PLOS ONE: miR-29a inibe a proliferação celular e induz a paragem do ciclo celular através da regulação negativa do p42.3 na gástrico humano Cancer

Abstract

Como um gene recém identificado e caracterizado, p42.3 está associada com células proliferação e tumorigenicidade. A expressão de p42.3 é regulada positivamente em cancro gástrico humano (CG), mas os seus mecanismos de acção subjacentes não são bem compreendidos. MicroRNAs (miARNs) são conhecidos por desempenhar papéis reguladores importantes em muitos processos celulares. Aqui utilizamos bioinformática e abordagens experimentais para investigar a relação regulamentar entre miRNAs e o gene p42.3. Nós mostramos que miR-29a poderia reprimir a expressão p42.3 em ambos os mRNA e os níveis de proteína via directa ligação ao seu 3'UTR. Além disso, foi observada uma relação inversa entre o miR-29a e expressão p42.3 em linhas celulares de cancro gástrico e amostras de tecido GC, especialmente nos casos em que p42.3 foi reprimidos. Tomados em conjunto, temos elucidado papéis anteriormente não reconhecidos de miR-29a e indicou que miR-29a pode funcionar, pelo menos parcialmente, visando o gene p42.3 em GC humana

Citation:. Cui Y, Su WY , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et ai. (2011) miR-29a inibe a proliferação celular e induz a paragem do ciclo celular através da regulação negativa do p42.3 no câncer gástrico humano. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10.1371 /journal.pone.0025872

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 28 de fevereiro de 2011; Aceito: 13 de setembro de 2011; Publicação: 05 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Cui et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do programa Nacional de Pesquisa básica da China 973 programa (2010CB5293, o programa de Pesquisa e Desenvolvimento de alta Tecnologia Nacional da China (programa 863) (2006AA02A402, a National Science Foundation Natural do programa de Key (No. 30.830.055) e do Ministério . de Saúde Pública, China (No. 200802094) para FJY os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

p42.3 é um novo gene que foi recentemente isolado e identificado pela exibição mRNA diferencial (mRNADD) técnica. o cDNA de comprimento total de p42 0,3 é de cerca de 4,0 kb, e o gene codifica uma proteína de 389 aminoácidos (aa) que se estima que tem uma massa molecular de 42,3 kDa. Outras pesquisas revelou que a sua expressão é dependente do ciclo celular em linhas celulares de cancro gástrico (GC). Os seus picos de expressão de proteínas durante a fase M do ciclo celular, antes de diminuir gradualmente após a divisão celular; isto indica que a p42.3 pode estar envolvido na regulação do ciclo celular. Além disso, o silenciamento de p42.3 por pequenos ARN interferente (siRNA) resulta na regulação positiva de CHK2 e a infra-regulação da ciclina B1, que são duas proteínas-chave envolvidas na regulação do ciclo celular [1], [2]. Enquanto RT-PCR e análise de imuno-histoquímica têm demonstrado que a p42.3 é regulada positivamente em GC em comparação com amostras de tecido normal, pesquisa funcional sugerem que a depleção de p42.3 pode resultar não apenas na inibição da proliferação celular e formação de colónias GC
in vitro, mas pode também reduzir significativamente a tumorigenicidade em ratinhos nus [3]. Embora estudos anteriores sugeriram um papel crítico para o gene p42.3 na patologia da GC, os mecanismos subjacentes específicas da sua acção devem ser esclarecidas.

Os microRNAs (miRNAs) consistem em uma classe de pequena (~ 22 nucleótidos), endógenos, RNAs não codificantes que são conhecidos por desempenhar papéis reguladores importantes na expressão do gene [4]. O transcrito de miARN primário é chamado pri-miARN [5], que é transcrita pela ARN polimerase II ou III [6], [7]. A pri-miARN é então clivado pelo complexo microprocessador Drosha-DGCR8 para produzir a molécula precursora de gancho de cabelo (pré-miARN) que é depois exportados a partir do núcleo para o citoplasma por exportina-5 /Ran-GTP. Com o auxílio de um complexo que contém o RNase Dicer e a proteína de cadeia dupla de ligação a ARN, TRBP, a ~ 70 nucleótidos pré-miARN é transformado em madura miARN [8]. A cadeia funcional da miARN maduro é carregado para o silenciamento complexo (RISC), que contém as proteínas, Argonaute (AGO) e Tnrc6, enquanto que a outra cadeia é normalmente degradada induzido por ARN [9]. O miARN maduro orienta o RISC para as sequências complementares imperfeitas em mRNAs alvo para reprimir a tradução do mRNA cognato, promover a transcrição de decaimento, ou ambos [10]. Estima-se que a maioria dos genes que codificam são provavelmente regulada por miARNs e, enquanto um miARN pode regular mais de um genes alvo, determinados genes pode ser regulada por vários miARNs [11].

