PLoS ONE: S100A6 Baltymai Neigiamai Reguliuoja CacyBP /SIP slopinamos skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir Tumorigenesis

Anotacija

Calcyclin surišančio baltymo (CacyBP /TPP), nurodyti jo gebėjimą bendrauti su S100 baltymų kalcio priklausomu būdu pagrindu, anksčiau buvo nustatyta, kad slopina proliferaciją ir tumorigenezei skrandžio vėžinės ląstelės mūsų laboratorijoje. Svarbu, kad S100, baltymų biologinio elgesio CacyBP /SIP skrandžio vėžio poveikis lieka neaiški. Čia mes pranešti apie eukariotinių ekspresijos vektorių konstrukcija laukinio tipo CacyBP /SIP ir sutrumpintą mutantas trūksta S100 baltymų rišantis domenas (CacyBP /SIPΔS100). Laukinės-tipo ir su pertrūkiais, rekombinantinių baltymų išraiškos buvo įrodyta, transfekuojant MKN45 skrandžio vėžio ląsteles. Bendras Imunoprecipitacijos tyrimai parodė sąveiką S100A6 ir laukinio tipo CacyBP /TPP į MKN45 ląsteles. Išimti S100 baltymo surišimo domeną dramatiškai sumažino CacyBP /TPP dėl S100 baltymų trauka kaip nurodyta sumažinto bendrojo Imunoprecipitacijos iš S100A6 pagal CacyBP /SIPΔS100. MTT bandymas, FACS tyrimas, clonogenic analizė ir naviko svetimo eksperimentas buvo atliktas siekiant įvertinti CacyBP /SIP poveikį ląstelių augimui ir Tumorigenesis in vitro parsisiųsti ir vivo
. Padidėjusi CacyBP /SIP slopina proliferaciją ir tumorigenezei iš MKN45 skrandžio vėžio ląsteles; platinimo ir Tumorigenesis normos buvo dar labiau sumažintas iki CacyBP /SIPΔS100 išraiška. Mes taip pat parodė, kad S100 baltymai neigiamai reguliuoti CacyBP /SIP-tarpininkaujant slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, per apie β-kateninai baltymų ekspresijos ir transkripcijos aktyvavimo TCF /LEF poveikį. Nors pagrindinis veikimo mechanizmas reikalauja tolesnio tyrimo, šis tyrimas suteikia naują įžvalgų tarp S100 baltymų ir CacyBP /SIP sąveika, kuri gali praturtinti mūsų žinias apie S100 baltymų ir būti naudinga mūsų supratimą apie skrandžio vėžio vystymąsi.

nurodomoji dalis: Ning X Saulė S Zhang K Liang J Chuai Y Li Y et al., (2012) S100A6 Baltymai Neigiamai Reguliuoja CacyBP /TPP slopinamos skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir Tumorigenesis. PLoS vieną iš 7 (1): e30185. Doi: 10,1371 /journal.pone.0030185

redaktorius: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italija

Įstojo: Spalio 27, 2011; Priėmė: Gruodžio 15, 2011 m Paskelbta sausio 25 d 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Ning et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijas iš nacionalinio pobūdžio mokslo fondo Kinijos (Nr 30872964, Nr 30.772.461). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

S100 baltymai yra didžiausia pogrupis EF-vertus Ca ^{2 + -binding baltymų šeimos ir pasižymi savo somatinių ląstelių bei audinių specifinių išraiškos būdus. Šie baltymai yra žinoma, kad reguliuoti viduląstelinius procesus, tokius kaip ląstelių ciklo pereinamojo laikotarpio ir ląstelių augimą, diferenciaciją ir judrumo [1]. Unikalios šių baltymų yra tai, kad atskiri nariai lokalizuotas konkrečiose korinio skyrių, iš kurių kai kurie gali persikelti ant Ca 2 + aktyvavimo [2], [3]. Po perkėlimo, šie baltymai gali transduce Ca 2 + signalą į laiko ir erdvės prasme būdu bendrauja su įvairių S100 baltymų konkrečius tikslus. Įdomu tai, kad dauguma S100 genai įsikūręs genų klasterius žmogaus chromosomos 1q21, dažno chromosomų anomalijos svetainė [4]. Ši asociacija siūlo tarp chromosomų anomalijos bei S100 genų ekspresijos dereguliavimo įvairių navikų nuorodą. Iki dienos, buvo nustatyta, kad būti susijęs su auglių vystymuisi ir metastazių daug nariai S100 šeimos nariai [5], [6]. Tačiau tikslios vaidmenys ir svarba S100 baltymų plėtros ir skatinimo vėžio prastai suprantamos. Suprasti biologinės funkcijos (-ų) S100 baltymų bus priklausys nuo S100 baltymų tikslų identifikavimo. Iki šiol kelios galimos baltymų tikslai, įskaitant gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės, aneksino II aneksino VI, aneksino XI caldesmon ir CacyBP /SIP, buvo įrodyta, kad bendrauti su S100 baltymų in vitro
A ca 2 + -dependent būdas [5], [7].}

