réglementer plus d'un gènes cibles, certains gènes peuvent être régulés par plusieurs miARN [11].

L'évidence croissante suggère que les miARN sont impliqués dans un large éventail de processus physiologiques et pathologiques, y compris le développement, la différenciation, la prolifération et l'apoptose [12.13,14,15]. Bien que des anomalies d'expression miRNA ont été déterminées dans de nombreuses tumeurs humaines, y compris colorectaux, gastriques et les cancers du sein [16], [17], le nombre de ces tumeurs est toujours en expansion. Toutefois, les fonctions détaillées de miARN dans les tumeurs restent à élucider.

Des études récentes ont suggéré que miR-29 a des fonctions complexes dans diverses maladies. MiR-29a peut se comporter comme un suppresseur de tumeur à la fois dans les poumons et les lignées cellulaires du cancer du pancréas et donc la surexpression exogène des résultats miR-29a à une réduction significative du potentiel invasif et la prolifération de ces lignées de cellules [18]. Le rôle de suppresseur de tumeur de miR-29a est également soutenu par sa régulation à la baisse observée dans une large gamme de tumeurs solides, y compris les neuroblastomes, les sarcomes et les tumeurs cérébrales [19]. En revanche, miR-29a est régulée positivement indolent B-cellule humaine leucémie lymphoïde chronique (B-CLL) [20] et de la leucémie myéloïde aiguë (AML) [21], ce qui suggère un éventuel rôle de promoteur de la tumeur. En outre, l'expression aberrante de miR-29a peuvent être trouvées dans de nombreuses maladies non malignes, y compris la fibrose du foie [22], le diabète [23] et la maladie d'Alzheimer [24]. Bien que de nombreux gènes ont déjà été confirmés pour être les cibles directes de miR-29a, comme PPM1D [25], PI3K [26] et le neurone navigateur 3 [24], ils représentent une très petite fraction du nombre total de gènes que miR-29a cibles.

Dans le présent rapport, nous démontrent que l'expression de p42.3 a été contrôlé à la fois les niveaux de l'ARNm et de protéines par miR-29a via le ciblage direct de la 3'UTR de p42.3. MiR-29a pourrait supprimer la prolifération cellulaire et d'induire l'arrêt du cycle cellulaire, au moins en partie, par l'intermédiaire de l'une régulation négative de l'expression de p42.3. De plus, nous avons constaté que l'expression de la protéine p42.3 était inversement corrélée avec l'expression de miR-29a dans les tissus GC humaines.

Résultats p42.3-3'UTR est présumément visé par miR -29a

putatif miARN qui ont été prédit pour cibler le gène p42.3 par plus d'une base de données ont été analysées. Les deux premiers miARN qui ont été prédites trois fois ont été sélectionnés pour confirmation et les trois autres miARN, y compris miR-29a, dont les sites de liaison putative étaient proches de celles des deux premiers ont également été sélectionnés comme candidats pour validation. MiR-29a a été prédit par les bases de données et TargetScan miRGEN, ce qui indiquait que son site de liaison putatif était au niveau des positions 213-219 de la p42.3-3'UTR (figure 1A). Les autres candidats ne sont pas répertoriés ici.

ciblant directement le p42.3-3'UTR par miR-29a

Le test du gène rapporteur a été utilisé pour valider si p42.3 était une cible directe de miR-29a. De type sauvage et mutant p42.3-3'UTR contenant le site de liaison putatif de miR-29a ont été clonés dans les plasmides individuels et fusionnés avec le gène rapporteur. L'intensité de fluorescence du gène rapporteur a été significativement diminué dans le groupe qui a été co-transfectées avec WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 et pcDNA3.1 /pri-miR-29a par rapport au témoin. En outre, il n'y a pas de baisse significative de l'intensité de fluorescence dans le groupe qui a été co-transfectée avec MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (figure 1B), ce qui confirme en outre que miR-29a a induit la régulation négative de l'expression du gène via le p42.3 la liaison spécifique du site putatif de la p42.3-3'UTR.

expression de miR-29a et p42.3 sont inversement proportionnels dans les lignées cellulaires du GC

Pour assurer la liaison entre p42 .3 et miR-29a, nous avons étudié l'expression endogène de miR-29a et p42.3 dans six lignées de cellules GC humaines (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 et AGS) et une lignée de cellules normales de l'épithélium gastrique (GES-1; la figure 2A-C). Nous avons constaté que le niveau d'ARNm p42.3 a été significativement plus élevée que la commande normale dans toutes les lignées cellulaires GC, à l'exception de la CGT-7901, où la différence ne soit pas statistiquement significative. Le niveau de p42.3 d'expression est variable au niveau de la protéine, mais était significativement plus élevée dans toutes les lignées cellulaires de GC par rapport à GES-1.We a également montré que l'expression de miR-29a était faible dans quatre des lignées de cellules GC ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 et AGS), qui a révélé une relation inverse avec l'expression de p42.3. Bien que l'expression de miR-29a était élevée dans SNU-1, cela n'a pas été statistiquement significative. Il est à noter que l'expression élevée de miR-29a dans MKN-28 était une exception.

