Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами от Национальной программы фундаментальных исследований Китая (973 программа 2010CB5293, исследований и разработок Национальная программа высоких технологий Китая (863 Program) (2006AA02A402, Национальный фонд естественных наук ключевой программы (№ 30830055) и Министерство . общественного здравоохранения, Китай (№ 200802094) к FJY Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
Конкурирующие интересы:. авторы заявили что не существует никаких конкурирующих интересов.
Введение MicroRNAs (микроРНК) состоят из одного класса мала (~ 22 нуклеотида), эндогенные, некодирующие РНК, которые, как известно, играют важную регуляторную роль в экспрессии генов [4]. Первичный микроРНК транскрипт называется ИРП-микроРНК [5], которая транскрибируется с помощью РНК-полимеразы II или III [6], [7]. ИРП-микроРНК затем расщепляется микропроцессорного комплекса Drosha-DGCR8 производить молекулы предшественника шпилька (предварительно микроРНК), который затем экспортируется из ядра в цитоплазму экспортином-5 /Ran-GTP. С помощью комплекса, содержащего РНКазу Dicer и двухцепочечной РНК-связывающий белок, TRBP, то ~70-нуклеотид предварительно микроРНК обрабатывается в зрелые микроРНК [8]. Функциональная цепь зрелого микроРНК загружается в РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC), которое содержит белки, Argonaute (назад) и Tnrc6, в то время как другой нити, как правило, ухудшается [9]. Зрелый микроРНК ведет к RISC несовершенных комплементарных последовательностей в мРНК мишеней для подавления родственный трансляции мРНК, способствуют распаду транскриптов, или оба [10]. Считается, что большинство генов, кодирующих, вероятно, регулируется микроРНК и, в то время как микроРНК может регулировать более одного генов-мишеней, определенные гены могут регулироваться несколькими микроРНК [11]. В настоящем докладе мы покажем, что выражение p42.3 контролировалась на уровне как мРНК и белка MIR-29a через прямое таргетирование 3'UTR из p42.3. MIR-29a может подавлять пролиферацию клеток и вызывают остановку клеточного цикла, по крайней мере частично, с помощью понижающей регуляции экспрессии p42.3. Кроме того, мы обнаружили, что экспрессия белка p42.3 обратно коррелирует с экспрессией микроРНК-29а в тканях человека GC. p42.3-3'UTR является предполагаемо мишенью MIR -29a Выражение MIR-29а и p42.3 обратно пропорциональны в линиях GC клеток Биоинформатика Репортер гена анализа в реальном времени RT-PCR Западная Пролиферация клеток анализ
<р> p42.3 представляет собой новый ген, который был недавно выделен и идентифицирован с помощью мРНК дифференциальный дисплей (mRNADD) техники. Полноразмерная кДНК Р42 .3 составляет примерно 4,0 кб, а ген кодирует белок 389 аминокислот (аа), что, по оценкам, имеют молекулярную массу 42,3 кДа. Дальнейшее исследование показало, что его экспрессия клеточного цикла зависит в желудочном клеточных линий рака (GC). Его экспрессия белка пики во время фазы М клеточного цикла, прежде чем постепенно уменьшающейся после клеточного деления; это указывает на то, что p42.3 может участвовать в регуляции клеточного цикла. Кроме того, глушение p42.3 малыми мешая РНК (киРНК) приводит к повышающей регуляции Chk2 и понижающей циклина В1, которые являются двумя ключевыми белков, участвующих в регуляции клеточного цикла [1], [2]. В то время как ОТ-ПЦР и иммуногистохимического анализа показали, что p42.3 позитивно регулируется в GC по сравнению с образцами нормальной ткани, функциональные исследования показывают, что истощение p42.3 может не только привести к ингибированию пролиферации клеток и ГХ образование колоний в пробирке
, но и может значительно уменьшить туморогенность у голых мышей [3]. Хотя предыдущие исследования показали критическую роль гена p42.3 при патологии GC, конкретные основные механизмы его действия остаются в разъяснении.
<Р> Растущий данные свидетельствуют о том, что микроРНК вовлечены в широком диапазоне физиологических и патологических процессов, в том числе развития, дифференцировки, пролиферации и апоптоза [12.13,14,15]. Хотя нарушения экспрессии микроРНК были определены во многих опухолях человека, включая колоректальный рак, язвы желудка и рака молочной железы [16], [17], число таких опухолей продолжает расширяться. Однако подробные функции микроРНК в опухолях, остаются невыясненными.