Calcyclin surišančio baltymo (CacyBP /TPP), 30 kDa baltymas nustatomas remiantis jos gebėjimas bendrauti su S100A6 į pagrindą ca ^{2 + -dependent būdas Ehrlich ascitas naviko (EAT) ląstelės [8], buvo manyta anksčiau kaip pasipriešinimas kelių narkotikų (MDR) padarė išvadą molekulės skrandžio vėžio mūsų laboratorijoje [9]. Per naudojimo monokloniniai antikūnai prieš CacyBP /SIP [10], mes parodėme, kad CacyBP /SIP raiškos slopina proliferaciją ir tumorgenesis inkstų vėžio ląstelių [11]. Daugiau tyrimas parodė, kad CacyBP /TPP slopina skrandžio vėžio [12] augimą. Nepaisant šios pažangos, iš S100 proteinais CacyBP poveikis /TPP skrandžio vėžio lieka neaiški. Be to, CacyBP /TPP taip pat buvo nustatyta, kad galėtų turėti ubiquitination komplekso komponentas per privalomas Siah1 ir Skp1 [13]. Ir tai ligazės buvo aprašyta reguliuoti ne fosforilinto beta-kateninai [13] degradaciją.}

CacyBP /TPP gali įpareigoti S100, Siah1 ir Skp1 skirtingų regionų. N-terminalas regionas (AA 1-80) iš CacyBP /TPP buvo įrodyta, kad turėti afinitetą Siah1. C-terminalo regionas CacyBP /SIP (aa178-229) yra žinoma, kad sudaro alfa-spiralę; Ši sritis gali sąveikauti su S100 baltymų, įskaitant S100A6 [14]. Skp1 rišantis domenas neuždengia su S100 privalomu regione ir Skp1 jungiasi prie vidurinės dalies (aa78-155) iš CacyBP /SIP [15], [16]. Norėdami laikytis S100 baltymų poveikį biologinės elgsenos CacyBP /SIP skrandžio vėžio, eukariotinių ekspresijos vektorių už laukinio tipo CacyBP /TPP ir jos nupjauto mutantas trūksta, kad S100 baltymų rišantis domenas (CacyBP /SIPΔS100) buvo sėkmingai konstruojamos ir efektyviai išreikšti į MKN45 ląsteles. MTT bandymas, FACS tyrimas, clonogenic analizė ir naviko svetimo eksperimentas buvo atliktas siekiant įvertinti CacyBP /SIP ląstelių augimą poveikį ir Tumorigenesis tiek in vitro, parsisiųsti ir vivo
. Šių tyrimų rezultatai gali prisidėti prie iš S100 baltymų poveikiu biologinei elgesio CacyBP /SIP skrandžio vėžio ląstelių ištyrimo.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linijų ir gyvūnai

skrandžio vėžio ląstelių linija MKN45, kuri buvo nustatyta, kad mažiausia išraišką CacyBP /SIP mūsų ankstesniame tyrime [12], buvo išsaugota mūsų laboratorijoje. Ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpė (GIBCO, Grand Island, NY, JAV), papildytoje su 10% šilumos-inaktyvuota vaisiaus serumas iš veršiuko, penicilino V (100 V /ml), ir streptomicino (100 mikrogramų /ml) A CO _{2 inkubatorius ( "Forma" Scientic, Marjetta, OH, JAV). Balb /c nuogas pelių 4-6 savaičių amžiaus teikė Šanchajaus vėžio instituto in vivo pervežimas Tumorigenesis tyrimas. Šis tyrimas buvo atliktas griežtai laikantis vadove rekomendacijas dėl priežiūros ir naudojimo laboratorinių gyvūnų iš Nacionalinių sveikatos institutų. Protokolas buvo patvirtintas dėl pranešimo apie gyvūnų eksperimentai ketvirtosios Karo medicinos universiteto etikos komiteto (leidimo numeris: 11016). Visi chirurgija buvo atlikta pagal natrio pentobarbitalio anestezijos ir viešbutyje dedamos visos pastangos buvo padaryta siekiant sumažinti kančias.}