miR-29a régule l'expression de p42.3

Pour évaluer si p42.3 a été réprimée par miR -29a, nous avons traité des cellules MKN-45 avec les mimiques et les inhibiteurs de miR-29a pendant 48 heures afin de réguler à la baisse de manière exogène en amont et l'expression de miR-29a en particulier; l'expression de p42.3 a ensuite été déterminée. Après la transfection de cellules MKN-45 avec les mimétiques, l'expression de miR-29a a augmenté d'environ 10 fois, tandis que le traitement avec les inhibiteurs a diminué le niveau de miR-29a par plus de 50% (figure 3A-B). Cela suggère que les deux mimétiques et des inhibiteurs de miR-29a travaillent efficacement dans nos expériences. La surexpression de miR-29a pouvait réprimer de manière significative l'expression de p42.3 aux niveaux d'ARNm et de protéines, ce qui était un effet similaire à la mise sous silence de p42.3 par p42.3 siRNA (si-p42.3). Nous avons également détecté que CHK2 a été régulée positivement et cyclinB1 a été downregulated après la mise sous silence de p42.3 par p42.3 siRNA. Fait intéressant, des effets similaires ont été exercées sur CHK2 et cyclinB1 par la surexpression de miR-29a dans les cellules MKN-45 (figure 3C-D). En outre, la transfection d'inhibiteurs de miR-29a diminué de manière spectaculaire l'expression de CHK2 et a augmenté l'expression et p42.3 cyclinB1 (figure 3E-F). Cela suggère que miR-29a peut réguler l'expression du gène dans p42.3 MKN-45 cellules.

miR-29a inhibe la prolifération cellulaire in vitro

D'après les données de la prolifération cellulaire test, nous avons dessiné les courbes d'absorption à la longueur d'onde de 450 nm après transfection pour des durées différentes. Nous avons constaté que la prolifération cellulaire a été inhibée de manière significative après la transfection de MKN-45 cellules avec p42.3 siRNA pendant 48 h et 72 h, et un modèle similaire a été observée après que les cellules ont été transfectées avec imite de miR-29a. Cependant, le degré de répression obtenu par mimétiques miR-29a était supérieure à p42.3 induite par la régulation négative de l'ARNsi-(figure 4A). Au contraire, la croissance cellulaire a été promu d'environ 10%, par rapport au témoin négatif lorsque transfectées avec des inhibiteurs de miR-29a pendant 48 h, mais il y avait une baisse à 72 h (figure 4B). Ceci indique que miR-29a pourrait inhiber la prolifération cellulaire par l'intermédiaire de réprimer l'expression de p42.3.

blocs miR-29a progression du cycle cellulaire

Silencing de p42.3 par p42.3 siRNA peut entraîner en arrêt du cycle cellulaire; Par conséquent, nous avons cherché à savoir si miR-29a pourrait affecter la progression du cycle cellulaire par l'intermédiaire ciblant le gène p42.3. Après MKN-45 cellules ont été transfectées avec p42.3 siRNA pendant 48 h, nous avons constaté que le cycle cellulaire a été bloquée à la phase G1 (75,93% de P
< 0,05), par rapport au témoin négatif ( 66,18%). Nous avons constaté que imite de miR-29a pourraient également induire G1 arrestation de phase dans MKN-45 cellules lorsqu'elles sont traitées pendant 48 h (75,56%, P
< 0,05; Figure 5).

Expression de miR-29a et la protéine p42.3 en GC et leur corrélation avec les caractéristiques clinico-pathologiques

en utilisant une technique quantitative PCR en temps réel, miR-29a a été détectée dans 60 paires de tissus GC et leur non-cancéreux adapté au voisinage des tissus, tandis que le niveau de la protéine p42.3 a également été évaluée dans ces tissus par Western blot. Sur 60 GC tissus échantillons, l'expression de p42.3 était élevée dans 35 cas (35/60, 58,33%) par rapport à leurs non-cancéreuses tissus adjacents appariés. Dans les 25 cas dans lesquels l'expression de p42.3 a été downregulated, l'expression de miR-29a était élevée dans 21 cas. expression miR-29a était faible dans 27 cas (27/60, 45%). Les données ci-dessus suggèrent une relation inverse entre miR-29a et de l'expression de la protéine p42.3 dans des échantillons de tissus ( P
= 0,000, Tableau 1 et Figure 6), mais le coefficient de corrélation n'a pas été bonne (r = -0,316 ).

