PLoS ONE: S100A6 Protein Negativt Regulerer CacyBP /SIP-medieret hæmning af mavekræft Cell Proliferation og Tumorigenesis

Abstrakt

Calcyclin-bindende protein (CacyBP /SIP), er identificeret på grundlag af dets evne til at interagere med S100-proteiner i en calcium-afhængig måde, blev tidligere fundet at inhibere proliferation og tumorigenese af gastriske cancerceller i vores laboratorium. Vigtigt er det, virkningerne af S100 proteiner på biologisk adfærd CacyBP /SIP i mavekræft fortsat uklare. Heri rapporterer vi konstruktionen af ​​eukaryote ekspressionsvektorer for vildtype CacyBP /SIP og en afkortet mutant mangler S100 proteinbindingsdomæne (CacyBP /SIPΔS100). Udtrykkene for vildtype og trunkerede rekombinante proteiner blev påvist ved transfektion af MKN45 gastrisk cancerceller. Co-immunopræcipitationsanalyser demonstrerede samspil mellem S100A6 og vildtype CacyBP /SIP i MKN45 celler. Fjernelse af S100 proteinbindingsdomæne drastisk reduceret affinitet CacyBP /SIP til S100 proteiner som angivet med reduceret co-immunoudfældning af S100A6 ved CacyBP /SIPΔS100. MTT assay, FACS analyse klonogene assay og tumor xenograft eksperiment blev udført for at vurdere effekten af ​​CacyBP /SIP på cellevækst og tumorigenese in vitro
in vivo
. Overekspression af CacyBP /SIP hæmmede spredning og tumorigenese af MKN45 gastrisk kræftceller; de spredning og tumorigenese satser blev yderligere reduceret ved ekspression af CacyBP /SIPΔS100. Vi viste ligeledes, at S100-proteiner negativt regulerer CacyBP /SIP-medieret hæmning af gastrisk cancer celleproliferation, gennem en effekt på β-catenin proteinekspression og transkriptionel aktivering af TCF /LEF. Selvom den underliggende virkningsmekanisme kræver yderligere undersøgelser, denne undersøgelse giver ny indsigt i samspillet mellem S100 proteiner og CacyBP /SIP, som kunne berige vores viden om S100 proteiner og være nyttigt for vores forståelse af udviklingen af ​​mavekræft.

Henvisning: Ning X, Sun S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y, et al. (2012) S100A6 Protein Negativt Regulerer CacyBP /SIP-medieret hæmning af mavekræft Cell Proliferation og tumorigenese. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10,1371 /journal.pone.0030185

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italien

Modtaget: Oktober 27, 2011; Accepteret: 15. december 2011; Udgivet: 25 januar, 2012 |

Copyright: © 2012 Ning et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Nature Science Foundation of China (nr 30.872.964, No. 30.772.461). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

S100 proteiner er den største undergruppe inden for EF-hand Ca ^{2 + -bindende protein familie og er kendetegnet ved deres celle- og vævsspecifikke ekspressionsmønstre. Disse proteiner er kendt for at regulere intracellulære processer, såsom cellecyklus overgang og cellulær vækst, differentiering og motilitet [1]. En unik egenskab ved disse proteiner er, at de enkelte medlemmer er lokaliseret i specifikke cellulære segmenter, hvorfra nogle er i stand til at flytte på Ca 2 + aktivering [2], [3]. Efter translokation, kan disse proteiner transducere Ca 2+ signal i en tidsmæssig og rumlig måde ved at interagere med forskellige S100 protein-specifikke mål. Interessant er de fleste S100 gener placeret i en genklynge på det humane kromosom 1q21, et sted med hyppige kromosomafvigelser [4]. Denne forening tyder på en sammenhæng mellem kromosomafvigelser og deregulering af S100 genekspression i forskellige tumorer. Indtil dato har mange medlemmer af S100 familie blevet identificeret til at være forbundet med tumor udvikling og metastase [5], [6]. Men de præcise roller og betydning af S100 proteiner i udvikling og fremme af kræft dårligt forstået. Forståelse af den biologiske funktion (er) af S100-proteiner vil afhænge af identifikation af S100 proteinmål. Hidtil flere mål mulige protein, herunder glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, annexin II, annexin VI, annexin XI, caldesmon og CacyBP /SIP, er blevet vist, at interagere med S100-proteiner in vitro
i en Ca 2 + -afhængig måde [5], [7].}