<Р> Недавние исследования показали, что микроРНК-29 имеет сложные функции при различных заболеваниях. MIR-29A может вести себя как супрессор опухоли в обоих легких и рака поджелудочной линий раковых клеток, и, таким образом, экзогенный сверхэкспрессия результатов микроРНК-29а в значительном сокращении инвазии и пролиферации этих клеточных линий [18]. Супрессоров опухолей роль микроРНК-29а также поддерживается ее наблюдаемой понижающей в широком спектре солидных опухолей, в том числе нейробластомы, саркомы и опухоли головного мозга [19]. В противоположность этому, микроРНК-29а усиливается в вялотекущей человек В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) [20] и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) [21], что свидетельствует о возможной роли промотора опухоли. Кроме того, аберрантное экспрессия микроРНК-29а можно найти во многих доброкачественных заболеваний, в том числе фиброзом печени [22], сахарный диабет [23] и болезни Альцгеймера [24]. Хотя многие гены уже подтверждены быть непосредственными объектами MIR-29а, такие как PPM1D [25], PI3K [26] и нейрон навигатор 3 [24], они представляют собой очень малую часть от общего числа генов, микроРНК-29а целей.
Результаты
<р> Предполагаемые микроРНК, которые были предсказаны целевой ген p42.3 более чем одной базы данных были проанализированы. Два верхних микроРНК, которые были предсказаны три раза были отобраны для дальнейшего подтверждения и трех других микроРНК, включая микроРНК-29а, чьи предполагаемые сайты связывания были близки к таковым из двух верхних были отобраны в качестве кандидатов для проверки. MIR-29a было предсказано в базах данных TargetScan и miRGEN, что указывало, что его предполагаемый сайт связывания был в положениях 213-219 из p42.3-3'UTR (Рис. 1А) Остальные кандидаты не перечислены здесь.
Непосредственно ориентации на p42.3-3'UTR с помощью микроРНК-29а
<р> Анализ ген-репортер использовали для проверки, был ли p42.3 непосредственной мишенью СИК-29а. Дикого типа и мутанта p42.3-3'UTR содержащие мнимые сайт связывания микроРНК-29а были клонированы в отдельные плазмид и слиты с геном-репортером. Интенсивность флуоресценции репортерного гена была значительно снижена в группе, которая была котрансфицируют WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 и pcDNA3.1 /Pri-MIR-29а по сравнению с контролем. Кроме того, не было никакого заметного снижения интенсивности флуоресценции в группе, которая была котрансфицируют MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (Фигура 1В), далее подтверждая, что микроРНК-29а индуцирует понижающей регуляции экспрессии генов p42.3 ПОСРЕДСТВОМ специфическое связывание предполагаемого сайта p42.3-3'UTR.
<р> Для того, чтобы установить связь между P42 .3 и микроРНК-29а, мы изучали эндогенную экспрессию микроРНК-29а и p42.3 в шести линиях человека ГХ клеток (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 и AGS) и один нормальный желудочный эпителий клеточная линия (ГЭС-1; Рисунок 2A-C). Мы обнаружили, что уровень мРНК p42.3 был значительно выше, чем нормальный контроль во всех GC клеточных линиях, за исключением SGC-7901, где разница не была статистически значимой. Уровень экспрессии p42.3 варьировала на уровне белка, но был значительно выше во всех линиях GC клеток по сравнению с GES-1.We также показали, что экспрессия микроРНК-29а был низким в четырех из GC клеточных линий ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 и AGS), который показал обратную связь с выражением p42.3. Хотя экспрессия микроРНК-29а была высокой в СНУ-1, это не было статистически значимым. Стоит отметить, что высокий уровень экспрессии микроРНК-29а в MKN-28 был исключением.
