Ploche ONE: S100A6 Proteín Negatívne Reguluje CacyBP /SIP-sprostredkovanú inhibíciu žalúdočné rakoviny množenia sa a Tumorigenesis

abstraktné

Calcyclin viažuci proteín (CacyBP /SIP), ktoré možno identifikovať na základe svojej schopnosti interagovať s S100 proteíny spôsobom vápnika závislé, bol už skôr zistené, že inhibuje proliferáciu a tumorigeneze z buniek karcinómu žalúdka v našom laboratóriu. Dôležité je, že účinky S100 proteíny na biologické správanie CacyBP /SIP u karcinómu žalúdka zostávajú nejasné. Na tomto mieste sme sa hlási výstavbu eukaryotických expresných vektorov pre divokého typu CacyBP /SIP a skrátený mutant nemajú S100 proteín viažuci doménu (CacyBP /SIPΔS100). Vyjadrenie divokého typu a skrátených rekombinantné proteíny boli demonštrované transfekcia MKN45 karcinómu žalúdka buniek. Koimunoprecipitačními testy preukázali interakcie medzi S100A6 a divokého typu CacyBP /SIP v MKN45 bunkách. Odstránenie väzbovú doménu proteínu S100 výrazne znížiť afinitu CacyBP /SIP pre S100 proteíny, ako je indikované zníženou ko-imunoprecipitáciou S100A6 podľa CacyBP /SIPΔS100. MTT test, FACS test, klonogenní test a tumor xenografe experiment bol vykonaný na zhodnotenie účinku na CacyBP /SIP na rast buniek a vzniku nádorov in vitro stroje a in vivo
. Nadmerná expresia CacyBP /SIP inhibuje proliferáciu a tumorigeneze a MKN45 karcinómu žalúdka buniek; Rýchlosti proliferácie a vzniku nádorov boli ešte ďalej znížené o vyjadrenie CacyBP /SIPΔS100. Tiež sme ukázali, že S100 proteíny negatívne regulujú CacyBP /SIP-sprostredkovanú inhibíciu žalúdočné proliferácie rakovinových buniek, a to prostredníctvom účinku na expresiu β-katenin proteínu a transkripčný aktiváciu TCF /LEF. Hoci mechanizmus účinku vyžaduje ďalší výskum, táto štúdia poskytuje nový pohľad na interakciu medzi S100 proteínov a CacyBP /SIP, čo môže obohatiť naše vedomosti o S100 proteínov a byť užitočné pre naše chápanie vývoja rakoviny žalúdka.

Citácia: Ning X, Sun S, Zhang K, J Liang, chua Y, Li Y, et al. (2012) S100A6 Proteín Negatívne Reguluje CacyBP /SIP-sprostredkovanú inhibíciu žalúdočné rakoviny množenia sa a vzniku nádorov. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10,1371 /journal.pone.0030185

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatric Bambino Gesù, Taliansko

Prijaté: 27. októbra 2011; Prijaté: 15.decembra 2011; Uverejnené: 25.januára 2012

Copyright: © 2012 Ning a kol. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený dotácií z Národnej prírodnej Science Foundation Číny (No. 30872964, No. 30772461). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

S100 proteíny sú najväčšie podskupina v EF-hand Ca ^{2 + viažuci proteín rodiny a sú charakteristické svojou bunka-a tkanivovo špecifických expresných vzorov. Tieto proteíny sú známe pre reguláciu intracelulárnych procesov, ako je prechod bunkového cyklu a bunkový rast, diferenciáciu a pohyblivosti [1]. Unikátnou vlastnosťou týchto proteínov je, že jednotliví členovia sú lokalizované do špecifických buniek jednotiek, z ktorých niektoré sú schopné premiestniť na Ca 2+ aktivácia [2], [3]. Po premiestnení, tieto proteíny môžu prenášajú na Ca 2+ signál v časovej a priestorovej spôsobom interakcie s rôznymi cieľmi S100 proteín špecifické. Je zaujímavé, že väčšina génov S100 sú umiestnené v zhluku génu na chromozóme 1q21 človeka, miesto častých chromozómových abnormalít [4]. Táto asociácia naznačuje spojenie medzi chromozómových abnormalít a dereguláciu expresie génov S100 v rôznych nádorov. Až do dnešného dňa bolo identifikovaných mnoho členov rodiny S100, ktoré majú byť spojené s rozvojom nádoru a metastáz [5], [6]. Avšak, presné úlohy a význam S100 proteínov v rozvoji a podpore rakoviny sú zle pochopené. Pochopenie biologické funkcie (y) S100 proteínov závisí na identifikáciu proteínových cieľov S100. Až doteraz niekoľko možných cieľov proteín, vrátane glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy, annexin II, VI, annexin annexinu XI, caldesmon a CacyBP /SIP, bolo preukázané, že interagujú s proteínmi S100 in vitro v
Ca 2 + -dependentní spôsob [5], [7].}