A evidência crescente sugere que miARNs estão envolvidos em uma ampla variedade de processos fisiológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, proliferação e apoptose [12.13,14,15]. Embora as anormalidades da expressão miARN foram determinados em vários tumores humanos, incluindo os cancros colo-rectais, gástricos e da mama [16], [17], o número de tais tumores ainda está em expansão. No entanto, as funções detalhadas de miARN em tumores permanecem por ser elucidados.

Estudos recentes têm sugerido que o miR-29 tem funções complexas em várias doenças. MiR-29a podem se comportar como um supressor de tumor em ambos os pulmões e linhas de células de cancro do pâncreas, e, assim, a sobre-expressão exógena de resultados miR-29a em uma redução significativa do potencial invasivo e proliferação destas linhas de células [18]. O papel de supressor de tumor do miR-29a é também apoiada pela sua infra-regulação observado num espectro largo de tumores sólidos, incluindo neuroblastoma, sarcomas e tumores cerebrais [19]. Em contraste, o miR-29a é regulada positivamente em indolente de células B humanas de leucemia linfocítica crónica (LLC-B) [20] e leucemia mielóide aguda (LMA) [21], o que sugere um papel possível promotor tumoral. Além disso, a expressão aberrante de miR-29a pode ser encontrada em muitas doenças não malignas, incluindo fibrose do fígado [22], o diabetes [23] e doença de Alzheimer [24]. Embora muitos genes já foram confirmadas como sendo os alvos directos de miR-29a, tais como PPM1D [25], de PI3K [26] e neurónio Navigator 3 [24], que representam uma fracção muito pequena do total dos genes que o miR-29a alvos.

no presente relatório, demonstramos que a expressão p42.3 foi controlado nos níveis tanto de mRNA e proteína de miR-29a através de segmentação direta da 3'UTR de p42.3. MiR-29a poderia suprimir a proliferação celular e induzem a paragem do ciclo celular, pelo menos em parte, através da regulação negativa da expressão p42.3. Além disso, verificou-se que a expressão da proteína p42.3 foi inversamente correlacionada com a expressão de miR-29a em tecidos GC humanos.

Resultados

p42.3-3'UTR é supostamente alvo de miR -29

miARNs putativos que foram previstos para o gene alvo p42.3 por mais do que uma base de dados foram analisados. Os dois primeiros miRNAs que foram previstos por três vezes foram selecionados para confirmação e os outros três miRNAs, incluindo miR-29a, cujos locais de ligação putativa foram próximos aos dos dois primeiros também foram selecionados como candidatos para validação. MiR-29a foi prevista por as bases de dados e TargetScan miRGEN, o que indica que a sua sítio de ligação putativo era nas posições 213-219 da p42.3-3'UTR (Figura 1A). Os outros candidatos não estão listados aqui.

Diretamente visando o p42.3-3'UTR por miR-29a

O ensaio de gene repórter foi utilizado para validar se p42.3 era um alvo direto de miR-29a. De tipo selvagem e mutante p42.3-3'UTR contendo o sítio de ligação putativo do miR-29a foram clonados em plasmídeos individuais e fundida com o gene repórter. A intensidade de fluorescência do gene repórter foi significativamente diminuída no grupo que foi co-transfectado com WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 e pcDNA3.1 /pri-miR-29a comparado com o controlo. Além disso, não houve diminuição significativa da intensidade fluorescente no grupo que foi co-transfectado com MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (Figura 1B), ainda confirmando que o miR-29a induzida a regulação negativa da expressão do gene através da p42.3 de ligação específica do local putativo da p42.3-3'UTR.

a expressão de miR-29a e p42.3 são inversamente proporcionais em linhas celulares GC