Calcyclin-bindende protein (CacyBP /SIP), et 30 kDa protein identificeret på grundlag af sin evne til at interagere med S100A6 i en Ca ^{2 + -afhængig måde i Ehrlich ascites tumor (EAT) celler [8], blev tidligere antaget i flere for lægemiddelresistens (MDR) -relateret molekyle i gastrisk cancer i vores laboratorium [9]. Gennem anvendelsen af ​​et monoklonalt antistof mod CacyBP /SIP [10], har vi vist, at overekspression af CacyBP /SIP inhiberer proliferation og tumorgenese af nyrecancerceller [11]. Yderligere studier har antydet, at CacyBP /SIP undertrykker væksten af ​​gastrisk cancer [12]. Trods disse fremskridt virkningerne af S100 proteiner på CacyBP /SIP i mavekræft fortsat uklare. Desuden blev CacyBP /SIP også at være en del af en ubiquitinering kompleks via binding Siah1 og Skp1 [13]. Og dette ligase blev beskrevet at regulere nedbrydningen af ​​ikke-phosphoryleret β-catenin [13].}

CacyBP /SIP kunne binde S100, Siah1 og Skp1 af forskellige regioner. Den N-terminale region (aa 1-80) af CacyBP /SIP er blevet vist at have affinitet for Siah1. Den C-terminale region af CacyBP /SIP (aa178-229) er kendt for at danne en α-helix; dette domæne kan interagere med S100 proteiner, herunder S100A6 [14]. Skp1 bindende domæne ikke overlapper med S100 bindende region og Skp1 binder sig til den midterste del (aa78-155) i CacyBP /SIP [15], [16]. At observere virkningerne af S100 proteiner på den biologiske adfærd CacyBP /SIP i gastrisk kræft, eukaryote ekspressionsvektorer for vildtype CacyBP /SIP og dens afkortet mutant mangler S100 proteinbindingsdomæne (CacyBP /SIPΔS100) lykkedes konstrueret og effektivt udtrykt i MKN45 celler. En MTT assay, FACS analyse klonogene assay og tumor xenograft eksperiment blev udført for at evaluere virkningerne af CacyBP /SIP på cellevækst og tumorigenese både in vitro
in vivo
. Resultaterne af disse undersøgelser kan bidrage til belysning af virkningerne af S100 proteiner på biologisk adfærd CacyBP /SIP i gastriske kræftceller.

Materialer og metoder

Cellelinjer og dyr

mavekræft cellelinje MKN45, som viste sig at være den laveste udtryk for CacyBP /SIP i vores tidligere undersøgelse [12], blev bevaret i vores laboratorium. Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) i en CO _{2 inkubator (Forma Scientic, Marjetta, OH, USA). BALB /c nøgne mus ved 4-6 ugers alderen blev leveret af Shanghai Cancer Institute for in vivo
tumorgenese undersøgelse. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i den fjerde Military Medical University (Permit Nummer: 11016). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alt for at minimere lidelse.}

Immunfluorescensfarvning

Cellerne blev udsået på rensede dækglas og fikseret med 95% alkohol i 20 min ved stue temperatur. Cellerne på dækglassene blev vasket med PBS og permeablized i 10 minutter med 0,5% Triton X-100 i PBS. Cellerne blev inkuberet med anti-S100A6 antistof (fortyndet 1:2000) efter blokering med 3% bovint serumalbumin i 1 time. Cellerne blev derefter inkuberet med FITC-konjugeret anti-muse-IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) og monteret på objektglas med en blanding af glycerol og polyvinylalkohol indeholdende DABCO (1,4- diazobicylo- [2,2 , 2,] - octan). Immunofluorescens blev analyseret med en MRC-1024 Laser Scanning Konfokal Imaging System (Bio-Rad).