Calcyclin viažuci proteín (CacyBP /SIP), 30 kDa proteín identifikovaný na základe jeho schopnosti interagovať s S100A6 v Ca ^{2 + -dependentní spôsob Ehrlich ascitu nádoru (EAT) bunky [8], sa predtým myslelo ako rezistencia viacerých drog (MDR) by preto molekuly rakoviny žalúdka v našom laboratóriu [9]. Prostredníctvom použitia monoklonálne protilátky proti CacyBP /SIP [10], sme ukázali, že nadmerná expresia CacyBP /SIP inhibuje proliferáciu a tumorgenesis renálnych rakovinových buniek [11]. Ďalšie štúdie naznačujú, že CacyBP /SIP potláča rast karcinómu žalúdka [12]. Cez tento pokrok, účinky S100 proteínov na CacyBP /SIP u karcinómu žalúdka zostávajú nejasné. Okrem toho bolo tiež zistené, CacyBP /SIP, že je zložkou ubikvitinace komplex väzbou Siah1 a Skp1 [13]. A to ligázu bola popísaná pre reguláciu degradáciu nefosforylovaným beta-kateninu [13].}

CacyBP /SIP by mohla viazať S100, Siah1 a Skp1 rôznymi regiónmi. Oblasť N-terminálnej (aa 1-80) z CacyBP /SIP bolo preukázané, že majú afinitu k Siah1. Oblasť C-terminálny CacyBP /SIP (aa178-229), je známe, že tvoria a-skrutkovici; táto doména môže interagovať s proteínmi S100, vrátane S100A6 [14]. Skp1 doména viažuci sa neprekrýva s väzbové oblasti S100 a Skp1 sa viaže ku strednému dielu (aa78-155) z CacyBP /SIP [15], [16]. Pozorovať účinky S100 proteínov v biologickom správaní CacyBP /SIP rakoviny žalúdka, eukaryotických expresných vektorov pre divokého typu CacyBP /SIP a jej skrátené mutanty nemajú S100 proteín viažuci doménu (CacyBP /SIPΔS100) boli úspešne skonštruované a efektívne vyjadril v MKN45 bunkách. Test MTT, FACS test, klonogenní test a tumor xenografe experiment bol vykonaný s cieľom vyhodnotiť účinky CacyBP /SIP na rast buniek a vzniku nádorov obaja in vitro stroje a in vivo
. Výsledky týchto štúdií môžu prispieť k objasneniu účinkov S100 proteíny na biologické správanie CacyBP /SIP v nádorových bunkách žalúdka.

Materiály a metódy

Bunkové línie a zvieratá

rakovina žalúdka bunková línia MKN45, čo bolo zistené, že najnižšia vyjadrenie CacyBP /SIP v našej predchádzajúcej štúdii [12], bol udržiavaný v našom laboratóriu. Bunky boli kultivované v médiu RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) doplnenom 10% tepelne inaktivovaným fetálnym teľacím sérom, penicilínom (100 U /ml) a streptomycínom (100 ug /ml) v CO _{2 inkubátora (Forma Scientic, Marjetta, OH, USA). BALBI /c nahých myší na 4-6 týždňoch veku boli poskytnuté v Šanghaji Cancer Institute pre in vivo
vzniku nádorov štúdie. Táto štúdia bola vykonaná v prísnom súlade s odporúčaniami uvedenými v Príručke pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat z National Institutes of Health. Protokol bol schválený Výborom pre etiku pokusov na zvieratách štvrtého Vojenskej lekárskej univerzity (Permit číslo: 11016). Všetky operácie sa vykonávajú v pentobarbitalu sodného anestézii, a bolo vynaložené maximálne úsilie, aby sa minimalizovalo utrpenie.}

