PLOS ONE: miR-29a inhibe la proliferación celular e induce la detención del ciclo celular a través de la regulación a la baja de p42.3 en gástrico humano Cancer

Extracto

Como un gen recientemente identificado y caracterizado, p42.3 está asociado con la célula proliferación y tumorigenicidad. La expresión de p42.3 está regulada positivamente en el cáncer gástrico humano (GC), pero sus mecanismos de actuación no se conocen bien. Los microARN (miARN) se sabe que juega un papel regulador vital en muchos procesos celulares. Aquí hemos utilizado la bioinformática y enfoques experimentales para investigar la relación entre la reglamentación miRNAs y el gen p42.3. Hemos demostrado que el miR-29a podía reprimir la expresión p42.3 tanto en el mRNA y los niveles de proteína mediante la unión directa a su 3'UTR. Por otra parte, se observó una relación inversa entre el miR-29a y expresión p42.3 en líneas celulares de cáncer gástrico y muestras de tejidos GC, especialmente en los casos en que se downregulated p42.3. Tomados en conjunto, hemos dilucidado funciones que antes no reconocidas de miR-29a y se indica que el miR-29a puede funcionar, al menos parcialmente, por la orientación del gen p42.3 en GC humana

Visto:. Cui Y, Su WY , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) miR-29a inhibe la proliferación celular e induce la detención del ciclo celular a través de la regulación a la baja de p42.3 en el cáncer gástrico humano. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10.1371 /journal.pone.0025872

Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, ​​España |

Recibido: 28 Febrero, 2011; Aceptado: September 13, 2011; Publicado: 5 Octubre 2011

Derechos de Autor © 2011 Cui et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del programa Nacional de Investigación básica de China, 973 de programa (2010CB5293, el programa de Investigación y Desarrollo de alta Tecnología Nacional de China (programa 863) (2006AA02A402, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales del programa clave (Nº 30.830.055) y el Ministerio . de Salud Pública, china (Nº 200802094) para FJY los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que existen conflictos de intereses.

Introducción

p42.3 es un nuevo gen que ha sido recientemente aislado e identificado por la técnica de visualización diferencial de ARNm (mRNADD). el ADNc de longitud completa de p42 0,3 es de aproximadamente 4,0 kb, y el gen codifica una proteína de 389 aminoácidos (aa) que se estima que tiene una masa molecular de 42,3 kDa. Otras investigaciones han revelado que su expresión es dependiente del ciclo celular en líneas celulares de cáncer gástrico (CG). Sus picos de expresión de proteínas durante la fase M del ciclo celular, disminuyendo gradualmente después de antes de la división celular; esto indica que p42.3 pueden estar involucrados en la regulación del ciclo celular. Por otra parte, el silenciamiento de p42.3 por los resultados pequeños ARN de interferencia (siRNA) en la regulación al alza de CHK2 y la regulación a la baja de la ciclina B1, que son dos proteínas clave implicadas en la regulación del ciclo celular [1], [2]. Mientras RT-PCR y los análisis inmunohistoquímicos han demostrado que la p42.3 es upregulated en GC en comparación con muestras de tejido normal, la investigación funcional ha sugerido que el agotamiento de p42.3 no sólo puede dar lugar a la inhibición de la proliferación celular y la formación de colonias GC in vitro
, sino que también puede reducir significativamente la tumorigenicidad en ratones desnudos [3]. Aunque estudios previos han sugerido un papel fundamental para el gen p42.3 en la patología de GC, los mecanismos subyacentes específicas de su acción aún no se han aclarado.

Los microARN (miARN) consisten en una clase de pequeña (~ 22 nucleótidos), endógenos RNAs, no codificantes que se sabe que juegan papeles reguladores importantes en la expresión de genes [4]. La transcripción de los genes miARN primaria se llama pri-miARN [5], que se transcribe por la ARN polimerasa II o III [6], [7]. El pri-miARN se escinde a continuación por el microprocesador complejo Drosha-DGCR8 para producir la molécula de horquilla de precursor (pre-miARN) que se exporta a continuación, desde el núcleo hasta el citoplasma por exportin-5 /Ran-GTP. Con la ayuda de un complejo que contiene la RNasa Dicer y la proteína de doble cadena de unión al ARN, TRBP, el ~ 70 nucleótidos pre-miARN se procesa en madura miARN [8]. La hebra funcional de los genes miARN maduro se carga en el silenciamiento inducido por ARN (RISC), que contiene las proteínas, Argonaute complejo (Hace) y Tnrc6, mientras que la otra cadena es por lo general degrada [9]. Las guías de miARN maduro del RISC con las secuencias complementarias imperfectos en ARNm diana para reprimir la traducción de ARNm cognado, promover la descomposición transcripción, o ambos [10]. Se estima que la mayoría de los genes que codifican probablemente están regulados por miRNAs y, mientras que un miARN puede regular más de los genes diana, ciertos genes pueden ser reguladas por múltiples miRNAs [11].