Para determinar a ligação entre p42 0,3 e miR-29a, estudou-se a expressão endógena de miR-29a e p42.3 em seis linhas celulares humanas (GC SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 e AGS) e normal gástrica linha de células do epitélio (GES-1; Figura 2A-C). Verificou-se que o nível de ARNm de p42.3 foi significativamente maior do que o controlo normal em todas as linhas celulares de GC, com excepção da SGC-7901, em que a diferença não foi estatisticamente significativa. O nível de expressão foi p42.3 variável ao nível da proteína, mas era significativamente maior em todas as linhas de células quando comparado com GC GES-1.we também mostraram que a expressão de miR-29a foi baixa em quatro das linhas de células de GC ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 e AGS), que revelou uma relação inversa com a expressão p42.3. Embora a expressão de miR-29a foi alta em SNU-1, esta não foi estatisticamente significativa. Vale ressaltar que a alta expressão de miR-29a em MKN-28 foi uma exceção.

miR-29a regula a expressão p42.3

Para avaliar se p42.3 foi reprimida por miR -29, nós tratamos MKN-45 imita as células com e inibidores de miR-29a durante 48 h, a fim de exogenamente cima e para regular negativamente a expressão de miR-29a especificamente; Determinou-se então a expressão de p42.3. Após a transfecção de MKN-45 imita as células com a expressão de miR-29a aumentado em aproximadamente 10 vezes, enquanto que o tratamento com os inibidores da diminuição do nível de miR-29a por mais do que 50% (Figura 3A-B). Isto sugere que ambos os imitadores e inibidores de miR-29a funcionou eficientemente nas nossas experiências. Superexpressão de miR-29a pôde reprimir significativamente a expressão de p42.3 em ambos os níveis de mRNA e proteína, o que era um efeito semelhante ao silenciamento de p42.3 por siRNA p42.3 (si-p42.3). Nós também detectou que CHK2 foi regulada e cyclinB1 foi reprimidos após o silenciamento de p42.3 por siRNA p42.3. Curiosamente, os efeitos foram semelhantes exercida sobre CHK2 e cyclinB1 pela sobre-expressão de miR-29a em células MKN-45 (Figura 3C-D). Além disso, a transfecção de inibidores de miR-29a diminuiu dramaticamente expressão CHK2 e aumentou p42.3 e expressão cyclinB1 (Figura 3E-F). Isto sugeriu que o miR-29a poderia regular a expressão do gene em células p42.3 MKN-45.

miR-29a inibe a proliferação celular in vitro

De acordo com os dados de proliferação celular ensaio, que atraiu as curvas de absorção no comprimento de onda de 450 nm, após a transfecção para diferentes durações. Verificou-se que a proliferação de células foi significativamente inibida, após a transfecção de células MKN-45 com ARNsi p42.3 durante 48 h e 72 h, e um padrão similar foi observado após as células foram transfectadas com imita de miR-29a. No entanto, o grau de repressão conseguida por imita o miR-29a foi maior do que p42.3 regulação negativa induzida pelo siARN (Figura 4A). Pelo contrário, o crescimento celular promovido por cerca de 10%, em comparação com o controlo negativo, quando transfectadas com inibidores de miR-29a durante 48 h, mas houve uma diminuição às 72 h (Figura 4B). Isto indicou que miR-29a poderia inibir a proliferação celular através de reprimir a expressão de p42.3.

blocos de miR-29a ciclo celular progressão

O silenciamento de p42.3 por siRNA p42.3 pode resultar na parada do ciclo celular; Assim, foi investigado se o miR-29a poderia afectar a progressão do ciclo celular através de direccionamento do gene p42.3. Depois de células MKN-45 foram transfectadas com ARNsi p42.3 durante 48 h, verificou-se que o ciclo celular foi bloqueado em fase G1 (75,93%, P
< 0,05), em comparação com o controlo negativo ( 66,18%). Descobrimos que imita de miR-29a também pode induzir a apreensão fase G1 em células MKN-45 quando tratados durante 48 h (75,56%, P Art < 0,05; Figura 5).