imunofluorescenciniam

ląstelės buvo padengtas ant nuvalytų coverslips ir fiksuoto 95% alkoholio 20 min kambario temperatūra. Ląstelės ant coverslips buvo plaunamas PBS ir permeablized 10 min su 0,5% Triton X-100-PBS. Ląstelės buvo inkubuojami su anti-S100A6 antikūno (praskiestas 1:2000) po blokavimo su 3% galvijų serumo albumino 1 val. Po to ląstelės buvo inkubuojamos su FITC konjuguoto anti-pelės IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, JAV) ir sumontuotas ant stiklo skaidres su glicerolio ir polivinilo alkoholio, kurio sudėtyje yra (1,4-diazobicylo- [2,2 DABCO mišinio , 2,] - oktanas). Imunofluorescentinis buvo analizuojami su MRC-1024 Lazerinis skenavimas Confocal vaizdo sistema (Bio-Rad).

plazmidžių statybos ir ląstelių transfekcija

oligonukleidų pradmenys, kurių sudėtyje yra Eko
ri arba Eko
R. apribojimas svetainė susintetinti, atitinkamai, už amplifikacijos CDS seka CacyBP /SIP arba išbraukta (aa178-229) mutantas CacyBP /SIP C-terminalas (prisijungimas AF_314752). Du pradmenys buvo: 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3 "(jausmas) ir 5' gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3" (anti-jausmas); 5 "gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3" (jausmas) ir 5 'ccgatatcacacaatataagaactgta 3 "(anti-jausmas), atitinkamai. PGR sąlygos buvo: 5 min, esant 94 ° pradinės denatūruojant, po to 35 ciklų 45 sek 94 °, 45 s esant 60 °, ir 60 s esant 72 °, su paskutinį kartą pratęsti 10 min, esant 72 °. PGR produktų ilgiai buvo 687 bp CDS ir 534 bp Trynimo C-terminalas. Kiekvienas PGR produktas buvo akcizais apmokestinamų su EcoR
I ir EcoR
V apribojimas virškinimą ir klonuotas į tą patį išnykti pFLAG-CMV. Naujos vektoriai buvo pavadintas pFLAG-CacyBP (laukinio tipo) ir pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Įterpti sekos buvo patvirtinta DNR sekos.

Mobilusis transfekcija buvo atliktas su Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), kaip aprašyta gamintojo. Trumpai tariant, ląstelės buvo padengtas ir išaugo iki 70-90% santakoje be antibiotikų. Tada jie buvo pernešta su 1 mikrogramų pFLAG-CacyBP ar pFLAG-ΔS100. 24 h po transfekciją, G418 (350 mg /ml) buvo įtraukta į kultūros terpių transfekuotų ląstelių atrankos. Mišrios klonai buvo išplėstas dar 6 savaites. Ląstelės transfekuotos su tuščia vektorius, pFLAG-CMV, buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Šie stabilios ląstelių linijos buvo pavadintas MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 ir MKN45-pFLAG už laukinio tipo, nupjauto ir neigiamus kontrolinius transfectants, atitinkamai.

Bendras imunoprecipitacijos

MKN45 transfectants buvo plaunami PBS, surenkamos ir lizuojamos ant ledo buferiniame tirpale, kuriame yra 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mm MgCl _{2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, ir 1% Nonidet P-40. Ekstraktai centrifuguojamas 12000 rpm 25 min 37 ° temperatūroje mikrocentrifuga. Supernatantq buvo naudojamas už imunoprecipitaciją tyrimo po to, kai proteazės inhibitorių to (10 mg /l leupeptiną, 5 mg /l aprotininą, 20 mg /L sojų tripsino inhibitoriaus, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą) ir kiekybiškai pagal Bradfordo metodu. Supernatantq buvo inkubuojamos su 30 mikrol, baltymų A /G-Sepharose ir 1 mikrogramų nesusijusio antikūnų 1-3 h, esant 37 ° (iš anksto-klirenso). tada Nesusijungusio frakcijos buvo inkubuojamos su serumo, kurių sudėtyje yra antikūnų prieš CacyBP /SIP 1,5 h 4 ° temperatūroje. tada mišinys inkubuojamas su papildoma baltymas A /G-Sepharose per naktį 4 °. tada derva buvo plaunamos tris kartus buferiniame tirpale, kuriame yra 20 mM tris- HCl (pH 7,5) ir 150 mM NaCl, du kartus buferyje, kurio sudėtyje yra 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) ir 500 mM NaCl, ir pagaliau 20 mM Tris -HCl esant pH 7,5. Visi iš buferių, kurie buvo naudojami buvo papildytas su proteazės inhibitorių. Derva ir sąlygotos baltymai buvo ištirpintas SDS pavyzdžių buferio, virti 5 min 98 °, ir taikomas SDS poliakrilamido gelyje. Iš S100A6 išraiška buvo analizuojami Imunoblotingo su antikūno prieš S100A6.}