MIR-29a регулирует экспрессию p42.3
<р> Для того, чтобы оценить, был ли p42.3 репрессирован MIR -29a, мы обрабатывали MKN-45 клеток с мимикой и ингибиторов MIR-29а в течение 48 ч, чтобы экзогенно вверх и подавляют экспрессию микроРНК-29а в частности; экспрессия p42.3 затем определяли. После трансфекции клеток MKN-45 с мимики, выражение микроРНК-29а увеличивается примерно на 10 раз, в то время как лечение с помощью ингибиторов снижало уровень микроРНК-29а более чем на 50% (рис 3A-B). Это позволило предположить, что оба мимика и ингибиторы микроРНК-29а эффективно работала в наших экспериментах. Сверхэкспрессия MIR-29а может значительно подавлять экспрессию p42.3 на обоих уровнях мРНК и белка, который был подобный эффект к молчанию p42.3 по p42.3 миРНК (си-p42.3). Мы также обнаружили, что Chk2 был и cyclinB1 повышающей регуляции была подавлена после глушителей p42.3 по p42.3 миРНК. Интересно, что подобные эффекты оказываемого на Chk2 и cyclinB1 сверхэкспрессией микроРНК-29а в клетках MKN-45 (рис 3C-D). Кроме того, трансфекция ингибиторы микроРНК-29а резко сниженную экспрессию Chk2 и увеличение p42.3 и cyclinB1 выражение (рис 3E-F). Это позволило предположить, что микроРНК-29а может регулировать экспрессию гена p42.3 в клетках MKN-45.
MIR-29a ингибирует пролиферацию клеток в пробирке
<р> По данным пролиферации клеток анализ, мы обратили кривые поглотительной способности при длине волны 450 нм после трансфекции для различных длительностей. Мы обнаружили, что пролиферацию клеток была значительно ингибирует после трансфекции клеток MKN-45 с p42.3 миРНК в течение 48 ч и 72 ч, и аналогичная картина была отмечена после того, как клетки были трансфицированы миметики MIR-29а. Тем не менее, степень репрессии, достигнутый микроРНК-29а мимике было больше, чем p42.3 миРНК-индуцированной понижающей (фиг.4А). Напротив, рост клеток был повышен примерно на 10%, по сравнению с отрицательным контролем, когда трансфицировали с ингибиторами MIR-29а в течение 48 часов, но наблюдалось снижение на 72 ч (рис 4б). Это свидетельствует о том, что микроРНК-29а может ингибировать пролиферацию клеток через подавление экспрессии p42.3.
MIR-29a блокирует клеточный цикл прогрессии
<р> Сайленсинг p42.3 по p42.3 миРНК может привести к в остановке клеточного цикла; Таким образом, мы исследовали, может ли микроРНК-29а влияют на прогрессирование клеточного цикла с помощью ориентации гена p42.3. После того, как клетки MKN-45 трансфицировали p42.3 миРНК в течение 48 ч, мы обнаружили, что клеточный цикл был заблокирован в фазе G1 (75.93%, P
≪ 0,05), по сравнению с отрицательным контролем ( 66,18%). Мы обнаружили, что имитирует MIR-29а также может вызвать G1 арест фазы в клетках MKN-45 при обработке в течение 48 ч (75,56%, P
&лт; 0,05; Рисунок 5).
Expression СИК-29а и p42.3 белка в GC и их корреляции с клинико-патологические характеристики
<р> Использование количественного в режиме реального времени метод ПЦР, микроРНК-29а была обнаружена в 60 пар GC тканей и их соответствием нераковых смежно ткани, в то время как уровень p42.3 белка также оценивали в этих тканях с помощью Вестерн-блоттинга. Из 60 образцов тканей GC, экспрессия p42.3 была высокой в 35 случаях (35/60, 58,33%) по отношению к их совпавших нераковых прилегающих тканей. В 25 случаях, в которых была подавлена экспрессия p42.3, экспрессия микроРНК-29а был высок в 21 случаях. выражение микроРНК-29а была низкой в 27 случаях (27/60, 45%). Приведенные выше данные предполагает обратную связь между микроРНК-29а и экспрессии p42.3 белка в образцах тканей ( P
= 0,000, таблица 1 и рисунок 6), но коэффициент корреляции не был хорошим (R = -0.316 ).
<р> Кроме того, микроРНК-29а и экспрессия p42.3 белка оценивали по отношению к клинико-патологическими характеристиками 60 пациентов, от которых были взяты образцы тканей. Наши результаты свидетельствуют о том, что не было никаких очевидных корреляций между p42.3 белка и экспрессии микроРНК-29а, соответственно, с клинико-патологическими особенностями (таблица 2).