Imunofluorescenčný farbenie

Bunky boli nanesené na vyčistené sklíčka a fixované 95% alkoholu počas 20 minút pri teplote miestnosti teplotu. Bunky na krycie sklíčka sa promyly PBS a permeabilizovány po dobu 10 minút s 0,5% Triton X-100 v PBS. Bunky boli inkubované s anti-S100A6 protilátky (zriedenej 1: 2000) po blokovanie 3% hovädzieho sérového albumínu po dobu 1 hodiny. Bunky potom boli inkubované s FITC-konjugovanou anti-myšou IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) a upevnené na sklíčka so zmesou glycerolu a polyvinylalkoholu obsahujúceho DABCO (1,4 diazobicylo- 2,2 [ , 2,] - oktán). Imunofluorescenčné bola analyzovaná s MRC-1024 laserová konfokálna Imaging System (Bio-Rad).

plazmidovej konštrukcie a bunková transfekcia

oligonukleotidové priméry, ktoré obsahujú Eco RI
alebo Eco RV
restrikčné miesto boli syntetizované, v danom poradí, pre amplifikáciu sekvencie CDS CacyBP /SIP, alebo C-koncové delécie (aa178-229) mutanty CacyBP /SIP (prístupové AF_314752). Tieto dva primery boli nasledujúce: 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (sense) a 5 'gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3 "(anti-sense); 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (sense) a 5 'ccgatatcacacaatataagaactgta 3 "(anti-sense), v danom poradí. Podmienky PCR boli nasledujúce: 5 minút pri teplote 94 ° C počas počiatočnej denaturácie, nasleduje 35 cyklov 45 sekúnd pri 94 ° C, 45 s pri 60 ° C a 60 s pri 72 ° C, s konečným predĺžením 10 min pri 72 ° C. Dĺžky Produkty PCR boli 687 bp pre CDS, a 534 bp pre odstránenie C-terminálny. Každý PCR produkt bol vystrihnutý pomocou ECOR
I a ECOR
štiepenie štiepenia V a klonovaný do podobne štiepeného pFLAG-CMV. Tieto nové vektory boli pomenované PFLAG-CacyBP (divokého typu) a PFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Sekvencia inzertu bola potvrdená sekvenovaním DNA.

Bunková transfekcia bola vykonaná s Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ako je popísané výrobcom. V stručnosti, bunky boli schovať a pestované do 70-90% zhlukovania bez antibiotík. Potom boli transfekovány 1 ug pFLAG-CacyBP alebo pFLAG-ΔS100. Po 24 h po transfekciu, G418 (350 mg /ml) bol pridaný do kultivačného média pre výber transfekciou buniek. Zmesné klony sa expandovali po dobu ďalších 6 týždňov. Bunky transfekované prázdnym vektorom, pFLAG-CMV, boli použité ako negatívna kontrola. Tieto stabilné bunkové línie boli nazvané MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 a MKN45-PFLAG pre divoký typ, skrátené a negatívnych kontrolných transfekciou buniek, v danom poradí.