Plasmidkonstruktion og celle transfektion

Oligonukleotidprimere der indeholder Eco
RI eller Eco
RV restriktionssite blev syntetiseret, henholdsvis for amplifikation af CDS-sekvensen af ​​CacyBP /SIP eller en C-terminal deletion (aa178-229) mutant af CacyBP /SIP (accessionsnr AF_314752). De to primere var: 5'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3 '(sense) og 5'gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3' (anti-sense); 5'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3 '(sense) og 5'ccgatatcacacaatataagaactgta 3' (anti-sense), hhv. PCR-betingelserne var: 5 min ved 94 ° i indledende denaturering, efterfulgt af 35 cykler af 45 sekunder ved 94 °, 45 sekunder ved 60 ° og 60 sekunder ved 72 °, med en endelig forlængelse på 10 minutter ved 72 °. Længderne af PCR-produkterne blev 687 bp for CDS, og 534 bp for C-terminal deletion. Hver PCR-produkt blev skåret med EcoR
I og EcoR
V begrænsning fordøjelse og klonet ind ligeledes fordøjet pFLAG-CMV. De nye vektorer blev navngivet pFLAG-CacyBP (vildtype) og pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Insert sekvenser blev bekræftet ved DNA-sekventering.

Cell transfektion blev udført med lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) som beskrevet af producenten. Kort beskrevet blev celler udpladet og dyrket til 70-90% konfluens uden antibiotika. De blev derefter transficeret med 1 ug pFLAG-CacyBP eller pFLAG-ΔS100. 24 timer efter transfektion blev G418 (350 mg /ml) tilsat til dyrkningsmediet til selektion af transficerede celler. Blandede kloner blev ekspanderet i yderligere 6 uger. Celler transficeret med tom vektor, pFLAG-CMV, blev anvendt som en negativ kontrol. Disse stabile cellelinier blev navngivet MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 og MKN45-pFLAG for vildtype, trunkerede og negative kontroltransfektanter henholdsvis.

Co-immunoprecipitation

MKN45 transfektanter var vasket i PBS, høstet og lyseret på is i en buffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 8 mM MgCb _{2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA og 1% Nonidet P-40. Ekstrakterne blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 25 min ved 37 ° i en mikrocentrifuge. Supernatanterne blev anvendt til en immunpræcipitationsassay efter tilsætning af proteaseinhibitorer (10 mg /l leupeptin, 5 mg /l aprotinin, 20 mg /l sojabønnetrypsininhibitor, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid) og kvantificeret ved Bradford-metoden. Supernatanterne blev inkuberet med 30 pi protein A /G-Sepharose og 1 ug ubeslægtet antistof i 1-3 timer ved 37 ° (præ-clearance). De ubundne fraktioner blev derefter inkuberet med serum indeholdende antistoffer mod CacyBP /SIP i 1,5 timer ved 4 °. Blandingen blev derefter inkuberet med yderligere protein A /G-Sepharose natten over ved 4 °. Harpiksen blev derefter vasket tre gange i en buffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5) og 150 mM NaCl, to gange i en buffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5) og 500 mM NaCl, og endelig i 20 mM Tris HCI ved pH 7,5. Alle de buffere, som blev anvendt, blev suppleret med proteaseinhibitorer. Harpiksen og bundne proteiner blev solubiliseret i en SDS-prøvebuffer, kogt i 5 minutter ved 98 °, og påført på en SDS polyacrylamidgel. Ekspressionen af ​​S100A6 blev analyseret ved Western blotting med antistof mod S100A6.}

Western blot-

Cellerne blev opsamlet og lyseret på is i en buffer indeholdende [50 mmol /L Tris-CI (pH 7,5), 150 mmol /l NaCl, 0,2 mmol /l EDTA, 1 mmol /l PMSF og 1% NP 40], og derefter kvantificeret ved Bradford-metoden. Et mål for 100 ug lysater blev elektroforesebehandlet i 10% SDS-PAGE og blottet på en nitrocellulosemembran. Membranerne blev blokeret med 10% fedtfri mælk ved stuetemperatur i 2 timer og inkuberet med anti-CacyBP (1:1500) og anti-β-actin-antistof (Sigma, 1:5000) ved 4 ° natten over. Efter tre vaske i 15 minutter hver i TBS suppleret med 0,1% Tween 20 (TBST) blev membranen inkuberet med peroxidase-konjugeret gede-anti-muse /kanin-IgG-antistof (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, Kina) i 2 timer ved stue temperatur. Forøget kemiluminescens (Amersham, Freiburg, Tyskland) blev anvendt til detektion.

Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay

Celler blev podet på en plade med 96 brønde ved 2,5 x 10 ^{3 celler /brønd i RPMI 1640-medier indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum. Hver prøve havde tre replikater. Mediet blev udskiftet efter 2 dages intervaller, i 6 dage. Cellerne blev inkuberet med 50 pi 0,2% MTT i 4 timer ved 37 ° i en CO 5% _{2 atmosfære. Efter MTT inkubering blev en 150 pi portion af 100% DMSO sat til hver kultur for at opløse krystallerne. Levedygtige celler blev talt hver dag ved aflæsning af absorbansen ved 490 nm under anvendelse af en 96-pladelæser, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA).}}

Cellecyklusanalyse

Subkonfluente celler blev vasket med iskold PBS, suspenderet i 0,5 ml ethanol og derefter holdt ved 4 ° C i 30 minutter. Suspensionen blev filtreret gennem en 50-um nylonnet, og DNA-indholdet af farvede kerner blev analyseret med et flowcytometer (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). Cellecyklussen profil blev analyseret under anvendelse Multicycle-DNA Cell Cycle Analyseret Software. De proliferative indeks (PI) blev beregnet som følger:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)

Klonogen assay

For at måle spredning på en enkelt celle in vitro
, plade klonogene og bløde agar klonogene assays blev udført [17]. For pladen klonogene assay blev 1 × 10 ^{3-celler podet i en 9-cm skål og dyrket i RPMI 1640 medium i to uger for at tillade kolonidannelse. Kolonierne blev fikseret i 70% ethanol, farvet med Giemsa-opløsning og talt. For blød agar klonogene assay blev cellerne løsrevet og udpladet i 0,3% agarose med en 0,5% agarose underlag (1 × 10 3 /brønd i en plade med 24 brønde). Antallet af foci > 100 um blev talt efter 20 dage}

Tumorvækst i nøgne mus Salg

logaritmisk voksende celler (1 x 10 ^{7-celler) blev trypsinbehandlet, resuspenderet i 0.1. ml D'Hanks opløsning, og injiceres ind i halsen hypodermia af hver athymiske nøgne mus. Musene blev derefter overvåget for tumorvolumen, generelle sundhed, og samlede kropsvægt. Størrelsen af ​​den subkutane tumor masse blev målt ved skydelære i fem uger. Tumor volumen blev beregnet efter formlen: 0,5 × længde × bredde 2. Hver forsøgsgruppe bestod af fem mus.}

reportergenassay

For at analysere effekten af ​​CacyBP /SIP og CacyBP /SIPΔS100 om den transkriptionelle aktivitet af Tcf /LEF, reportergenanalysen blev udført som beskrevet [18]. Kort fortalt celler i en 24-brønds plade (50.000 celler pr brønd) blev co-transficeret med eller uden pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 og reporterplasmidet, pTOPFLASH indeholdende vildtype Tcf /LEF bindingssteder hjælp Lipofectamine 2000; pRL-TK Renilla
luciferase reporter tjente som en kontrol for transfektion effektivitet. Luciferaseaktiviteten blev målt og kvantificeret i et luminometer ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Southampton, UK). Eksperimenter blev udført tre gange og gentages to gange. Resultater er udtrykt som gennemsnittet af forholdet mellem den ildflueluciferaseaktivitet, og renilla luciferaseaktivitet.

Statistisk analyse

Alle data blev analyseret under anvendelse af SPSS statistisk programpakke (SPSS, Inc., Chicago, Illinois), og P
< 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Betydningen af ​​forskellen i frekvensen af ​​CacyBP /SIP-positiv farvning mellem tilstødende tumorprøver og tumorer blev analyseret ved chi-square test. Studerendes t
test og envejs variansanalyse efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligning tests blev anvendt til analyse af andre data.

Resultater

Endogen udtryk for S100A6 i gastrisk kræft cellelinje MKN45

S100A6 blev valgt som en model til at observere effekten af ​​S100 proteiner på den biologiske funktion af CacyBP /SIP. Den endogene ekspression af S100A6 i gastrisk cancercellelinie MKN45 blev først påvist ved western blot og immunfluorescensfarvning. Som vist i fig. 1A, blev S100A6 udtrykt i MKN45 celler. Immunofluorescens farvning indikerer, at S100A6 primært var fordelt i den nukleare membran med meget lidt findes i den nukleare plasma af MKN45 celler (Fig. 1B).