La creciente evidencia sugiere que los miRNAs están involucrados en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación, la proliferación y la apoptosis [12.13,14,15]. A pesar de las anomalías de los genes miARN expresión se han determinado en muchos tumores humanos, incluyendo colorrectal, gástrico y cáncer de mama [16], [17], el número de estos tumores se sigue expandiendo. Sin embargo, las funciones detalladas de miARN en tumores aún no se han dilucidado.

Los estudios recientes han sugerido que el miR-29 tiene funciones complejas en diversas enfermedades. MiR-29a se puede comportar como un supresor de tumor tanto en líneas celulares de cáncer de páncreas y de pulmón, y por lo tanto la sobreexpresión exógeno de los resultados de miR-29a en una reducción significativa en el potencial invasivo y la proliferación de estas líneas de células [18]. El papel supresor de tumor de miR-29a también es apoyado por su regulación a la baja observada en un amplio espectro de tumores sólidos, incluyendo neuroblastoma, sarcomas y tumores cerebrales [19]. Por el contrario, el miR-29a está regulada positivamente en células B humanas de la leucemia linfocítica crónica indolente (LLC-B) [20] y la leucemia mieloide aguda (LMA) [21], lo que sugiere un posible papel de promotor de tumores. Además, la expresión aberrante de miR-29a se puede encontrar en muchas enfermedades no malignas, incluyendo la fibrosis hepática [22], diabetes [23] y la enfermedad de Alzheimer [24]. A pesar de que muchos genes ya han confirmado que los blancos directos de miR-29a, como PPM1D [25], PI3K [26] y el navegante neurona 3 [24], que representan una fracción muy pequeña del total de genes que el miR-29a objetivos.

en el presente informe, que demuestran que la expresión p42.3 se controló a los niveles tanto de ARNm y proteínas de miR-29a a través de la orientación directa de la 3'UTR de p42.3. MiR-29a podría suprimir la proliferación celular e inducir la detención del ciclo celular, al menos en parte, a través de la regulación a la baja de la expresión de p42.3. Por otra parte, se encontró que la expresión de la proteína p42.3 fue inversamente correlacionada con la expresión de miR-29a en los tejidos humanos GC.

Resultados

p42.3-3'UTR está supuestamente dirigida por el MIR -29a

putativo miRNAs que se prevé que el gen diana p42.3 por más de una base de datos fueron analizados. Se seleccionaron los dos mejores miRNAs que fueron predichas por tres veces para la confirmación adicional y los otros tres miRNAs, incluyendo el miR-29a, cuyos supuestos sitios de unión fueron similares a las de los dos primeros también fueron seleccionados como candidatos para la validación. MiR-29a fue predicho por las bases de datos y TargetScan Mirgen, lo que indica que su sitio de unión putativo fue en las posiciones 213-219 de la p42.3-3'UTR (Figura 1A). Los otros candidatos no se enumeran aquí.

directamente dirigidas a la p42.3-3'UTR por miR-29a

Se empleó el ensayo de gen indicador para validar si p42.3 era un objetivo directo de miR-29a. De tipo salvaje y mutante p42.3-3'UTR que contiene el sitio de unión putativo de miR-29a se clonaron en plásmidos individuales y se fusionaron con el gen reportero. La intensidad fluorescente del gen indicador se redujo significativamente en el grupo que fue co-transfectadas con WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 y pcDNA3.1 /pri-miR-29a en comparación con el control. Además, no hubo disminución significativa de la intensidad de fluorescencia en el grupo que fue co-transfectadas con MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (Figura 1B), lo que confirma, además, que miR-29a indujo la regulación a la baja de la expresión génica a través de la p42.3 unión específica del sitio putativo de la p42.3-3'UTR.