Co-Imunoprecipitácia

MKN45 transfektanty boli premyté v PBS, izolované a lyžovanie na ľade v pufri obsahujúcom 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM MgCl _{2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA a 1% Nonidet P-40. Extrakty boli centrifugovány pri 12000 otáčkach za minútu po dobu 25 minút pri teplote 37 ° C v mikroodstredivke. Supernatanty boli použité k testu Imunoprecipitácia po pridaní inhibítorov proteázy (10 mg /l leupeptinu, 5 mg /l aprotinínu, 20 mg /l inhibítora sójového trypsínu, 1 mM fenylmethylsulfonyl fluorid) a kvantifikovaný metódou Bradford. Supernatanty boli inkubované s 30 ul proteín A /G-Sepharose a 1 ug netradičnej protilátkou po dobu 1-3 hodín pri 37 ° (pre-klírens). Nenaviazané frakcie boli potom inkubované s sérum obsahujúce protilátky proti CacyBP /SIP po dobu 1,5 hodiny pri teplote 4 ° C. Zmes potom bola inkubovaná s ďalším proteínom A /G-Sepharose cez noc pri 4 ° C. Živica sa potom premyje trikrát v pufri obsahujúcom 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) a 150 mM NaCl, dvakrát v pufri obsahujúcom 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) a 500 mM NaCl, a nakoniec sa v 20 mM Tris -HCl pri pH 7,5. Všetky vyrovnávacej pamäte, ktoré boli použité boli doplnené s inhibítormi proteázy. Živica a naviazané proteíny boli rozpustené vo vzorkovej pufri SDS, varí po dobu 5 min pri 98 ° C a aplikovaný na SDS polyakrylamidovom gélu. Expresia S100A6 bola analyzovaná metódou Western blot s protilátkou proti S100A6.}

Western blot

Bunky boli zbierané a lyžovanie na ľade v pufri obsahujúcom [50 mmol /l Tris-Cl (pH 7,5), 150 mmol /l NaCl, 0,2 mmol /l EDTA, 1 mmol /l PMSF a 1% NP 40], a potom kvantifikované metódou Bradford. Meradlom 100 ug lyzátu sa podrobí elektroforéze na 10% SDS-PAGE a prenesené na nitrocelulózové membránu. Membrány boli blokované 10% mliekom bez tuku pri izbovej teplote po dobu 2 h a inkubované s anti-CacyBP (1: 1500) a anti-beta-aktínu protilátky (Sigma, 1: 5000) pri teplote 4 ° C cez noc. Po troch premytí po dobu 15 minút každý v TBS s prídavkom 0,1% Tween 20 (TBST), bola membrána inkubovaná s peroxidáze konjugovaná kozia anti-myšou /králičie IgG protilátka (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, Čína) po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti teplotu. Rozšírené chemiluminiscencie (Amersham, Freiburg, Nemecko) bola použitá pre detekciu.

Metyl thiazolyl tetrazolium (MTT)

Bunky boli schovať na 96-jamkové doštičky pri 2,5 x 10 ^{3 buniek /jamka v RPMI 1640 s obsahom 10% tepelne inaktivované fetálne teľacie sérum. Každá vzorka mal tri opakovania. Sa médium nahradí v 2-denných intervaloch, po dobu 6 dní. Bunky boli inkubované s 50 ul 0,2% MTT po dobu 4 hodín pri teplote 37 ° C v 5% CO _{2 atmosfére. Po MTT inkubácii 150 ul alikvotná časť 100% dimetylsulfoxidu sa pridá ku každej kultúre, aby sa rozpustili kryštály. Životaschopné bunky sa počítali každý deň čítaním absorbancie pri 490 nm za použitia čítačky doštičiek 96-A, BP800 (DYNEX Technologies, Chantilly, VA).}}

bunkového cyklu analýza

Subkonfluentní bunky boli premyté ľadovo chladného PBS, suspenduje v 0,5 ml etanolu a potom sa udržiava na teplote 4 ° C počas 30 min. Výsledná suspenzia sa prefiltruje cez 50-um nylonovú sieťovinou, a obsah DNA zafarbených jadier bola analyzovaná pomocou prietokového cytometra (Epics XL, Coulter, Miami, FL). Profilu bunkového cyklu bola analyzovaná pomocou multicycle-DNA Cell Cycle analyzované softvér. Proliferatívne indexy (PI) boli vypočítané nasledujúcim spôsobom :. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)

Klonogenní test

Pre meranie rýchlosti proliferácie jedinej bunky in vitro
, boli vykonané doska klonogenní a mäkkom agare klonovacích testoch [17]. Pre dosky klonogenní testu, 1 x 10 ^{3 bunky boli vrúbľovať do 9 cm miske a kultivujú sa v médiu RPMI 1640 po dobu dvoch týždňov, aby pre tvorbu kolónií. Tieto kolónie boli fixované v 70% etanolu, zafarbené roztokom Giemsa a spočítané. Na mäkkom agare klonogenní testu boli bunky oddelené a umiestnené do 0,3% agarózy s 0,5% agarosovém podložku (1 x 10 3 /jamku v 24-jamkové doske). Počet ložísk > 100 um bola počítaná po 20 dňoch}