Western blot

ląstelės buvo surinkti ir lizuojamos ant ledo buferiniame tirpale, kurio sudėtyje yra [50 mmol /l tri-Cl (pH 7,5), 150 mmol /l NaCl, 0,2 mmol /l EDTA, 1 mmol /l PMSF ir 1% NP 40], ir tada kiekybiškai Bradfordo metodu. 100 mikrogramų lizatuose priemonė buvo elektroforezė 10% SDS-PAGE ir dėmėtas nuo iki nitroceliuliozinio membrana. Membranos buvo blokuotos 10% be riebalų pieno kambario temperatūroje 2 val ir inkubuojami su anti-CacyBP (1:1500) ir anti-beta-aktino antikūno (Sigma, 1:5000), esant 4 ° nakties. Po to, kai trys skalbiama 15 min kiekvienas, esantys TBS papildytas 0,1% Tween 20 (TBST), membrana buvo inkubuojami su peroksidazės-konjuguoto ožkos anti-pelės /triušiui IgG antikūnų (Amersham-Pharmacia Biotech, Pekino, Kinijos) už 2 valandas kambario temperatūra. Glaudesnis chemiluminescencja (Amersham, Freiburg, Vokietija), buvo naudojamas aptikti.

Metilo tiazolilo tetrazolio (MTT) Analizės

Ląstelės buvo pasėjamos į 96 šulinėlių plokštelės 2,5 × 10 ^{3 ląstelių /gerai RPMI 1640 laikmenos, kuriuose yra 10% šilumos, inaktyvuoja serumas iš veršiuko embriono. Kiekvienas mėginys buvo trys lygiagretūs. Vidutinės buvo pakeistas 2-dienų intervalais, 6 dienas. Ląstelės buvo inkubuojami su 50 pL 0,2% MTT 4 valandas 37 ° 5% CO _{2 atmosferoje. Taip MTT inkubacijos 150 mikrol, alikvotinė dalis 100% DMSO buvo įtraukta į kiekvieną kultūrą, kad ištirptų kristalus. Matomų ląstelių buvo skaičiuojami kiekvieną dieną skaitydami absorbcija esant 490 nm, naudojant 96-plokštelių skaitytuvas, BP800 (DYNEX technologijos, Chantilly, VA).}}

Mobilaus ryšio ciklo analizė

Subconfluent ląstelės buvo nuplauti ledinio PBS, suspenduotų 0,5 ml etanolio ir po to laikomos esant 4 ° C temperatūroje 30 min. Suspensija filtruojamas per 50 mikronų nailono tinklelio, o DNR turinys tamsintas branduolių buvo analizuojami su srauto citometro (epų XL, Coulter, Miami, FL). Ląstelės ciklo profilis buvo analizuojami naudojant Multicycle-DNR ląstelės ciklo analizuojama programinė įranga. Proliferacijos indeksai (PI) buvo apskaičiuojama taip:. PI = (G2 + S) /(G1 + s + G2)

Clonogenic tyrimas

Jei išmatuoti platinimo norma vienos ląstelės in vitro
, plokštės clonogenic ir minkštųjų agaras clonogenic tyrimai buvo atlikti [17]. Dėl plokštelės clonogenic tyrime, 1 × 10 ^{3 ląstelės buvo pasėjamos į 9 cm indą ir kultivuojamos RPMI 1640 terpėje dvi savaites, kad būtų galima kolonijos formavimas. Kolonijos buvo nustatytas 70% etanolio, tamsintas su Giemsa tirpalu ir suskaičiuoti. Už minkštos agaro clonogenic tyrime, ląstelės buvo individualus ir padengtą į 0,3% agarozės su 0,5% agarozės pagrindo (1 × 10 3 /duobutėje per 24-šulinėlių plokštelės). Iš židinių >skaičius; 100 mkm buvo skaičiuojami po 20 dienų}

