PLoS ONE: Rechtsvorschriften B-Zell-Funktion wird unterdrückt durch Rauchen und Fettleibigkeit in der H. pylori-infizierten Patienten und korreliert mit erhöhten Risiko von Magenkrebs

Abstrakt

Helicobacter pylori
Infektion tritt in mehr als die Hälfte der Bevölkerung der Welt und ist die Hauptursache für Magenkrebs. Eine Reihe von Lebens- und Ernährungsfaktoren, wie Rauchen und Fettleibigkeit, wurden gefunden, das Risiko für die Entwicklung von Krebs zu erhöhen. In dieser Studie haben wir versucht, die immunologischen Aspekte bei H
zu bestimmen. pylori
Infektion und Magenkrebs Entwicklung. Wir fanden heraus, dass B-Zellen von H
. pylori
infiziertem Patienten präsentiert veränderte Zusammensetzung und Funktion im Vergleich zu nicht-infizierten Patienten. IL-10-exprimierenden CD24 ^{+ CD38 + B-Zellen wurden in H
upregulated. pylori
infizierten Patienten enthalten starke regulatorische Aktivität in T-Zell-pro-inflammatorische Zytokin-Sekretion hemmen und reagiert direkt auf H
. pylori
Antigen-Stimulation. Interessanterweise wurde in H
. pylori
infizierten Rauchern und fettleibigen Personen, die Zahl der IL-10 + B-Zellen und CD24 + CD38 + B-Zellen wurden reduziert im Vergleich zu H
. pylori
infizierten asymptomatischen Probanden. Regulatorische Funktionen vermittelt durch CD24 + CD38 + B-Zellen wurden ebenfalls beeinträchtigt. Darüber hinaus hatte Magenkrebs positive Patienten IL-10-produzierenden B-Zellen-Frequenzen reduziert, nachdem H
. pylori
-Stimulation. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass in H
. pylori
-Infektion, CD24 + CD38 + B-Zellen hochreguliert und spielt eine Rolle pro-inflammatorischen Reaktionen bei der Unterdrückung, möglicherweise durch IL-10-Produktion, eine Eigenschaft, die nicht in das Rauchen beobachtet und adipösen Patienten}

Citation:. Li G, Wulan H, Song Z, Paik PA, Tsao ML, Goodman GM, et al. (2015) Regulatory B-Zell-Funktion wird durch Rauchen und Fettleibigkeit Unterdrückte in H
. pylori
infiziertem Themen und geht mit erhöhten Risiko von Magenkrebs korreliert. PLoS ONE 10 (7): e0134591. doi: 10.1371 /journal.pone.0134591

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

Empfangen: 3. Februar 2015; Akzeptiert: 13. Juli 2015; Veröffentlicht am: 30. Juli 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten innerhalb des Papiers sind

Finanzierung:.. die Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

konkurrierende Interessen:. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einleitung

Helicobacter pylori (H
. pylori)
eine Art von Gram-negativen pathogenen Bakterien in mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung gefunden ist und hemmt vorzugsweise die oberen Magen-Darm-Trakt, einschließlich Magenepithels und Duodenum-Darm-Trakt [1,2]. Obwohl die überwiegende Mehrheit (> 80%) der Infektionen asymptomatisch sind, werden 10-20% infizierten Patienten Magengeschwüre entwickeln, während 1-2% Magenkrebs erwerben wird [3]. Der genaue Mechanismus der Krebsentwicklung als Folge von H
. pylori
Infektion ist nicht gut definiert, aber chronische unbehandeltem Entzündungen im oberen Gastrointestinaltrakt wird angenommen, dass die anhaltende Schädigung des Epithels Magen [4,5] beizutragen. Insbesondere entzündungsbedingte Signalmoleküle, wie Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-a), wurden gefunden Magen tumorigenesis zu fördern, und wird in H
aufreguliert. pylori
Infektion [6]. Andere proinflammatorische Cytokine sezerniert durch T-Zellen, einschließlich IL-2, IL-17 und Interferon-gamma (IFN-g), werden ebenfalls in H
aufreguliert. pylori
Infektion und sind mit einem erhöhten Risiko von Magentumorgenese assoziiert [7-10]. Eine Reihe von anderen Faktoren ab, wie zum Beispiel kontinuierliche Exposition gegenüber Tabakrauchen und Übergewicht, sind positiv mit einer erhöhten Magenkrebsrisiko korreliert, obwohl der zugrunde liegende Mechanismus ist unklar [3.11].