Rast nádoru u nahých myší

logaritmicky rastúcich buniek (1 x 10 ^{7 buniek) boli ošetrené trypsínom, resuspendované v 0,1. ml roztoku D'Hanks, a vpustí sa do krku hypodermia každého athymických nahých myší. Myši potom boli monitorované objemu nádoru, celkový zdravotný stav, a celkovej telesnej hmotnosti. Veľkosť podkožný hmoty nádoru bola meraná posuvným meradlom po dobu piatich týždňov. Objem nádoru bol vypočítaný podľa nasledujúceho vzorca: 0,5 x dĺžka x šírka 2. Každá experimentálna skupina sa skladala z piatich myší.}

Reporter gén test

Pre testovanie účinku CacyBP /SIP a CacyBP /SIPΔS100 na transkripčný aktivity TCF /LEF, bola vykonaná gén reporterového testu ako je popísané [18]. V stručnosti, bunky v 24-jamkové doštičky (50000 buniek na jamku) boli kotransfekovány s alebo bez pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 a reportérovým plazmidom, pTOPFLASH, obsahujúce divokého typu Tcf /Lef väzbové miesta s použitím Lipofectamine 2000; PRL-TK Renilla
luciferázy reportér slúžila ako kontrola účinnosti transfekcia. Aktivita luciferázy bola meraná a kvantifikovaná v luminometra pomocou Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Southampton, Veľká Británia). Experimenty boli vykonávané v triplikátech a bol dvakrát opakovaný. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota pomeru medzi svetlušky aktivitu luciferázy a Renilla luciferázy.

Štatistická analýza

Všetky dáta boli analyzované pomocou štatistického softvérového balíka SPSS (SPSS, Inc., chicago, Illinois), a P
menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Význam rozdielu frekvencie CacyBP /SIP-pozitívna farbenie medzi susednými vzorkami nádorov a nádorov boli analyzované pomocou testu chí-kvadrát. Študenta t
test a jednocestné analýzy rozptylu s následným viac porovnávacích testov Dunnettovým boli použité pre analýzu ďalších údajov.

Výsledky

endogénnej expresie S100A6 u karcinómu žalúdka bunková línia MKN45

S100A6 bola vybraná ako model pre pozorovať účinok S100 proteínov na biologickú funkciu CacyBP /SIP. Endogénnej expresie S100A6 v žalúdku bunková línia rakoviny MKN45 bol prvýkrát detekovaný westernovým prenosom a fluorescenčnou farbenie. Ako je znázornené na Obr. 1A, S100A6 bol exprimovaný v bunkách MKN45. Imunofluorescenčné farbenie ukazuje, že S100A6 bola rozdelená najmä v jadrovej membrány s veľmi málo nájsť v jadrovej plazme buniek MKN45 (Obr. 1B).

Interakcia S100A6 a CacyBP /SIP v nádorových bunkách žalúdku MKN45

v predchádzajúcej správe, CacyBP /SIP, ktorý bol exprimovaný na pomerne nízkej úrovni, v bunkách MKN45, bol široko exprimovaný v niekoľkých rôznych typov žalúdočné rakovinové bunkové línie [12]. Aby bolo možné zhodnotiť interakciu medzi S100A6 a CacyBP /SIP, divokého typu a mutantný (aa178-229) CacyBP /SIP cDNA boli klonované do vektora pFLAG-CMV a stabilne transfekované do buniek MKN45. Hodnotili sme expresiu CacyBP /SIP v týchto stabilných bunkových línií pomocou Western Blot. Ako je znázornené na Obr. 2A, FLAG značený CacyBP /SIP bola detekovaná v divokého typu a mutantných CacyBP /SIP transfektantů s protilátkou proti FLAG, zatiaľ čo žiadny signál bol nájdený v bunkách transfekciou prázdnym vektorom.