la expresión de miR-29a y p42.3 están inversamente relacionados en líneas celulares de GC

Para determinar la relación entre p42 0.3 y miR-29a, se estudió la expresión endógena de miR-29a y p42.3 en seis líneas celulares humanas (GC SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 y AGS) y una línea celular de epitelio gástrico normales (GES-1; la Figura 2A-C). Se encontró que el nivel de mRNA p42.3 fue significativamente más alto que el control normal en todas las líneas celulares GC con la excepción de SGC-7901, donde la diferencia no fue estadísticamente significativa. El nivel de expresión de p42.3 fue variable a nivel de proteínas, pero fue significativamente mayor en todas las líneas celulares de GC en comparación con GES-1.We también mostró que la expresión de miR-29a fue baja en cuatro de las líneas celulares de GC ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 y AGS), que reveló una relación inversa con la expresión p42.3. Aunque la expresión de miR-29a fue alta en SNU-1, esto no fue estadísticamente significativa. Vale la pena mencionar que la alta expresión de miR-29a en MKN-28 fue una excepción.

miR-29a regula la expresión p42.3

Para evaluar si p42.3 fue reprimida por el MIR -29a, se trataron MKN-45 celdas con los imitadores y los inhibidores de miR-29a durante 48 h con el fin de exógenamente arriba y regular a la baja la expresión de miR-29a en concreto; A continuación se determinó la expresión de p42.3. Después de la transfección de MKN-45 células con los imita, la expresión de miR-29a aumentó aproximadamente 10 veces, mientras que el tratamiento con los inhibidores disminuyó el nivel de miR-29a en más de un 50% (Figura 3A-B). Esto sugirió que tanto los imita e inhibidores de miR-29a trabajaron de manera eficiente en nuestros experimentos. La sobreexpresión de miR-29a pudo reprimir significativamente la expresión de p42.3, tanto a nivel de ARNm y proteínas, lo cual era un efecto similar al silenciamiento de p42.3 de siRNA p42.3 (si-p42.3). También se detectó que CHK2 se reguló y cyclinB1 se downregulated después de que el silenciamiento de p42.3 de siRNA p42.3. Curiosamente, efectos similares fueron ejercidas sobre CHK2 y cyclinB1 por la sobreexpresión de miR-29a en MKN-45 células (Figura 3C-D). Además, la transfección de los inhibidores de miR-29a disminuyó drásticamente la expresión CHK2 y el aumento de p42.3 y expresión cyclinB1 (Figura 3E-F). Esto sugiere que el miR-29a podría regular la expresión del gen p42.3 en MKN-45 células.

miR-29a inhibe la proliferación celular in vitro

Según los datos de la proliferación celular ensayo, dibujamos las curvas de absorbancia a la longitud de onda de 450 nm después de la transfección de diferentes duraciones. Se encontró que la proliferación celular se inhibió significativamente después de la transfección de las células MKN-45 con siRNA p42.3 durante 48 h y 72 h, y un patrón similar se observó después de las células fueron transfectadas con imitadores de miR-29a. Sin embargo, el grado de represión alcanzado por imita miR-29a era mayor que p42.3 downregulation siRNA inducida (Figura 4A). Por el contrario, el crecimiento celular fue promovida por aproximadamente 10%, en comparación con el control negativo cuando se transfecta con inhibidores de miR-29a durante 48 h, pero se produjo un descenso a las 72 h (Figura 4B). Esto indicaba que el miR-29a podría inhibir la proliferación celular a través de la represión de la expresión de p42.3.

bloques de miR-29a progresión del ciclo celular

El silenciamiento de p42.3 de siRNA p42.3 puede resultar en la detención del ciclo celular; Por lo tanto, se investigó si el miR-29a podría afectar a la progresión del ciclo celular a través de la orientación del gen p42.3. Después de MKN-45 células fueron transfectadas con siRNA p42.3 durante 48 h, se encontró que el ciclo celular se bloquea en la fase G1 (75,93%, P
< 0,05), en comparación con el control negativo ( 66,18%). Se encontró que imita de miR-29a también podrían inducir la detención fase G1 en células MKN-45 cuando se trataron durante 48 h (75,56%, P Hotel < 0,05; Figura 5).