Обсуждение
<р> Ген p42.3 сильно консервативными у млекопитающих и, как онкоген, он может играть важную роль в прогрессивном трансформации нормальных желудочных эпителиальных клеток в раковые клетки. Его дифференциальное выражение на стадии клеточного цикла, показывает, что p42.3 может участвовать в регуляции клеточного цикла. Это было дополнительно подтверждено нашими результатами, которые показали, что p42.3 глушителей может привести к изменению экспрессии двух ключевых белков, Chk2 и циклин В1, которые участвуют в регуляции клеточного цикла. Использование с потерей функции экспериментов, мы показали, что p42.3 может стимулировать клеточную пролиферацию и, как сообщалось, наши результаты показали, что p42.3 был избыточно экспрессируется в тканях GC по сравнению с прилегающей слизистой неонкологического [3]. Однако молекулярные механизмы, приводящие к таким аномальным экспрессии гена p42.3 в GC плохо понимается, как видно из-за отсутствия доступной литературы. МикроРНК может регулировать экспрессию генов путем пристреливать сайты связывания в целевых мРНК [27], а в злокачественных опухолях человека, многие микроРНК уже причастны. Тем не менее, функция лишь несколько было понято до настоящего времени, особенно в GC [28].
<Р> В этом отчете мы выбрали MIR-29а для дальнейшего исследования системы гена-репортера и в конечном итоге определили, что Р42. 3 был прямой целевой ген микроРНК-29а. Наши данные свидетельствуют о том, что четыре базы данных (TargetScan, microRNA.org, микрокосма Цели версии 5 и miRGen) использовали были эффективными, но не идеально, инструменты для прогнозирования целей микроРНК и при условии, экспериментальные доказательства для улучшения базового алгоритма.
<р> Мы показали, что экспрессия p42.3 было обратно пропорционально связано с экспрессией микроРНК-29а в четырех GC клеточных линий. В трех из них, MKN-45, MGC-803 и AGS, это было очевидно, как на мРНК, так и на уровне белка, но это было не так в клеточной линии SGC-7901. Кроме того, экспрессия микроРНК-29а не была низкой в клеточных линиях MKN-28 и СНУ-1. Взятые вместе, эти наблюдения позволили нам выдвинуть гипотезу о том, что регуляторная роль микроРНК-29а осложняется в линиях клеток GC и что микроРНК-29а могут играть разные роли в различных клеточных слоев. Однако подробные механизмы функций микроРНК-29а в линиях GC клеток требуют дальнейшего изучения.
<Р> В нашем исследовании, микроРНК-29а избыточная экспрессия может вызвать аналогичные последствия для тех, достигается за счет замалчивания p42.3 по p42.3 миРНК. Оба мРНК p42.3 и белка были подавлена после того, как клетки трансфицировали p42.3 миРНК или микроРНК-29а мимике и пролиферации клеток и клеточного цикла были подавлены, когда клетки подвергались же интерференцией. Он предположил, что микроРНК-29а могут быть вовлечены в патогенез GC через подавление экспрессии генов p42.3. Тем не менее, мы обнаружили, из кривых роста, что степень репрессии микроРНК-29а мимике было больше, чем p42.3 миРНК. По нашему мнению, основной причиной этого может быть то, что специфические микроРНК может регулировать сотни генов контролировать клеточную функцию. В настоящем исследовании, микроРНК-29a могут ингибировать клеточную пролиферацию, по крайней мере частично, путем ориентации p42.3.
<Р> Наши данные показали, что хотя скорость высокой экспрессии микроРНК-29а составила 55% (33 /60) в GC, экспрессия p42.3 была низкой в 21 из этих случаев. Это позволило предположить, что микроРНК-29а может иметь жизненно важную роль в GC тканях с низким уровнем экспрессии p42.3.
<Р> В настоящем исследовании мы подтверждено, что p42.3 является прямой мишенью MIR-29а. Мы также показали, что микроРНК-29a могут ингибировать пролиферацию клеток и блокируют клеточный цикл, по меньшей мере, частично, через подавление экспрессии p42.3 в GC. Мы пришли к выводу, что микроРНК-29а может играть решающую роль в регуляции экспрессии p42.3 в GC. Интересно мы обнаружили, что ген p42.3 может также регулировать экспрессию микроРНК-29а (данные не показаны), но основной механизм регулирования будут рассмотрены в будущем.
Материалы и методы
<р> Четыре эффективные вычислительные подходы, которые используют различные системы, оценивающих [29] - [32] были использованы для предсказания регуляторных микроРНК, которые нацелены на ген p42.3, в том числе TargetScan (HTTP: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), микрокосма Цели версии 5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv~~HEAD=dobj /микрокосм /HTDOCS /цели /v5 /) и miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Целевые показатели были выбраны для дальнейшего подтверждения из группы микроРНК, которые были общими для результатов, полученных из более чем одного поиска.