Interakcia medzi S100A6 a CacyBP /SIP v transfekcia MKN45 buniek bol potom vyhodnotený pomocou ko-Imunoprecipitácia. Po inkubácii s anti-CacyBP protilátky boli detekované pomocou Imunoprecipitát S100A6 protilátkou. Ako je znázornené na Obr. 2B, interakcia medzi S100A6 a divokého typu CacyBP /SIP bol pozorovaný v bunkových lyzátov MKN45-CacyBP; Avšak, mutant CacyBP /SIP, ktorý bol skrátený z aa178-229 oblasti, produkoval malú signál v teste koimunoprecipitačními. Preto je skrátený mutant CacyBP /SIP bol menovaný CacyBP /SIPΔS100 a poskytuje užitočný nástroj na skúmanie účinkov S100A6 na biologické správanie CacyBP /SIP v nádorových bunkách žalúdka.

Vplyv S100A6 na bunkovej proliferácii indukovaná CacyBP /SIP v žalúdočnej rakovina bunkové línie MKN45 in vitro

MTT a FACS testy boli vykonávané pre skúmanie účinkov S100A6 na proliferáciu buniek indukovanú CacyBP /SIP v bunkách MKN45 in vitro
. V porovnaní s prázdnych vektorové transfektanty, MKN45-pFLAG, ako divokého typu a /CacyBP SIPΔS100 transfektanty významne znížila ukázala mieru proliferácie buniek testom MTT ( P Hotel &0,05) (obr. 3A). Avšak, CacyBP /SIPΔS100 transfektanty vykazovali výrazne viac znížila tempo rastu v porovnaní s divokým typom CacyBP /SIP transfektantů ( P Hotel < 0,05).

Výsledky analýzy bunkového cyklu pomocou FACS rovnako tak ukazujú, že nadmerná expresia buď divoké alebo mutantný CacyBP /SIP znižuje MKN45 proliferáciu. Avšak priemerné proliferačnej indexy (PI) z MKN45-ΔS100 buniek (0,19 ± 0,03), bola nižšia ako u MKN45-CacyBP bunky (0,29 ± 0,02) ( P Hotel &0,05) (obr. 3B) , Dohromady tieto údaje silne naznačujú, že divoký typ CacyBP /SIP inhibuje proliferáciu buniek MKN45, zatiaľ čo CacyBP /SIPΔS100 zosilňuje túto inhibíciu proliferácie.

Vplyv S100A6 na vzniku nádorov vyvolané CacyBP /SIP v MKN45 karcinómu žalúdka bunkové línie in vitro stroje a in vivo

Anchorage nezávislý rast je dôležitou charakteristikou vitro
rastu nádoru u. Preto sme skúmali, či upregulace CacyBP /SIP prejavu inhibuje MKN45 rast buniek v médiách a mäkkom agare. Ako je znázornené na Obr. 4A a B, CacyBP /SIP expresie viedla k výraznému zníženiu rastu buniek MKN45 v teste tvorby kolónií, s priemernou zníženie 32,1% v médiu a 62,0% v mäkkom agare ( P Hotel &0,05) , Avšak, transfekcia CacyBP /SIPΔS100 za následok ešte väčší pokles rastu s priemerným poklesom sadzieb 84,2% v stredných a 82,8% v mäkkom agare ( P Hotel < 0,01).

pre potvrdenie tohto efektu in vivo
sme podkožnej injekcie MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 a MKN45-PFLAG buniek do krčnej hypodermia u nahých myší. Po troch týždňoch, priemerný objem nádoru v každej skupine bolo významne odlišné od ostatných. Na 5 ^{th týždeň, priemerný objem nádoru v skupine MKN45-PFLAG bola 776.9 ± 90,9 mm 3, čo je výrazne viac ako v skupine MKN45-CacyBP (578,9 ± 51,2 mm 3 ) ( P Hotel &0,05), a ešte viac, než u skupiny MKN45-ΔS100 (364,9 ± 71,9 mm 3), ( P Hotel &0,05) (obr. 4C).}