Naviko augimas nuogas Pelės

logaritmiškai augančių ląstelių (1 × 10 ^{7 ląstelės) buvo tripsinizuojamos, sumaišymo 0,1. ml D'Hanks sprendimas, ir sušvirkšti į kaklo hypodermia kiekvieno athymic nuogas pele. tada pelės buvo stebimi dėl naviko apimties, bendrą sveikatos, ir visos kūno masės. Iš poodinių naviko masės dydis buvo matuojamas pagal slankmačiu penkias savaites. Naviko tūris buvo apskaičiuotas pagal formulę: 0,5 x ilgis x plotis 2. Kiekvienas eksperimentinė grupė sudarė penki pelių.}

Žurnalistė genų tyrimas

Jei bandinys iš CacyBP /SIP ir CacyBP /SIPΔS100 dėl transkripcijos veiklos TCF /LEF poveikį, žurnalistė genų tyrimas buvo atliktas kaip aprašyta [18]. Trumpai tariant, ląstelės 24 šulinėlių plokštelės (50000 ląstelės per šulinio) buvo bendrai perkeltų su arba be pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 ir reporterio plazmidžių, pTOPFLASH, kurių sudėtyje yra laukinio tipo TCF /LEF privalomus svetaines naudojant Lipofectamine 2000; PRL-TK Renilla
liuciferazė reporteris tarnavo kaip transfekcijai efektyvumo kontrolę. Liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas ir kiekybiškai per luminometer naudojant dvejopo liuciferazės reporterio testą sistema (PROMEGA, Southampton, JK). Eksperimentai buvo pakartotas tris kartus ir kartojamas du kartus. Rezultatai išreikštas tarp Firefly liuciferazės veiklos ir renilla liuciferazės veiklos santykis vidurkio.

Statistinė analizė

Visi duomenys buvo analizuojami naudojant SPSS statistinį programinį paketą (SPSS Inc., Čikaga, Ilinojus), ir P
< 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas. Iš dažnumo CacyBP /SIP-teigiamas dažymo tarp gretimų navikų mėginiuose ir navikų skirtumo reikšmė buvo analizuojami pagal chi-square testą. Studento , T
bandymų ir vienpusio dispersinė analizė po Dunnett anketa keliais palyginimo testus dirbo analizei kitus duomenis.

Rezultatai

endogeniniai išraiška S100A6 skrandžio vėžio ląstelių linija MKN45

S100A6 buvo pasirinktas kaip modelis nepažeisti S100 baltymų poveikį biologinei funkcijai CacyBP /TPP. Endogeninis išraiška S100A6 skrandžio vėžio ląstelių linijos MKN45 pirmą kartą buvo aptikta Vakarų dėmė ir imunofluorescenciniam. Kaip parodyta Fig. 1A, S100A6 buvo išreikštas MKN45 ląsteles. Imunofluorescenciniam rodo, kad S100A6 daugiausia buvo platinama branduolio apvalkalas su labai mažai randama branduolinės plazmoje MKN45 ląstelių (pav. 1B).

Sąveika S100A6 ir CacyBP /SIP skrandžio vėžio ląstelių MKN45

Be ankstesnėje ataskaitoje, CacyBP /TPP, kuri buvo išreikšta gana žemo lygio MKN45 ląsteles, buvo plačiai išreikštas kelių skirtingų tipų skrandžio vėžio ląstelių linijų [12]. Siekiant įvertinti ryšį tarp S100A6 ir CacyBP /SIP, laukinio tipo ir mutantas (aa178-229) CacyBP /SIP kDNR sąveiką buvo klonuotas į pFLAG-CMV vektoriaus ir stabiliai perkeltų į MKN45 ląsteles. Mes įvertino CacyBP /SIP išraiška šiose stabilių ląstelių linijų Vakarų dėmė. Kaip parodyta Fig. 2A, vėliava-tagged CacyBP /TPP buvo aptiktas laukinio tipo ir mutantas CacyBP /SIP transfectants su anti-Flag antikūnų, o ne signalas buvo rastas ląstelių perkeltų su tuščiu vektorių.

tarp S100A6 ir sąveika CacyBP /TPP į transfectant MKN45 ląstelių tada buvo įvertintas pagal bendro imunoprecipitacijos. Po inkubacijos su Anti-CacyBP antikūnų, immunoprecipitate buvo aptikta S100A6 antikūnų. Kaip parodyta Fig. 2B, tarp S100A6 ir laukinio tipo CacyBP /TPP buvo pastebėtas MKN45-CacyBP ląstelių fragmentai sąveika; Tačiau mutantas CacyBP /SIP, kuris buvo sutrumpintas nuo aa178-229 regione gaminamas mažai signalą bendro imunoprecipitaciją tyrimu. Todėl sutrumpintas mutantas CacyBP /TPP buvo pavadintas CacyBP /SIPΔS100 ir suteikia naudingą įrankį tyrimą iš S100A6 poveikiu biologinei elgesio CacyBP /SIP skrandžio vėžio ląsteles.