Expression de miR-29a e proteína p42.3 no GC e sua correlação com características clinicopatológicas

Usando uma técnica quantitativa PCR em tempo real, miR-29a foi detectada em 60 pares de tecidos GC e sua correspondência não-câncer adjacente tecidos, enquanto que o nível de proteína p42.3 foi também avaliada nestes tecidos por Western blotting. Fora de amostras de tecidos de 60 GC, expressão p42.3 foi elevada em 35 casos (35/60, 58,33%) em relação aos seus tecidos adjacentes não-cancerosas correspondentes. Nos 25 casos em que a expressão p42.3 foi regulada negativamente, expressão de miR-29a foi elevada em 21 casos. expressão de miR-29a foi baixa em 27 casos (27/60, 45%). Os dados acima sugerem uma relação inversa entre o miR-29a e a expressão da proteína p42.3 em amostras de tecido ( P
= 0,000, Tabela 1 e Figura 6), mas não o coeficiente de correlação foi boa (r = -0,316 ).

Além disso, o miR-29a e expressão da proteína p42.3 foram avaliados no que diz respeito às características clínico-patológicas de 60 pacientes dos quais foram tiradas amostras de tecido. Nossos achados sugerem que não existem correlações óbvias entre proteína p42.3 e expressão de miR-29a, respectivamente, com características clínico-patológicas (Tabela 2).

Discussão

O gene p42.3 é altamente conservada em mamíferos e, como um oncogene, pode desempenhar um papel importante na transformação progressiva de células do epitélio gástrico normais para células cancerosas. A sua expressão diferencial durante as fases do ciclo celular que revela p42.3 pode estar envolvido na regulação do ciclo celular. Isto foi ainda confirmado pelos nossos resultados, que mostraram que o silenciamento p42.3 poderia alterar a expressão de duas proteínas-chave, CHK2 e ciclina B1, que estão envolvidos na regulação do ciclo celular. Usando experiências de perda de função, que demonstraram que p42.3 pode estimular a proliferação celular e, como relatado, os nossos resultados mostraram que a p42.3 estava sobre-expressa em tecidos GC quando comparado com a mucosa não-cancro adjacente [3]. No entanto, os mecanismos moleculares que resultam nesta expressão aberrante do gene de p42.3 em GC é mal compreendida, como evidente a partir da falta de literatura disponível. MiRNAs pode regular a expressão gênica, visando os locais de ligação nos mRNAs alvo [27] e, em cancros humanos, muitos miRNAs já foram implicados. No entanto, a função de poucos tem sido entendido até agora, especialmente em GC [28].

Neste relatório, foram selecionados miR-29a para uma investigação mais aprofundada por um sistema de gene repórter e, em última análise identificou que p42. 3 era um gene alvo directo de miR-29a. Nossos dados sugerem que os quatro bancos de dados (TargetScan, microRNA.org, microcosmo Alvos Versão 5 e miRGen) utilizados foram eficientes, mas não perfeito, ferramentas para a predição de alvos de miRNA e forneceu evidências experimentais de melhorias para o algoritmo subjacente.

Nós mostramos que a expressão p42.3 foi inversamente relacionada com a expressão de miR-29a em quatro linhas de células GC. Em três deles, MKN-45, MGC-803 e AGS, esta foi evidente em ambos o nível de proteína e de ARNm, mas não foi este o caso na linha celular SGC-7901. Além disso, a expressão de miR-29a não foi baixa nas linhas celulares MKN-28 e SNU-1. Em conjunto, estas observações permitiu-nos a hipótese de que o papel regulador do miR-29a é complicado em linhas de células de GC e que miR-29a podem desempenhar papéis diferentes em diferentes origens celulares. No entanto, os mecanismos detalhadas das funções miR-29a em linhas celulares GC requer uma investigação mais aprofundada.

Em nosso estudo, miR-29a superexpressão poderia induzir efeitos semelhantes aos alcançados pelo silenciamento de p42.3 por p42.3 siRNA. Ambos os ARNm de p42.3 e proteína foram reprimidos depois as células foram transfectadas com ARNsi p42.3 ou imita o miR-29a e a proliferação de células e ciclo celular foram suprimida quando as células foram submetidas a mesma interferência. É sugerido que o miR-29a pode ser envolvido na patogénese da GC através da repressão da expressão do gene p42.3. No entanto, verificou-se a partir das curvas de crescimento que o grau de repressão por imita o miR-29a foi maior do que por siARN p42.3. Em nossa opinião, a principal razão para isso pode ser que miRNAs específicas poderiam regular centenas de genes para controlar a função celular. No presente estudo, o miR-29a podem inibir a proliferação celular, pelo menos em parte, pela segmentação p42.3.