Interaktion af S100A6 og CacyBP /SIP i gastriske kræftceller MKN45

i en tidligere rapport, CacyBP /SIP, som blev udtrykt på et relativt lavt niveau i MKN45 celler, blev i vid udstrækning udtryk i flere forskellige typer af gastrisk kræft cellelinjer [12]. For at vurdere interaktionen mellem S100A6 og CacyBP /SIP, vildtype og mutant (aa178-229) CacyBP /SIP cDNA'er blev klonet ind i pFLAG-CMV vektor og stabilt transficeret ind MKN45 celler. Vi vurderede ekspressionen af ​​CacyBP /SIP i disse stabile cellelinier ved Western blot. Som vist i fig. 2A, blev FLAG-mærket CacyBP /SIP påvist i vildtype og mutant CacyBP /SIP transfektanter med anti-Flag-antistof, medens intet signal blev fundet i celler transficeret med tom vektor.

Samspillet mellem S100A6 og CacyBP /SIP i transfektant MKN45 celler blev derefter bedømt ved co-immunoudfældning. Efter inkubation med anti-CacyBP antistof, blev immunopræcipitat detekteret ved S100A6 antistof. Som vist i fig. 2B, en vekselvirkning mellem S100A6 og vildtype CacyBP /SIP blev observeret i MKN45-CacyBP cellelysater; imidlertid mutant CacyBP /SIP som blev afkortet fra aa178-229 region, producerede lidt signal i co-immunopræcipitering assay. Derfor blev den afkortede mutant CacyBP /SIP opkaldt CacyBP /SIPΔS100 og giver et nyttigt værktøj til undersøgelse af virkningerne af S100A6 på det biologiske adfærd CacyBP /SIP i gastriske kræftceller.

Effekter af S100A6 på celleproliferation fremkaldt af CacyBP /SIP i gastrisk cancer cellelinje MKN45 in vitro

MTT og FACS analyser blev udført for at undersøge effekten af ​​S100A6 på celleproliferation induceret af CacyBP /SIP i MKN45 celler in vitro
. Sammenlignet med tom vektor transfektanter, MKN45-pFLAG, både vildtype og CacyBP /SIPΔS100 transfektanter viste signifikant reduceret satser celleproliferation med MTT-assayet ( P
< 0,05) (. Figur 3A). Men CacyBP /SIPΔS100 transfektanter udviste en signifikant mere reduceret vækstrate sammenlignet med vildtype-CacyBP /SIP-transfektanter ( P
< 0,05).

Resultatet af cellecyklus analyse ved FACS ligeledes indikerer, at overekspression af enten vildtype eller mutant CacyBP /SIP reducerer MKN45 proliferation. Men den gennemsnitlige proliferative indeks (PI) af MKN45-ΔS100 celler (0,19 ± 0,03) var lavere end for MKN45-CacyBP celler (0,29 ± 0,02) ( P
< 0,05) (. Fig 3B) . Tilsammen disse data stærkt indikerer, at vildtype CacyBP /SIP hæmmer spredning af MKN45 celler, mens CacyBP /SIPΔS100 intensiverer denne hæmning af spredning.

Effekter af S100A6 på tumorigenese fremkaldt af CacyBP /SIP i MKN45 mavekræft cellelinje in vitro
in vivo

Anchorage-uafhængig vækst er en vigtig egenskab ved in vitro
tumorvækst. Derfor har vi undersøgt, om opregulering af CacyBP /SIP udtryk hæmmede MKN45 cellevækst i medier og blød agar. Som vist i fig. 4A og B, CacyBP /SIP-ekspression resulterede i en markant reduktion af MKN45 cellevækst i en koloni-dannelse assay med en gennemsnitlig reduktion på 32,1% i medium og 62,0% i blød agar ( P
< 0,05) . Men transfektion af CacyBP /SIPΔS100 resulterede i en endnu større fald i vækst med et gennemsnitligt fald i raterne på 84,2% i medium og 82,8% i blød agar ( P
< 0,01).