en outre, miR-29a et de l'expression de la protéine p42.3 ont été évalués en ce qui concerne les caractéristiques clinico des 60 patients chez lesquels des échantillons de tissus ont été prélevés. Nos résultats suggèrent qu'il n'y avait pas de corrélation évidente entre la protéine p42.3 et l'expression de miR-29a, respectivement, avec des caractéristiques clinico (tableau 2).

Discussion

Le gène p42.3 est très conservé chez les mammifères et, comme un oncogene, elle peut jouer un rôle important dans la transformation progressive des cellules de l'épithélium gastrique normale aux cellules cancéreuses. Son expression différentielle pendant les étapes du cycle cellulaire révèle que p42.3 peut être impliquée dans la régulation du cycle cellulaire. Cela a été confirmé par nos résultats, qui ont montré que p42.3 silençage pourrait modifier l'expression de deux protéines clés, CHK2 et cycline B1, qui sont impliqués dans la régulation du cycle cellulaire. En utilisant des expériences de perte de fonction, nous avons démontré que p42.3 peut stimuler la prolifération cellulaire et rapporté, nos résultats ont montré que p42.3 a été surexprimé dans les tissus du GC par rapport à la muqueuse non-cancer adjacent [3]. Cependant, les mécanismes moléculaires conduisant à cette expression aberrante du gène p42.3 en GC est mal comprise, comme en témoigne l'absence de documentation disponible. MiRNAs peuvent réguler l'expression des gènes en ciblant les sites de liaison dans les ARNm cibles [27] et, dans les cancers humains, de nombreux miARN ont déjà été impliqués. Cependant, la fonction de seulement quelques a été compris à ce jour, en particulier dans GC [28].

Dans ce rapport, nous avons choisi miR-29a pour complément d'enquête par un système de gène rapporteur et finalement identifié que p42. 3 était un gène cible directe de miR-29a. Nos données suggèrent que les quatre bases de données (TargetScan, microRNA.org, Microcosm Cibles Version 5 et miRGen) utilisés étaient efficaces, mais pas parfait, des outils pour la prédiction des cibles miARN et ont fourni des preuves expérimentales pour l'amélioration de l'algorithme sous-jacent.

Nous avons montré que l'expression de p42.3 était inversement proportionnelle à l'expression de miR-29a dans quatre lignées de cellules GC. Dans trois d'entre eux, MKN-45, MGC-803 et AGS, cela était évident à la fois l'ARNm et des protéines, mais cela n'a pas été le cas dans la lignée cellulaire SGC-7901. En outre, l'expression de miR-29a n'a pas été faible dans les lignées de cellules MKN-28 et SNU-1. Pris ensemble, ces observations nous ont permis de l'hypothèse que le rôle régulateur de miR-29a est compliquée dans des lignées cellulaires de GC et que miR-29a peuvent jouer des rôles différents dans différents contextes cellulaires. Cependant, les mécanismes détaillés des fonctions miR-29a dans des lignées cellulaires de GC nécessitent une enquête plus approfondie.

Dans notre étude, miR-29a surexpression pourrait induire des effets similaires à ceux obtenus par le silence de p42.3 par p42.3 ARNsi. Deux p42.3 ARNm et la protéine ont été régulés à la baisse après que les cellules ont été transfectées avec l'ARNsi de p42.3 ou mimétiques miR-29a et la prolifération cellulaire et le cycle cellulaire ont été supprimées lorsque les cellules ont subi la même interférence. Il a suggéré que miR-29a peut être impliquée dans la pathogenèse de la GC par la répression de l'expression génique de p42.3. Cependant, nous avons constaté à partir des courbes de croissance que le degré de répression par mimétiques miR-29a était supérieure à p42.3 par ARNsi. À notre avis, la principale raison de cela peut être que miARN spécifiques pourraient réguler des centaines de gènes pour contrôler la fonction cellulaire. Dans la présente étude, miR-29a peut inhiber la prolifération cellulaire, au moins en partie, en ciblant p42.3.

Nos données ont montré que bien que le taux d'expression élevée de miR-29a était de 55% (33 /60) en GC, l'expression de p42.3 était faible dans 21 de ces cas. Cela suggère que miR-29a peut avoir un rôle vital dans les tissus du GC avec de faibles niveaux d'expression de p42.3.