Vor kurzem hat die Rolle der Toleranz- B-Zellen induziert wurde, in einer Reihe von Infektionskrankheiten und Autoimmunerkrankungen charakterisiert [12]. Bei Mäusen, CD1d ^{hiCD5 + B-Zellen gefunden wurden tolerogen Umgebung im Gewebe zu helfen, festzustellen und eine Rolle bei der Verhinderung von Autoimmun Induktion haben [13]. Beim Menschen CD19 + CD24 hiCD38 hallo B-Zellen haben ähnliche toleranzinduzierenden Rolle bei gesunden als auch HBV-infizierten Personen [14]; der Ausbruch einer Autoimmunerkrankung ist mit dem Verlust der regulatorischen Funktion in dieser Zell-Untergruppe B [15] korreliert. IL-10 ist ein pleiotroper immunregulatorischer Zytokin, das eine Reihe von Hemmung von pro-inflammatorischen Zytokinen fähig ist, einschließlich IL-2, IL-17, IFN-g und TNF-a, und die Antigen-präsentierende Kapazität gezeigt potently unterdrücken Antigen-präsentierende Zellen [16]. Zentral zu allen toleranzinduzierenden B Zell-Untergruppen, IL-10 Produktion ist eine Schwenkzellvermittelte Regulation bei der Unterdrückung von T-Zell-vermittelte Entzündung [12,17] an B. Die Rolle der B-Zell-vermittelte Regulation in H
. pylori
Infektion und nachfolgende Induktion von Magenkrebs wurde jedoch bisher nicht untersucht.}

In dieser Studie haben wir die B-Zell-Zusammensetzung und Zytokin-Expressionsprofil in H
analysiert . pylori
infiziertem Themen. Höhere Anteile von CD24 ^{+ CD38 + B-Zellen und reduziert Prozentsätze von naiven B-Zellen und ruhenden Gedächtnis-B-Zellen wurden in H
gefunden. pylor
i-infizierten Patienten. Die CD24 + CD38 + B-Zellen in H
. pylori-infizierten Patienten hatten
erhöhten Anteil der IL-10-Produktion und war pro-inflammatorische Zytokin-Expression unterdrückt, wenn co-kultiviert mit autologer T-Zellen. H
. pylori-s
timulated CD24 + CD38 + B-Zellen von H
. pylori
infizierten Patienten potent sezerniert IL-10. Interessanterweise H
. pylori-Infektion Rauchen
Themen und fettleibig subects hatte Ebenen der CD24 gesenkt + CD38 + B-Zellen. Darüber hinaus ist die CD24 + CD38 + regulatorischen B-Zellen in das Rauchen und übergewichtigen Probanden wurden gefunden Verlust der unterdrückende Funktion aufweisen, wenn sie co-kultiviert mit autologer T-Zellen und Konzentrationen von IL-10 reduziert stimulierte nach direkter H
. pylori
Stimulation. wurden weiter reduziert, aber auch beim Rauchen und adipösen Patienten, die später Magenkrebs entwickelt, verglichen die Frequenzen von IL-10-sezernierenden B-Zellen zu den Themen, die nicht Magenkrebs entwickelt hat. Insgesamt zeigten diese Daten, dass CD24 + CD38 + B-Zellen in upregulated wurden H
. pylori
infiziertem und hatte funktionell T-Zell-inflammatorische Zytokin-Produktion unterdrückt. Die CD24 + CD38 + B-Zellen in Rauchern und fettleibigen Patienten waren jedoch refraktär H
. pylori
-Stimulation, produziert weniger IL-10, und es fehlte ihnen unterdrückende Kapazität.}

Materialien und Methoden

Studienfächer

Primär peripheren Blutproben wurden erhalten von 55 H
. pylori
infiziertem ulkusfreien Patienten, von denen 15 primären Konsumenten von Tabakrauch und 15 Klasse-I-fettleibig (30 kg /m ^{2 < BMI < 35 kg /m 2 ) der Patienten, sowie 15 gesunden H
. pylori
-uninfected ulkusfreien Personen. Personen mit chronischer Exposition gegenüber Passivrauchen wurden von der Studie ausgeschlossen. Keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Alter, Geschlecht und frühere Infektion Geschichte zwischen den Studiengruppen wurden gefunden. Alle Probanden wurden für 5 Jahre für die Entwicklung von Krebs Status gefolgt. Alle Probanden waren nicht verwandten Individuen aus der Provinz Henan und seine Umgebung. Die Patienten wurden zwischen Januar 2008 und Dezember 2013 von The 155th Central Hospital von PLA in China rekrutiert. Die Kontrollen waren Krebs-freie Individuen zufällig aus einer Community-Krebs-Screening-Programm zur Früherkennung von Krebs in den gleichen Regionen die Patienten rekrutiert wurden im gleichen Zeitraum durchgeführt ausgewählt. Die Antwortquote für beide Kontrollen und Fälle betrug 95%. Die Auswahlkriterien für eine gesunde Kontrollen eingeschlossen Krebs-freie Individuen und Frequenzanpassung auf die Fälle nach Geschlecht und Alter (± 5 Jahre). Bei Einstellung wurde eine schriftliche Einverständniserklärung von jedem Subjekt und persönliche Daten wie Geschlecht, Alter, Gewicht, Größe und Tabakrauchen erhalten wurden durch einen Fragebogen gesammelt. Nicht alle Proben der Versuchspersonen wurden in allen Experimenten aufgrund unvollständiger Patienten-Compliance und eine unzureichende Zellen bei einigen Patienten verwendet. Diese Studie wurde von Institutional Review Board der 155. Central Hospital von PLA genehmigt wurde.}