Vplyv S100A6 na CayBP /SIP-sprostredkované beta -catenin degradácie

Ako súčasť ubikvitin ligázu komplexu, CacyBP /SIP sa podieľa na odbúravaní nefosforylované β -catenin cez záväzné Skp1 a Siah1. Takže expresia beta -catenin bola detekovaná nepriamo posúdiť vplyv S100 na Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligázu. Po prvé, čo-Imunoprecipitácia test ukázal, že skrátený mutant CacyBP /SIP sa viažu ako Skp1 a Siah1 (obr. 5A), čo naznačuje, S100A6 neovplyvňuje tvorbu Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligázu komplexu. Po druhé, β- katenin proteín v MKN45-ΔS100 buniek sa významne znížil, v porovnaní s MKN45-CacyBP buniek, pričom sa žiadna zmena nastala v mRNA (obr. 5B). Okrem toho, pretože β-katenin sa vyžaduje ako kofaktor pre aktiváciu transkripčného faktoru, TCF /LEF sme zistili účinky CayBP /SIPΔS100 na TCF /LEF činnosti pomocou prechodné transfekcia testy reporterového génu. Vyjadrenie CacyBP /SIPΔS100 za následok nižšiu /LEF činnosti TCF než divokého typu CacyBP /SIP (obr. 5c). MG132, inhibítor proteazómu, mohla eliminovať vplyv ako divokého typu CacyBP /SIP a CacyBP /SIPΔS100 na TCF /LEF činnosti. Dohromady sme vyvodiť, že S100A6 môže mať vplyv na CayBP /SIP sprostredkované beta -catenin degradácie cez interakciu s CayBP /SIP.

Diskusia

S100 proteínov rodiny získali záujem, pretože ich rozdielna expresia v nádore tkanív a ich zapojenie do progresie rakoviny a metastáz [19] - [22]. S100 proteíny interagujú s niektorými cieľových proteínov na vápnik závislé alebo nezávislé na vápnika spôsobom a ďalej regulujú funkciu týchto cieľov [5], [23]. CacyBP /SIP je nový cieľový proteín, ktorý môže komunikovať s S100 proteíny, vrátane S100A6, S100A1, S100B a S100P, ale nie k S100A4, calbindin D, parvalbumin alebo kalmodulin [8], [16]. Predchádzajúci práce v našom laboratóriu ukázali, že nadmerná expresia CacyBP /SIP môže inhibovať proliferáciu a tumorigenezi žalúdočné rakoviny a karcinómu obličiek [11] [12]. Cez tento pokrok, účinky S100 proteínov na CacyBP /SIP ostáva vyšetriť.

Na objasnenie regulácia S100 proteínov na CacyBP funkciu /SIP, máme konštruovaná skrátený CacyBP /SIP mutanta bez S100 väzbovú doménu proteínu tak, že mutantný proteín nemôže interagovať S100 proteíny a ponecháva si schopnosť interakcie s a Siah1 Skp1. V tejto štúdii, eukaryotické expresné vektory pre divokého typu CacyBP /SIP a jeho skrátené mutanty boli účinne exprimovaný v bunkách MKN45. Ko-Imunoprecipitácia preukázali interakciu medzi S100A6 a divokého typu CacyBP /SIP v MKN45 bunkách. Avšak, CacyBP /SIPΔS100 ukázal malý signál testom ko-Imunoprecipitácia, čo naznačuje slabú alebo žiadnu interakciu s S100A6. MTT test, FACS test, test a klonogenní tumor xenografe experiment v nahých myšiach boli vykonané pre testovanie účinku divokého a mutantního CacyBP /SIP na rast buniek a vzniku nádorov ako in vitro stroje a in vitro
. Tieto experimenty ukazujú, že nadmerná expresia CacyBP /SIP môže inhibovať proliferáciu a tumorigeneze a MKN45 karcinómu žalúdka buniek. Dôležité je, že bunky transfekované CacyBP /SIPΔS100 vystavil intenzívnejšie účinky vo vzťahu k divokému typu transfektantů, čo naznačuje, že S100 proteíny by mohli negatívne regulujú inhibíciu bunkovej proliferácie indukovanej CacyBP /SIP v nádorových bunkách žalúdka.