Dans la présente étude, nous avons validé que p42.3 est une cible directe de miR-29a. Nous avons également démontré que miR-29a peut inhiber la prolifération cellulaire et bloquer le cycle cellulaire, au moins en partie, par la répression de l'expression p42.3 en GC. Nous concluons que miR-29a peut jouer un rôle crucial dans la régulation de l'expression de p42.3 en GC. Fait intéressant, nous avons trouvé que le gène de p42.3 pourrait également réguler l'expression de miR-29a (les données ne sont pas représentés ici), mais le mécanisme réglementaire sous-jacent sera explorée dans le futur.

Matériel et méthodes

Bioinformatics

Quatre approches de calcul efficaces qui utilisent des systèmes d'évaluation différents [29] - [32] ont été utilisées pour la prédiction des miARN réglementaires qui ciblent le gène p42.3, y compris TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), Microcosm Cibles Version 5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv /microcosme /htdocs /cibles /v5 /) et miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Les cibles ont été sélectionnées pour une confirmation supplémentaire du groupe de miARN qui étaient communs aux résultats générés à partir de plus d'une recherche.

Des échantillons de tissus

paires Soixante histopathologique a confirmé GC et les tissus non cancéreux adjacent les échantillons ont été obtenus auprès de patients ayant subi une résection chirurgicale à l'hôpital Renji affilié à l'école de médecine, Université de Chine Jiaotong de Shanghai entre Juillet 2007 et Janvier 2009. le non-de cancer appariés tissus adjacents ont été obtenus au moins 5 cm de distance du site de la tumeur. L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la recherche de l'Université Jiaotong de Shanghai et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients, alors que le consentement écrit a été obtenu à partir de chaque patient.

Les lignées cellulaires et

GC humain conditions de culture des lignées cellulaires, CGS-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 et AGS et la lignée de cellules de l'épithélium GES-1 normale gastrique, qui ont été achetés auprès de l'ATCC (Etats-Unis) ont été maintenues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) additionné de sérum de veau fœtal à 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans un 5% de CO _{2 de l'incubateur. Une solution de trypsine (0,25%) a été utilisé pour détacher les cellules du flacon de culture.}

Vecteur construction

Pour construire les vecteurs d'expression pri-miR-29a a été amplifié avec des amorces conçues par Premier logiciel d'amorce 5,0 (tableau 3), puis clone dans pcDNA3.1 (Invitrogen). Pour produire les plasmides qui contenaient le site de liaison putatif de miR-29a, à la fois de type sauvage et des séquences mutantes de la position 111 à 380 du p42.3-3'UTR ont été synthétisés chimiquement (figure 1A), puis ont été clonées à l'aval du gène EGFP à Bam HI
et Eco
sites de RI dans le vecteur pcDNA3 /EGFP (Saierbio, Tianjin, Chine).

analyse du gène rapporteur

MKN-45 cellules ont été ensemencées dans des puits en triple d'une plaque de 24 puits le jour précédant la transfection. PcDNA3.1 (+) /primaire miR-29a ont été co-transfectées avec de type sauvage et mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR respectivement. Ensuite, 0,5 pg de pcDNA3.1 (+) /primaire miR-29a et 0,5 pg de pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR ont été ajoutés dans chacun des puits, tandis que 0,1 pg de vecteur pDsRed-C1 (Clontech ), qui a exprimé la DP, ont été ajoutés à chaque puits comme une référence endogène. Les cellules qui ont été transfectées avec seulement pcDNA3 /EGFP /ou p42.3-3'UTR pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+) ont été utilisées comme témoins. Les cellules ont été recueillies 48 h après la transfection et analysés sur la base de l'intensité de la fluorescence EGFP et RFP détectée en utilisant Fluorescence spectrophotomètre F-4500 (Hitachi, Japon).

Cellule transfection

Transfection de MKN-45 les cellules ont été réalisées en utilisant le réactif de lipofectamine 2000 (Invitrogen) suivant le protocole du fabricant. MKN-45 ont été ensemencées dans des plaques 6 puits ou des plaques à 96 puits à 30% de confluence le jour précédant la transfection. Imite (100 nM, GenePharma) et des inhibiteurs (200 nM, RIBOBIO) de miR-29a ont été utilisés pour exogène en amont et régulent à la baisse l'expression de miR-29a. Pour faire taire l'expression du gène p42.3, les cellules MKN-45 ont été transfectées avec le siRNA contre p42.3 (si-p42.3, 100 nM, GenePharma). L'ARN de commande (nommé NF) est non homologue à une séquence du génome humain. Les séquences des oligonucleotides sont présentées dans le tableau 4.