Os nossos dados mostraram que, embora a taxa de expressão elevada de miR-29a foi de 55% (33 /60) no GC, expressão p42.3 foi baixa em 21 destes casos. Isto sugere que o miR-29a pode ter um papel vital em tecidos GC com baixos níveis de expressão de p42.3.

No presente estudo, nós validado que p42.3 é um alvo direto de miR-29a. Nós também têm demonstrado que o miR-29a pode inibir a proliferação celular e bloquear o ciclo celular, pelo menos em parte, através da repressão da expressão p42.3 em GC. Concluímos que o miR-29a pode desempenhar um papel crítico na regulação da expressão de p42.3 em GC. Curiosamente, descobrimos que gene p42.3 também pode regular a expressão de miR-29a (os dados não são mostrados aqui), mas o mecanismo de regulação subjacente será explorado no futuro.

Materiais e Métodos

Bioinformatics

Quatro abordagens computacionais eficientes que utilizam sistemas de avaliação diferentes [29] - [32] foram utilizados para a previsão dos miRNAs reguladoras que têm como alvo o gene p42.3, incluindo TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), microcosmo Alvos Versão 5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv /microcosmo /htdocs /metas /v5 /) e miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Alvos foram selecionados para confirmação do grupo de miRNAs que eram comuns aos resultados gerados a partir de mais de uma pesquisa.

As amostras de tecido

pares Sessenta de histologicamente confirmados GC e tecido não-câncer adjacente as amostras foram obtidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital Renji filiado ao Shanghai Jiaotong University School of Medicine, China entre julho de 2007 e janeiro de 2009. a não-câncer combinados tecidos adjacentes foram obtidas pelo menos 5 cm de distância do local do tumor. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Shanghai Jiaotong University e o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes, enquanto consentimento por escrito foram obtidas de cada paciente.

linhas de células e condições de cultura

GC Humano linhas de células, a SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 e AGS, e a linha celular de epitélio GES-1 normal, gástrico, que foram adquiridos a partir de ATCC (EUA), foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, EUA) suplementado com soro fetal de bovino 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO _{2 incubadora. Uma solução de tripsina (0,25%) foi utilizado para separar as células do frasco de cultura.}

Vector construção

Para construir vectores de expressão pri-miR-29a foi primeiro amplificado com os iniciadores concebidos pela Primer Premier software 5.0 (Tabela 3) e, em seguida, clonado em pcDNA3.1 (Invitrogen). Para produzir os plasmídeos que continham o sítio de ligação putativo do miR-29a, tanto de tipo selvagem e mutantes de sequências de posição 111 a 380 da p42.3-3'UTR foram sintetizados quimicamente (Figura 1A) e, em seguida, foram clonados a jusante do do gene EGFP em Bam
HI e Eco
sites de RI no vector pcDNA3 /EGFP (Saierbio, Tianjin, China).

ensaio de gene repórter

células MKN-45 foram semeadas em poços em triplicado de uma placa de 24 poços no dia antes da transfecção. PcDNA3.1 (+) /primary-miR-29a foram co-transfectadas com o tipo selvagem e MUT-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR respectivamente. Em seguida, 0,5 g de pcDNA3.1 (+) /primário-miR-29a e foram adicionados a cada um dos poços de 0,5 ^ g de pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR, enquanto que 0,1 ug de vector de pDsRed-C1 (Clontech ), que expressa a RFP, foram adicionados a cada poço como uma referência endógena. As células que só foram transfectadas com pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR ou pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+) foram utilizados como os controlos. As células foram coletadas 48 h após a transfecção e analisadas com base na intensidade da fluorescência EGFP e RFP detectada usando Espectrofotômetro de fluorescência F-4500 (Hitachi, Japão).