Expresión de miR-29a y la proteína p42.3 en GC y su correlación con las características clínico-patológicas

el uso de un tiempo real técnica de PCR cuantitativa, se detectó el miR-29a en 60 pares de tejidos GC y su emparejado no cancerosas adyacentes tejidos, mientras que el nivel de proteína p42.3 también se evaluó en estos tejidos por transferencia Western. Fuera de tejidos muestras GC 60, la expresión p42.3 fue alta en 35 casos (35/60, 58.33%) en relación con sus tejidos adyacentes no cancerosas emparejados. En los 25 casos en los que se downregulated expresión p42.3, la expresión de miR-29a fue alta en 21 casos. la expresión de miR-29a fue baja en 27 casos (27/60, 45%). Los datos anteriores sugieren una relación inversa entre el miR-29a y expresión de la proteína p42.3 en muestras de tejido ( P
= 0,000, Tabla 1 y Figura 6), pero el coeficiente de correlación no fue buena (r = -0,316 ).

Además, el miR-29a y expresión de la proteína p42.3 se evaluaron con respecto a las características clínico-patológicas de los 60 pacientes de los cuales se tomaron muestras de tejido. Nuestros hallazgos sugieren que no hubo correlaciones evidentes entre la proteína p42.3 y la expresión de miR-29a, respectivamente, con las características clínico-patológicas (Tabla 2).

Discusión

El gen es altamente p42.3 conservada en los mamíferos y, como un oncogén, puede desempeñar un papel importante en la transformación progresiva de las células del epitelio gástrico normales en células cancerosas. Su expresión diferencial durante las etapas del ciclo celular revela que p42.3 puede estar implicada en la regulación del ciclo celular. Esto fue confirmado por nuestros resultados, que muestran que el silenciamiento p42.3 podría alterar la expresión de dos proteínas clave, CHK2 y ciclina B1, que están implicados en la regulación del ciclo celular. Usando experimentos de pérdida de función, hemos demostrado que p42.3 puede estimular la proliferación celular y como se informó, nuestros resultados mostraron que p42.3 se sobreexpresa en tejidos de GC en comparación con la mucosa no cáncer adyacente [3]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que resulten en esta expresión aberrante del gen p42.3 en GC es poco conocido, como se desprende de la falta de la literatura disponible. MiRNAs pueden regular la expresión génica mediante la focalización de los sitios de unión en los ARNm diana [27] y, en los cánceres humanos, muchos miRNAs ya han sido implicados. Sin embargo, la función de sólo unos pocos se ha entendido hasta la fecha, especialmente en GC [28].

En este informe, se seleccionaron miR-29a para una mayor investigación por un sistema de gen indicador y, finalmente, identificamos que p42. 3 era un gen diana directa de miR-29a. Nuestros datos sugieren que las cuatro bases de datos (TargetScan, microRNA.org, microcosmos Objetivos Versión 5 y Mirgen) utilizados fueron eficaces, pero no es perfecto, herramientas para la predicción de genes miARN objetivos y proporcionan evidencia experimental para mejoras en el algoritmo subyacente.

Hemos demostrado que la expresión p42.3 estaba inversamente relacionada con la expresión de miR-29a en cuatro líneas celulares GC. En tres de ellos, MKN-45, MGC-803 y AGS, esto fue evidente tanto en el nivel de ARNm y proteínas, pero este no era el caso en la línea celular SGC-7901. Además, la expresión de miR-29a No fue baja en las líneas de células MKN-28 y SNU-1. En conjunto, estas observaciones nos permitieron la hipótesis de que la función reguladora de miR-29a se complica en líneas celulares de GC y que el miR-29a pueden desempeñar diferentes funciones en diferentes contextos celulares. Sin embargo, los mecanismos detallados de las funciones de miR-29a en líneas celulares de GC requieren investigación adicional.

En nuestro estudio, la sobreexpresión de miR-29a podría inducir efectos similares a los conseguidos por el silenciamiento de p42.3 por p42.3 siRNA. Ambos de mRNA p42.3 y proteínas se downregulated después de las células fueron transfectadas con siRNA p42.3 o imita miR-29a y la proliferación celular y el ciclo celular fueron suprimidos cuando las células se sometieron a la misma interferencia. Se sugirió que el miR-29a pueden estar involucrados en la patogénesis de la GC a través de la represión de la expresión génica p42.3. Sin embargo, encontramos a partir de las curvas de crecimiento que el grado de represión por parte imita el miR-29a era mayor que de siRNA p42.3. En nuestra opinión, la principal razón para esto puede ser que los miRNAs específicos podrían regular cientos de genes para controlar la función celular. En el presente estudio, el miR-29a puede inhibir la proliferación celular, al menos en parte, por la orientación p42.3.