Probenvorbereitung

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) aus peripheren Blutproben mit Standard-Ficoll-Hypaque Verfahren isoliert wurden und sofort bei -150 ° C bis zur Verwendung eingefroren oder in Experimenten sofort verwendet werden, wenn festgestellt. Regelmäßige Kulturmedium RPMI-1640 mit 10% fötalem Rinderserum, 5 ml 100 U Penicillin /0,1 mg /ml Streptomycin und 5 ml 2 mM L-Glutamin. Die Zellen wurden in 5% CO _{2 bei 37 ° C für den angegebenen Zeitraum.}

Zellisolierung

T- und B-Zellen wurden unter Verwendung von humanen T-Zell oder B-Zell-isoliert Negative Selection Kit (Stemcell, Vancouver, Kanada), folgende Protokolle vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Die Reinheiten von T und B-Zell-Isolationen waren mehr als 94% durch Durchflusszytometrie. Zur Abreicherung von CD24 ^{+ CD38 + B-Zellen in einigen Experimenten wurden gereinigte B-Zellen mit PE-anti-human CD24 gefärbt und APC anti-human CD38 für 30 min. Die Zellen wurden dann zu leben Zellsortierung und CD24 + CD38 + wurden die Zellen aufgebraucht gesendet. In der gesamten B-Zell-Einstellung wurden insgesamt B-Zellen geschickt, ohne dass die Antikörper zu leben Zellsortierung}

Durchflusszytometrie

Die folgenden anti-human wurden monoklonale Antikörper verwendet. IL-10, TNF- a (eBioscience, San Diego, CA, USA); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (BioLegend, San Diego, CA, USA); IFN-g (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); CD8 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Gereinigtes menschliches IgG (BioLegend, San Diego, CA, USA) wurde verwendet, Fc-Rezeptoren zu blockieren, wenn Populationen enthalten, B-Zellen-Färbung. Bei einigen Experimenten, Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA, Sigma), Ionomycin (Sigma, München, Deutschland) oder durch Hitze abgetöteten H
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(Sigma, München, Deutschland) wurden verwendet, um Zellen zu stimulieren. GolgiStop und GolgiPlug wurden 6 h vor der Zellernte für die intrazelluläre Färbung von IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a und IL-10 zugegeben. FlowJo wurde verwendet Zytometrie Analyse zu fließen.

Luminex-Assay

IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a und IL-10 von T-Zellen und B-Zellen wurden quantitativ gemessen durch Multiplex Luminex Assay folgenden vom Hersteller bereitgestellten Protokolle mit Modifikationen (EMD Millipore, Etobicoke, Kanada). Insgesamt 2x10 ^{5 T-Zellen und /oder B-Zellen wurden in jedem Well von 96-Well-Platte (Corning, Tewksbury, MA, USA) plattiert. Für B-Zell-Stimulation durch Hitze abgetötete H
. pylori
wurden zu den B-Zellen gegeben, die am Boden einer 96-Well Transwell-Platte (Corning, Tewksbury, MA) ausplattiert. Für T-Zell-Stimulation wurde der untere Teil der Transwell-Platte vorinkubiert mit anti-human-CD3 (Klon OKT3) über Nacht gewaschen, wonach gereinigt wurden T-Zellen in die Platte übertragen. Menschliche Zytokin Fänger-Antikörper-Kügelchen wurden in die obere Kammer des Transwell-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Zwölf Stunden später wurden die Perlen geerntet, gewaschen und lesen Sie nach dem Protokoll des Herstellers.}

Die statistische Analyse

D'Agostino und Pearson Omnibus Normalitätstest wurde verwendet, um zu prüfen, ob die Daten normal verteilt waren. Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde für die Vergleiche zwischen mehreren Gruppen verwendet, gefolgt von Dunn-Test. Student-t-Test wurde für Vergleiche zwischen zwei Gruppen. Wenn Datensätze wesentlich von Normalverteilung abweicht, wurden nichtparametrische Tests verwendet. Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung von Prism (GraphPad Software) durchgeführt. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± S.E.M gezeigt.

Ergebnisse

• PLoS ONE: HIF-1α Induziert multidrug resistance in Magenkarzinomzellen durch Induzierung MiR-27a
• PLoS ONE: ZIC1 Promoter Hypermethylation in Plasma-DNA ist ein potentieller Biomarker für Magenkrebs und Intraepitheliale Neoplasia