for at bekræfte denne effekt in vivo
, vi subkutant injiceret MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 og MKN45-pFLAG celler i til halsen hypodermia af nøgne mus. Efter tre uger var den gennemsnitlige tumorvolumen i hver gruppe var signifikant forskellig fra de andre. Ved 5 ^{th uge, den gennemsnitlige tumorvolumen i MKN45-pFLAG gruppen var 776.9 ± 90,9 mm 3, hvilket er betydeligt mere end den MKN45-CacyBP gruppe (578,9 ± 51,2 mm 3 ) ( P
< 0,05), og endnu mere end den MKN45-ΔS100 gruppe (364.9 ± 71,9 mm 3) ( P
< 0,05) (fig. 4C).}

effekter af S100A6 på CayBP /SIP-medieret β catenin nedbrydning

Som en del af ubiquitinligase kompleks, er CacyBP /SIP involveret i nedbrydningen af ​​phosphoryleret β catenin via bindende Skp1 og Siah1. Så blev opdaget udtryk for β catenin til indirekte at vurdere indflydelsen af ​​S100 på Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase. For det første viste co-immunopræcipitationsassay at afkortet mutant CacyBP /SIP binder både Skp1 og Siah1 (fig. 5A), hvilket tyder på S100A6 påvirkede ikke dannelsen af ​​Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase kompleks. For det andet er β- catenin protein i MKN45-ΔS100 celler faldt betydeligt, sammenlignet med MKN45-CacyBP celler, medens uden ændring forekom i mRNA (fig. 5B). Hertil kommer, fordi β-catenin er påkrævet som en cofaktor for aktivering af transkriptionsfaktoren, Tcf /LEF bestemte vi effekten af ​​CayBP /SIPΔS100 på Tcf /LEF-aktivitet under anvendelse af transient transfektion reportergenassays. Ekspression af CacyBP /SIPΔS100 resulterede i lavere Tcf /LEF aktivitet end vildtype CacyBP /SIP (fig. 5C). MG132, hæmmer af proteasom, kunne eliminere effekten af ​​både vildtype CacyBP /SIP og CacyBP /SIPΔS100 om Tcf /LEF-aktivitet. Tilsammen har vi udledes, at S100A6 kan påvirke CayBP /SIP medieret β catenin nedbrydning via interaktion med CayBP /SIP.

Diskussion

S100 familie proteiner har fået interesse på grund af deres forskellig ekspression i tumor væv og deres involvering i kræft progression og metastase [19] - [22]. S100 proteiner interagerer med nogle mål proteiner i calcium-afhængig eller calcium-uafhængig måde og yderligere at regulere funktionen af ​​disse mål [5], [23]. CacyBP /SIP er et nyt mål protein, der kan interagere med S100 proteiner, herunder S100A6, S100A1, S100B, og S100P, men ikke til S100A4, calbindin D, parvalbumin eller calmodulin [8], [16]. Tidligere værker i vores laboratorium viste, at overekspression af CacyBP /SIP kunne hæmme proliferation og tumorigenese af mavekræft og renalcellecarcinom [11], [12]. Trods disse fremskridt virkningerne af S100 proteiner på CacyBP /SIP mangler at blive undersøgt.

For at belyse reguleringen af ​​S100 proteiner på CacyBP /SIP-funktion, vi bygget den afkortede CacyBP /SIP mutant uden S100 protein bindende domæne , således at mutantprotein kunne ikke interagere S100-proteiner og bevarer evnen til at interagere med Siah1 og Skp1. I denne undersøgelse blev eukaryote ekspressionsvektorer for vildtype CacyBP /SIP og dens trunkerede mutante effektivt udtrykkes i MKN45 celler. Co-immunpræcipitering viste en interaktion mellem S100A6 og vildtype CacyBP /SIP i MKN45 celler. Viste imidlertid, CacyBP /SIPΔS100 lille signal ved co-immunopræcipitationsassay, hvilket indikerer en svag eller ingen interaktion med S100A6. MTT-assay, FACS assay klonogene assay og tumor xenograft eksperiment i nøgne mus blev udført for at teste virkningen af ​​vilde og mutant CacyBP /SIP på cellevækst og tumorigenese både in vitro
in vitro
. Disse forsøg viste, at overekspression af CacyBP /SIP kunne hæmme proliferation og tumorigenese af MKN45 gastrisk kræftceller. Vigtigt er det, celler transficeret med CacyBP /SIPΔS100 udviste mere intens virkning i forhold til vildtype-transfektanter, hvilket tyder på, at S100-proteiner negativt kunne regulere inhibering af celleproliferation induceret af CacyBP /SIP i gastriske cancerceller.