Nuestros datos muestran que aunque la tasa de alta expresión de miR-29a era del 55% (33 /60) en el GC, la expresión p42.3 fue baja en 21 de estos casos. Esto sugiere que el miR-29a puede tener un papel vital en los tejidos GC con bajos niveles de expresión de p42.3.

En el presente estudio, hemos validado que p42.3 es un objetivo directo de miR-29a. También hemos demostrado que el miR-29a puede inhibir la proliferación de células y bloquear el ciclo celular, al menos en parte, a través de la represión de la expresión p42.3 en GC. Concluimos que miR-29a puede jugar un papel crítico en la regulación de la expresión de p42.3 en GC. Curiosamente, se encontró que el gen p42.3 también podría regular la expresión de miR-29a (los datos no se muestran aquí), pero el mecanismo de regulación subyacente será explorado en el futuro.

Materiales y Métodos

Bioinformática

Cuatro enfoques computacionales eficientes que utilizan diferentes sistemas que evalúan [29] - [32] se utilizaron para la predicción de los miRNAs de regulación que se dirigen al gen p42.3, incluyendo TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), microcosmos Objetivos Versión 5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv /microcosmos /htdocs /blancos /v5 /) y Mirgen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Se seleccionaron objetivos para su posterior confirmación por parte del grupo de miRNAs que eran comunes a los resultados generados a partir de más de una búsqueda.

Las muestras de tejido

Sesenta pares de histopatológicamente confirmado GC y el tejido no canceroso adyacentes las muestras fueron obtenidas de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el hospital Renji afiliado a la Escuela de Medicina de la Universidad china de Shanghai Jiaotong entre julio de 2007 y enero de 2009. el cáncer no emparejado tejidos adyacentes se obtuvieron al menos 5 cm de distancia del sitio del tumor. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad Jiaotong de Shanghai y el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes, mientras que el consentimiento por escrito se obtuvo de cada paciente.

Líneas celulares y condiciones de cultivo

GC humana líneas celulares, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 y AGS, y la línea celular de epitelio GES-1 normales gástrico, que se adquirieron de ATCC (EE.UU.), se mantuvieron en RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células se cultivaron a 37 ° C en un 5% de CO _{2 incubadora. Una solución de tripsina (0,25%) se utilizó para separar las células del matraz de cultivo.}

Vector construcción

Para construir los vectores de expresión pri-miR-29a se amplificó primero con cebadores diseñados por software Primer Premier 5.0 (Tabla 3) y después se clonó en pcDNA3.1 (Invitrogen). Para producir los plásmidos que contenían el sitio de unión putativo de miR-29a, tanto de tipo salvaje y secuencias mutantes de la posición 111 a 380 de la p42.3-3'UTR se sintetizaron químicamente (Figura 1A) y después se clonaron a la corriente abajo del gen EGFP a Bam HI y
Eco RI
sitios en el vector pcDNA3 /EGFP (Saierbio, Tianjin, China).

ensayo de gen indicador

MKN-45 células se sembraron en pocillos por triplicado de una placa de 24 pocillos en el día antes de la transfección. PcDNA3.1 (+) /-miR-29a primaria fueron co-transfectadas con el tipo salvaje y mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR respectivamente. A continuación, 0,5 g de pcDNA3.1 (+) /primaria-miR-29a y se añadieron en cada uno de los pocillos 0,5 g de pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR, mientras que 0,1 g de vector pDsRed-C1 (Clontech ), que expresa la RFP, se añadieron a cada pocillo como una referencia endógena. Las células que sólo se transfectaron con pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR o pcDNA3 /EGFP /p42.3-3'UTR + pcDNA3.1 (+) se utilizaron como los controles. Las células se recogieron 48 h después de la transfección y se analizaron basan en la intensidad de la fluorescencia EGFP y RFP detectado utilizando espectrofotómetro de fluorescencia F-4500 (Hitachi, Japón).