temps réel RT-PCR

ARN total a été isolé en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) et ensuite traité avec de la DNase sans RNase I ( Fermentas, San Diego, CA, USA). L'ARN total (500 ng) a été transcrit de manière inverse en utilisant le kit de réactifs PrimeScript RT (Takara, Dalian, Japon). Les séquences des amorces utilisées pour amplifier et p42.3 GAPDH sont présentés dans le tableau 3. Pour analyser l'expression de la maturité miR-29a, 2 pg de l'ARN total a été soumis à une transcription inverse en utilisant le miARN Q-PCR tout-en-un Kit de détection (GeneCopoeia, Guangzhou, Chine). Quantitative PCR en temps réel pour les matures miR-29a et U6 a été effectuée selon les instructions du fabricant en utilisant le système PCR ABI 7300 en temps réel et des amorces spécifiques conçues par GeneCopoeia, en Chine. L'expression relative de p42.3 et miR-29a a été étalonnée par rapport à une référence endogène (GAPDH et U6 petit ARN nucléaire, respectivement) et par rapport au témoin. Les résultats ont été présentés comme facteur de changement, calculé selon la méthode 2 (-ΔΔCT) [33]; un rapport d'expression relative de < 1,0 a été considéré comme faible, alors qu'un rapport de > 1,0 a été considéré comme une expression élevée [14]

Western blot

La protéine totale à partir de cellules et de tissus en culture. ont été extraites par RIPA Lysis Buffer contenant PMSF, selon les instructions du fabricant (Beyotime, Shanghai, Chine). La concentration en protéine a été mesurée en utilisant la méthode de Bradford [34]. Dans l'ensemble, 40 ug de protéine ont été soumis à une électrophorèse à travers des gels de SDS à 10% de Polyacrylamide et ont été ensuite transférées sur une membrane de PVDF (Millipore). La membrane a été incubée avec un anticorps p42.3 (1:500, Abmart, Chine), l'anticorps CHK2 (1:1,000, CST), un anticorps cyclinB1 (1:1,000, CST) ou GAPDH (1:5,000, Kang Chen, Chine) à 4 ° C jusqu'au lendemain. Les anticorps secondaires ont été marqués avec HRP (Kang Chen, Chine) et les signaux ont été détectés en utilisant le kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Par la suite, les images ont été analysées par le logiciel ImageJ 1,43. L'expression des protéines a été étalonnée par rapport à une référence endogène (GAPDH) et par rapport au témoin. Un rapport d'expression relative de < 1,0 a été considéré comme faible expression, alors qu'un rapport de > 1,0 a été considéré comme une expression élevée [14]

La prolifération cellulaire test

Harvested MKN-45 cellules. (environ 5 x 10 ^{4 cellules) ont été ensemencées dans des plaques de culture à 96 puits. La prolifération cellulaire a été mesurée à 24 h, 48 h et 72 h après la transfection, respectivement, en utilisant le kit de comptage de cellules 8 (DOJINDO, Japon) selon le protocole du fabricant. L'absorbance à une longueur d'onde de 450 nm, ce qui montre relation positive à la capacité de la prolifération cellulaire, a été déterminée par un spectrophotomètre (E-LIZA MAT-3000).}

Cycle cellulaire test

Quarante -huit heures après la transfection, les cellules ont été levées en utilisant 0,25% de trypsine et lavées dans du DPBS (Gibco); ils ont ensuite été fixés dans 70% d'éthanol à -20 ° C pendant 24 heures. Pour l'analyse cytométrique en flux (EPICS XL Beckman Coulter), les cellules ont été incubées dans ARNase (Fermentas) à 37 ° C pendant 30 minutes, traitée avec du PI (Sigma) et on met en suspension dans 300 DPBS ul.

Analyse statistique

Les données ont été présentés sous forme de moyenne ± écart-type à partir d'au moins trois expériences distinctes. La signification a été analysée avec le test t de Student et les tests non paramétriques (Mann-Whitney U test et Kruskal-Wallis H test). La signification statistique de la corrélation entre l'expression de miR-29a et p42.3 protéine a été calculée par le test du chi carré et le rang de corrélation de Spearman. L'analyse statistique a été effectuée en utilisant SPSS 13.0 logiciel (IBM, USA) et les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à P
< 0,05.

• PLOS ONE: Perte de la protéine leucémie promyélocytaire dans le cancer gastrique: Implications pour IP-10 Expression et infiltrant les tumeurs Lymphocytes
• PLOS ONE: Importance Prognostic de miR-181b et miR-21 dans l'estomac des patients cancéreux traités par S-1 /oxaliplatine ou doxifluridine /oxaliplatine