mechanizmus použitý podľa S100A6 modulovať CacyBP /SIP funkcie by mohla spočívať v interakciách a funkcií proteínov. CacyBP /SIP je identifikovaný byť zapojený do ubikvitinaci a degradáciu beta-kateninu [24] - [28]. Bolo zistené, β- catenin byť nadmerne exprimované alebo aktivované v proliferujúcich bunkách a v mnohých nádorov [29] - [31]. Fukushima et al. [32] zistili, že CacyBP /SIP knockout bunky vykazujú zníženie hodnoty (-catenin degradácie a kontrolného bodu bunkového cyklu defektné G1, čo naznačuje, že β-katenin degradácie sprostredkovaná CacyBP /SIP definuje základné kontrolný bod pre vývoj thymocyte a progresie bunkového cyklu. Our predchádzajúce štúdie tiež ukázala, že CacyBP /SIP inhibuje rast a proliferáciu buniek karcinómu žalúdka čiastočne prostredníctvom degradácie p -catenin. Či už S100 reguluje CacyBP /SIP-sprostredkované ubiquitin ligázu zachováva neznámy. Kumulatívne dôkazy ukázali, že niekoľko členov rodiny proteínov S100 by mohla upravovať aktivácia ich cieľových proteínov [33], [34]. nedávno zistili, kvasinky homolog CacyBP /SIP, Sgt1 nielen interaguje s S100 proteíny v vápenatý regulovaným spôsobom, ale tiež spája s Skp1 tvoriť Skp1 /cullin1 /F - .. box ubiquitin ligázu komplexu [35] sa zistilo, že S100A6 môže inhibovať fosforyláciu Sgt1 podľa kaseinkinázy II ovplyvniť aktivitu [36] V našej súčasnej experimente sme tiež zistili, že CacyBP /SIPΔS100 zachovávajú schopnosť asociovať s Skp1 a Siah1, čo naznačuje, S100 molekuly nemusia mať vplyv na tvorbu Siah1 /Skp1 /CacyBP ubikvitin ligázu komplexu. Avšak, β-katenin proteín bez zmeny na úrovni mRNA v /SIPΔS100 transfekciou bunkách CacyBP je výrazne nižšia ako bunky divokého typu transfektantem. Transkripční aktivitu TCF /LEF, cieľového génu beta-kateninu, bola znížená v spojení s mutantný CacyBP /SIP, bez S100 väzby, v porovnaní s divokým CacyBP /SIP. Ručné podľa týchto výsledkov predpokladáme, že S100 proteín by mohol negatívne regulujú aktivitu Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubiquitin ligázu interakcií s CacyBP /SIP. Takže blokuje kombinácia S100 a CacyBP /SIP by mohli podporovať p -catenin degradácii, mať za následok inhibíciu proliferácie nádorových buniek. Tento špekulácie môže byť čiastočne podporená Lee et al, že v bunkách so zníženou úrovňou S100A6 množstvo beta -catenin sa znižuje [26]. Tieto výsledky sú v súlade s údajmi ohľadom up-regulácia S100 proteínov a nedostatočnou degradáciu beta -catenin v nádore a proliferujúce bunky [37]. Okrem toho, CacyBP /SIP bolo preukázané, že interagujú s tubulín a ERK1 /2 a hrajú dôležitú úlohu v preusporiadanie cytoskeletu, diferenciácie buniek alebo degenerácia [38] - [42].

Závery

S100A6 proteín negatívne reguluje CacyBP /SIP-sprostredkovanú inhibíciu žalúdočné proliferácie rakovinových buniek, čiastočne cez účinok na degradáciu β-katenin a transkripčný aktiváciu TCF /LEF. Avšak základné mechanizmy na reguláciu S100A6 o bielkovín ubikvitinace a ďalšie funkcie cez CacyBP /SIP závislé na dráhe vyžadujú ďalšie skúmanie.

• Ploche ONE: Aktivácia transkripčný faktor 4 priznáva multidrug odporu fenotyp do žalúdka nádorových buniek cez transaktivaci SIRT1 Expression
• PLoS ONE: polymorfizmy a haplotypu v heparanázy Gene asociácie s progresiou a prognózou rakoviny žalúdka v severnej čínskej populácie