Mekanismen anvendes af S100A6 at modulere CacyBP /SIP-funktion kunne ligge i protein interaktioner og funktioner. CacyBP /SIP er identificeret til at være involveret i ubiquitinering og nedbrydning af β-catenin [24] - [28]. β- catenin viste sig at være overudtrykt eller aktiveret i prolifererende celler og i mange tumorer [29] - [31]. Fukushima et al. [32] fandt, at CacyBP /SIP knockout celler viser svækket (catenin nedbrydning og en defekt G1 cellecyklus checkpoint, hvilket indikerer, at β-catenin nedbrydningsvej medieret af CacyBP /SIP definerer et væsentligt checkpoint for thymocytudvikling og cellecyklusprogression. Vores tidligere undersøgelser viste også, at CacyBP /SIP inhiberer vækst og proliferation af gastriske cancerceller dels via nedbrydning af β-catenin. Hvorvidt S100 regulerer CacyBP /SIP-medieret ubiquitinligase bevarer ukendt. Akkumulerende beviser viste, at adskillige medlemmer af S100 proteinfamilien kunne regulere aktiveringen af ​​deres målproteiner [33], [34]. En nyligt opdaget gær homolog af CacyBP /SIP, Sgt1, ikke kun interagerer med S100-proteiner i calcium reguleret-måde, men også forbinder med Skp1 til dannelse Skp1 /cullin1 /F -.. box ubiquitin ligase kompleks [35] det har vist sig, at S100A6 kunne inhibere phosphoryleringen af ​​Sgt1 af caseinkinase II påvirke aktiviteten [36] i vores foreliggende forsøg identificerede vi også, at CacyBP /SIPΔS100 bevarer evnen til at associere med Skp1 og Siah1, hvilket tyder S100 molekyle muligvis ikke påvirke dannelsen af ​​Siah1 /Skp1 /CacyBP ubiquitin ligase kompleks. Alligevel β-catenin-protein uden en ændring af mRNA-niveauet i CacyBP /SIPΔS100 transficerede celler er markant lavere end vildtype transfektantcellerne. Den transkriptionelle aktivitet af TCF /LEF, et målgen af ​​β-catenin, faldt sammen med mutant CacyBP /SIP uden S100 binding, sammenlignet med vildtype CacyBP /SIP. Accoding til disse resultater, vi postulerer, at S100 protein negativt kunne regulere aktiviteten af ​​Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubiquitinligase ved interaktion med CacyBP /SIP. Så blokerer kombinationen af ​​S100 og CacyBP /SIP kunne fremme β-catenin-nedbrydning, resultere i inhibering af proliferation af cancerceller. Denne spekulation kan delvist støttet af Lee et al, at mængden af ​​β-catenin i celler med formindsket niveau af S100A6 reduceres [26]. Resultaterne er i overensstemmelse med data om opregulering af S100 proteiner og mangelfuld nedbrydning af β catenin i tumor og prolifererende celler [37]. Desuden blev CacyBP /SIP vist at interagere med tubulin og ERK1 /2 og spille vigtig rolle i omlejringer af cytoskelettet, celledifferentiering eller degeneration [38] -. [42]

Konklusioner

S100A6 protein regulerer negativt CacyBP /SIP-medieret hæmning af mavekræft celleproliferation, dels gennem effekt på β-catenin nedbrydning og transkriptionel aktivering af Tcf /LEF. Men de underliggende mekanismer for regulering af S100A6 på protein ubiquitinering og andre funktioner via CacyBP /SIP-afhængige vej kræver yderligere undersøgelser.

• PLoS ONE: Aktivering Transskription Factor 4 giver en multiresistens Fænotype til Gastric Cancer Cells gennem Transaktivering af SIRT1 Expression
• PLoS ONE: polymorfier og en haplotype i Heparanase Gene Foreninger med Progression og prognosen for mavekræft i en nordlige kinesiske befolkning