Образцы тканей
<р> Шестьдесят пар Гистопатологически подтвердили GC и смежной ткани без рака образцы были получены у пациентов, перенесших хирургическую резекцию в больнице Renji филиалом в Шанхае Цзяотун школы медицины университета, Китай в период с июля 2007 года по январь 2009 года соответствовали неонкологического соседние ткани были получены по меньшей мере, в 5 см от опухоли. Исследование было одобрено Комитетом по этике исследования Шанхайский университет по и информированное согласие было получено от всех пациентов, в то время как письменное согласие было получено у каждого пациента.
Клеточные линии и условия культивирования
<р> Человеческий GC клеточные линии, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, СНУ-1 и АГС, а также ГЭС-1 нормальная желудочная линия эпителиальных клеток, которые были приобретены у АТСС (США), поддерживали в среде RPMI 1640 среда Игла (Gibco, Gaithersburg, MD, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Клетки культивировали при 37 ° С в 5% CO <суб> 2 инкубаторе. Раствор трипсина (0,25%) был использован для отделения клеток из колбы культуры.
Вектор строительство
<р> Для построения векторов экспрессии, ИРП-микроРНК-29а был впервые амплифицировали с использованием праймеров, разработанных Праймер Premier 5.0 программного обеспечения (таблица 3), а затем клонировали в пкДНК3.1 (Invitrogen). Для получения плазмид, которые содержали предположительный сайт связывания микроРНК-29а, как дикого типа и мутантные последовательности из позиции 111 до 380 из p42.3-3'UTR были синтезированы химическим путем (Фигура 1А), а затем клонировали в нижний бьеф гена EGFP в Bam HI
и Eco RI
сайтов в векторе pcDNA3 /EGFP (Saierbio, Тяньцзинь, Китай).
<р> MKN-45 клеток высевали в трех повторах лунки 24-луночного планшета в день перед трансфекцией. ПкДНК3.1 (+) /первичной микроРНК-29а были котрансфицируют дикого типа и MUT-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR соответственно. Затем 0,5 мкг pcDNA3.1 (+) /первичной MIR-29a и добавляли в каждую лунку 0,5 мкг pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR, в то время как 0,1 мкг вектора pDsRed-С1 (Clontech ), которая выражается в RFP, были добавлены в каждую лунку в качестве эндогенного ссылки. Клетки, которые были трансфицированы только с pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR или pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+), были использованы в качестве контрольных. Клетки собирали через 48 ч после трансфекции и анализироваться на основе интенсивности EGFP и RFP флуоресценции обнаруженного с помощью флуоресцентной спектрофотометр F-4500 (Hitachi, Япония).
Cell трансфекция
<р> Трансфекция MKN-45 клетки проводили с использованием Липофектамин 2000 Реагент (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. MKN-45 клетки высевают в 6-луночные планшеты или 96-луночные планшеты при 30% слияния день до трансфекции. Мимики (100 нМ, GenePharma) и ингибиторы (200 нМ, RIBOBIO) СИК-29а были использованы для экзогенно вверх и подавляют экспрессию микроРНК-29а. Для того, чтобы заставить замолчать экспрессию гена p42.3, клетки MKN-45 были трансфицированы миРНК против p42.3 (Si-p42.3, 100 нм, GenePharma). РНК-контроль (назван NC) был не гомологичны любой последовательности человеческого генома. Последовательности нуклеотидов олиго приведены в таблице 4.