Transfección de células

Transfección de MKN-45 las células se realizó utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. MKN-45 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos o placas de 96 pocillos a 30% de confluencia el día antes de la transfección. Imita (100 nm, GenePharma) e inhibidores (200 nm, RIBOBIO) de miR-29a se utilizaron para exógenamente arriba y regulan negativamente la expresión de miR-29a. Para silenciar la expresión génica p42.3, las células MKN-45 fueron transfectadas con siRNA contra p42.3 (SI-p42.3, 100 nm, GenePharma). El ARN de control (denominado como NC) era no homóloga a cualquier secuencia del genoma humano. Las secuencias de los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 4.

Real-time RT-PCR

ARN total se aisló usando el reactivo Trizol (Invitrogen) y se trató posteriormente con RNasa libre de DNasa I ( Fermentas, San Diego, CA, EE.UU.). El ARN total (500 ng) se transcribió de forma inversa usando el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara, Dalian, Japón). Las secuencias de los cebadores utilizados para amplificar p42.3 y GAPDH se muestran en la Tabla 3. Para analizar la expresión de la madurez de miR-29a, 2 g de ARN total fue sometido a transcripción inversa utilizando el miARN Q-PCR All-in-One Kit de detección (GeneCopoeia, Guangzhou, china). Quantitative PCR en tiempo real para maduro miR-29a y U6 se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el sistema de PCR en tiempo real ABI 7300 y cebadores específicos diseñados por GeneCopoeia, China. La expresión relativa de p42.3 y miR-29a se normalizó a una referencia endógena (GAPDH y U6 ARN nuclear pequeño respectivamente) y en relación con el control. Los resultados se presentaron como factor de cambio, calculado según el método 2 (-ΔΔCT) [33]; una proporción de expresión relativa de < 1,0 se consideró como baja, mientras que una proporción de > 1,0 se consideró como alta expresión [14]

Western Blot

La proteína total a partir de células y tejidos cultivados. fueron extraídos por RIPA buffer de lisis que contiene PMSF, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Beyotime, Shanghai, china). La concentración de proteína se midió utilizando el método de Bradford [34]. En general, 40 g de proteína se sometieron a electroforesis a través de 10% en geles de SDS poliacrilamida y luego se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). La membrana se incubó con el anticuerpo p42.3 (1:500, Abmart, China), el anticuerpo CHK2 (1:1,000, CST), anticuerpo cyclinB1 (1:1,000, CST) o GAPDH (1:5,000, Kang Chen, China) a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos secundarios fueron marcadas con HRP (Kang Chen, China) y las señales se detectaron utilizando el kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, EE.UU.). Posteriormente, las imágenes se analizaron mediante software ImageJ 1,43. La expresión de la proteína se normalizó a una referencia endógena (GAPDH) y en relación con el control. Un ratio de expresión relativa de < 1,0 se consideró como una expresión baja, mientras que una relación de > 1,0 se consideró como alta expresión [14]

La proliferación celular ensayo

cosechadas MKN-45 células. (aproximadamente 5 x 10 ^{4 células) se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos. La proliferación celular se midió a las 24 h, 48 h y 72 h después de la transfección, respectivamente, usando el Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La absorbancia a una longitud de onda de 450 nm, que muestra relación positiva a la capacidad de la proliferación celular, se determinó mediante un espectrofotómetro (E-LIZA MAT-3000).}

ciclo de la célula de ensayo

Cuarenta -ocho horas después de la transfección, se levantaron las células utilizando tripsina al 0,25% y se lavaron en DPBS (Gibco); que fueron fijadas en 70% de etanol a -20 ° C durante 24 h. Para el análisis de citometría de flujo (EPICS XL Beckman Coulter), se incubaron las células en ARNasa (Fermentas) a 37 ° C durante 30 min, se trató con PI (Sigma) y se suspendieron en 300 l DPBS.

El análisis estadístico

Los datos se muestran como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos separados. La significación se analizaron con la prueba t de Student y pruebas no paramétricas (prueba de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis H). La significación estadística de la correlación entre la expresión de 29a-MIR y p42.3 proteína se calculó mediante la prueba de chi-cuadrado y correlación de Spearman. El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 13.0 (IBM, EE.UU.) y se consideraron estadísticamente significativas a P Hotel <diferencias; 0.05.

• PLOS ONE: pérdida de la proteína de la leucemia promielocítica en el cáncer gástrico: Implicaciones para la IP-10 Expresión y linfocitos infiltrantes de tumores,
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