transfecção celular

A transfecção de MKN-45 células foi realizada utilizando o Reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. células MKN-45 foram semeadas em placas de 6 poços ou placas de 96 poços em 30% de confluência no dia antes da transfecção. Mimics (100 nm, GenePharma) e inibidores (200 nm, RIBOBIO) de miR-29a foram usadas para exogenamente para cima e regular negativamente a expressão de miR-29a. Para silenciar a expressão do gene p42.3, as células MKN-45 foram transfectadas com siRNA contra p42.3 (Si-p42.3, 100 nm, GenePharma). O ARN de controlo (nomeado como NC) foi não-homólogas a qualquer sequência do genoma humano. As sequências dos oligonucleótidos são mostrados na Tabela 4.

em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) e subsequentemente tratado com DNase I isenta de RNase ( Fermentas, San Diego, CA, EUA). O ARN total (500 ng) foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit de reagentes PrimeScript RT (Takara, Dalian, Japão). As sequências dos iniciadores utilizados para amplificar p42.3 e de GAPDH são mostrados na Tabela 3. Para analisar a expressão do madura miR-29a, 2 ug do ARN total foi submetido a transcrição reversa usando a tudo-em-um miARN Q-PCR Kit de detecção (GeneCopoeia, Guangzhou, China). Quantitative PCR em tempo real para madura miR-29a e U6 foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, usando o sistema de tempo real ABI 7300 PCR e iniciadores específicos desenhados por GeneCopoeia, China. A expressão relativa de p42.3 e miR-29a foi normalizada para uma referência endógena (GAPDH e ARN nuclear pequeno U6, respectivamente) e em relação ao controlo. Os resultados foram apresentados como a mudança vezes, calculada pelo método 2 (-ΔΔCT) [33]; uma razão de expressão relativa de < 1,0 foi considerado de baixo, enquanto que uma relação de > 1,0 foi considerada como uma expressão elevada [14]

Western blotting

A proteína total a partir de células cultivadas e tecidos. foram extraídos por RIPA tampão de lise contendo PMSF, de acordo com as instruções do fabricante (Beyotime, Xangai, China). A concentração de proteínas foi medida utilizando o método de Bradford [34]. Em geral, 40 ug de proteína foram sujeitos a electroforese através de géis de 10% poliacrilamida-SDS e foram em seguida transferidas para uma membrana de PVDF (Millipore). A membrana foi incubada com anticorpo p42.3 (1:500, Abmart, China), anticorpo CHK2 (1:1,000, CST), anticorpo cyclinB1 (1:1,000 CST) ou GAPDH (1:5,000, Kang Chen, China) a 4 ° C durante a noite. Os anticorpos secundários foram marcadas com HRP (Kang Chen, China) e os sinais foram detectadas utilizando o kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, EUA). Subsequentemente, as imagens foram analisadas pelo software ImageJ 1,43. A expressão da proteína foi normalizada para uma referência endógena (GAPDH) e em relação ao controlo. A relação de expressão relativa de < 1,0 foi considerado como baixa expressão, enquanto uma proporção de > 1,0 foi considerado como alta expressão [14]

A proliferação celular ensaio

colhidas células MKN-45. (aproximadamente 5 x 10 ^{4 células) foram semeadas em placas de cultura de 96 poços. A proliferação celular foi medida às 24 h, 48 h e 72 h pós-transfecção, respectivamente, utilizando o Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante. A absorvância a um comprimento de onda de 450 nm, o que mostra a relação positiva a capacidade de proliferação celular, foi determinada por um espectrofotómetro (E-LIZA MAT-3000).}

ciclo celular ensaio

Quarenta -Oito horas após a transfecção, as células foram levantadas usando 0,25% de tripsina e lavadas em DPBS (Gibco); elas foram em seguida fixados em 70% de etanol a -20 ° C durante 24 h. Para a análise de citometria de fluxo (EPICS XL Beckman Coulter), as células foram incubadas em RNAse (Fermentas) a 37 ° C durante 30 min, tratada com PI (Sigma) e suspendeu-se em 300 ul de DPBS.

A análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± SD de pelo menos três experiências separadas. A significância foi analisada com o teste t de Student e testes não paramétricos (teste de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis H). A significância estatística de correlação entre a expressão de miR-29a e p42.3 proteína foi calculada pelo teste do qui-quadrado e correlação de Spearman. A análise estatística foi realizada usando SPSS 13.0 (IBM, EUA), e as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a P Art < 0,05.

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