<р> Общую РНК выделяли с использованием реагента тризола (Invitrogen) и затем обрабатывают не содержащей РНКазы ДНКазы I ( Ферментас, Сан-Диего, штат Калифорния, США). Суммарную РНК (500 нг) подвергали обратной транскрипции с использованием набора реагентов PrimeScript RT (Takara, Далянь, Япония). Последовательности праймеров, используемых для амплификации p42.3 и GAPDH приведены в таблице 3. Для анализа экспрессии зрелого MIR-29а, 2 мкг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с использованием All-in-One микроРНК Q-PCR Обнаружение Kit (GeneCopoeia, Гуанчжоу, Китай). Количественная ПЦР в реальном времени для зрелой микроРНК-29а и U6 проводили в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием в режиме реального времени система PCR ABI 7300 и специфических праймеров, разработанных GeneCopoeia, Китай. Относительное выражение p42.3 и микроРНК-29а нормализовалось к эндогенному ссылки (GAPDH и U6 небольших ядерных РНК, соответственно), а также по отношению к контролю. Результаты были представлены в виде кратности изменения, рассчитывается с использованием метода 2 (-ΔΔCT) [33]; относительное соотношение экспрессии ≪ 1,0 рассматривалось как низкий, в то время как соотношение > 1,0 рассматривалось как высокий уровень экспрессии [14]
блоттинга <р> Общий белок из культивируемых клеток и тканей. были извлечены RIPA лизирующего буфера, содержащего ФМСФ, в соответствии с инструкцией изготовителя (Beyotime, Шанхай, Китай). Концентрацию белка измеряли с использованием метода Бредфорд [34]. В целом, 40 мкг белка подвергают электрофорезу через 10% полиакриламидном геле, а затем переносили на PVDF мембрану (Millipore). Мембрану инкубировали с p42.3 антителом (1:500, Abmart, Китай), Chk2 антитела (1:1,000, CST), cyclinB1 антитела (1:1,000, ДКБ) или GAPDH (1:5,000, Кан Чен, Китай) при 4 ° С в течение ночи. Вторичные антитела метили с HRP (Kang Chen, Китай) и сигналы были обнаружены с использованием ECL набора (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Впоследствии изображения были проанализированы с помощью ImageJ 1.43 программного обеспечения. Экспрессии белка нормализовалось к эндогенному ссылки (GAPDH) и по сравнению с контролем. Относительное соотношение экспрессии &л; 1,0 рассматривалось как выражение низкой, в то время как отношение > 1,0 рассматривалось как высокий уровень экспрессии [14]
<р> Заготовленные клетки MKN-45. (приблизительно 5 х 10 4 клеток) высевали в 96-луночные культуральные планшеты. Клеточная пролиферация измеряли через 24 ч, 48 ч и 72 ч после трансфекции, соответственно, с использованием клеточной счетная Kit-8 (Dojindo, Япония) в соответствии с протоколом производителя. Оптическую плотность при длине волны 450 нм, что показывает положительное отношение к способности клеточной пролиферации, определяли с помощью спектрофотометра (Е-ЛИЗА МАТ-3000).
клеточного цикла анализа
<р> Сорок -eight часов после трансфекции клетки были сняты с использованием 0,25% трипсина и промывали в ДЗФР (Gibco); они затем фиксировали в 70% -ном этаноле при температуре от -20 ° С в течение 24 ч. Для анализа методом проточной цитометрии (EPICS XL Beckman Coulter), клетки инкубировали в РНКазу (Fermentas) при 37 ° С в течение 30 мин, обрабатывали PI (Sigma) и суспендировали в 300 мкл ДЗФР.
Статистический анализ
<р> Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение по меньшей мере из трех отдельных экспериментов. Значение анализировали с помощью т-теста Стьюдента и непараметрических тестов (тест Манна-Уитни U и тест Крускала-Уоллиса H). Статистическая значимость корреляции между экспрессией микроРНК-29а и p42.3 белка рассчитывали с помощью теста хи-квадрат и ранговой корреляции Спирмена. Статистический анализ проводился с использованием SPSS 13,0 программного обеспечения (IBM, США) и различия считались статистически значимыми при P &
ЛТ; 0.05.
Не бойтесь колоноскопии
Замена красного мяса заменителями мяса на растительной основе снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний
Недавно обнаруженные крупные фаги стирают границу между жизнью и неживой
Что древние фекалии могут рассказать нам об эволюции микробиома кишечника человека?
Пищеварительные проявления распространены, но незначительны среди госпитализированных пациентов с COVID-19
Влагалищные бактерии, способствующие преждевременным родам
Генетически измененные кишечные бактерии снижают риск развития колоректального рака у мышей - результаты исследования
Исследователи обнаружили, что редактирование генов бактерий, присутствующих в кишечнике мышей, может помочь уменьшить воспаление и связанный с этим риск колоректального рака. Исследование ученых из Юг
Миграция влияет на микробиоту кишечника, что, в свою очередь, влияет на здоровье.
Кишечник человека содержит триллионы полезных и дружественных бактерий, составляющих микробиом. Было обнаружено, что эти микробы сильно влияют на состояние человека, включая общее состояние здоровья и
Самые полезные кишечные бактерии с растительной или средиземноморской диетой
Новое исследование показывает, что определенные продукты, содержащиеся в растительной или средиземноморской диете, могут защитить кишечник от воспалительных заболеваний. избирательно способствуя росту