Poveikis S100A6 apie ląstelių proliferaciją sukeltas CacyBP /TPP į skrandžio vėžio ląstelių linijos MKN45 in vitro

buvo atliekama MTT ir FACS tyrimai išnagrinėti S100A6 poveikį ląstelių proliferaciją sukeltos CacyBP /TPP į MKN45 ląstelių in vitro
. Palyginti su tuščiais vektoriaus transfectants, MKN45-pFLAG, tiek laukinio tipo ir CacyBP /SIPΔS100 transfectants žymiai parodė sumažėjo tarifus ląstelių proliferacijos į MTT ( P
< 0,05) (pav. 3A). Tačiau CacyBP /SIPΔS100 transfectants eksponuojami žymiai daugiau sumažėjo augimo tempas, palyginti su laukinio tipo CacyBP /SIP transfectants ( P
< 0,05).

ląstelės ciklo analizės FACS rezultatai panašiai rodo, kad padidėjusią arba laukinių arba mutantas CacyBP /SIP sumažina MKN45 platinimu. Tačiau vidutinis proliferacinis indeksai (PI) iš MKN45-ΔS100 ląstelių (0,19 ± 0,03) buvo mažesnis nei MKN45-CacyBP ląstelių (0,29 ± 0,02) ( P
< 0,05) (pav. 3B) , Kartu šie duomenys aiškiai rodo, kad laukinio tipo CacyBP /TPP slopina MKN45 ląstelių proliferaciją, o CacyBP /SIPΔS100 sustiprina šį platinimu slopinimą.

Poveikis S100A6 apie Tumorigenesis sukeltos CacyBP /TPP į MKN45 skrandžio vėžio ląstelių linija in vitro parsisiųsti ir vivo

Ankoridžas nepriklausomas augimas yra svarbus bruožas in vitro pervežimas naviko augimą. Todėl mes išnagrinėti, ar ląstelę CacyBP /SIP išraiškos slopinamas MKN45 ląstelių augimą žiniasklaidos ir minkšta agaro. Kaip parodyta Fig. 4A ir B CacyBP /TPP išraiška lėmė žymiai sumažinti MKN45 ląstelių augimo kolonijos formavimosi tyrime, kurio vidutinė mažinimo 32,1% vidutinės trukmės ir 62,0% iš minkštos agaru ( P
< 0,05) , Tačiau transfekavimas CacyBP /SIPΔS100 lėmė dar didesnį sumažėjimą augimą vidutiniškai sumaž normos 84,2% vidutinės trukmės ir 82,8% iš minkštos agaru ( P
< 0,01).

Norėdami patvirtinti šį poveikį vivo
, mes po oda švirkščiamas MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 and MKN45-pFLAG ląsteles į kaklo hypodermia iš nuogas pelių. Po to, kai tris savaites, vidutinis naviko tūris kiekvienoje grupėje buvo žymiai skiriasi nuo kitų. Tuo 5 ^{-asis savaitę, vidutinis naviko tūris MKN45-pFLAG grupėje buvo 776.9 ± 90,9 mm 3, kuris yra žymiai daugiau nei MKN45-CacyBP grupėje (578,9 ± 51,2 mm 3 ) ( P
< 0,05), ir net daugiau negu MKN45-ΔS100 grupės (364.9 ± 71,9 mm 3) ( P
< 0,05) (pav. 4C).}

Poveikis S100A6 apie CayBP /SIP tarpininkaujant beta -catenin skilimo

Kaip ir ubikvitino Ligase komplekso komponentas, CacyBP /SIP dalyvauja unphosphorylated β -catenin per degradacijos privalomas Skp1 ir Siah1. Taigi išraiška beta -catenin buvo aptikta netiesiogiai įvertinti S100 įtaką Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligaze. Pirma, bendrai imunoprecipitacijos tyrimas parodė, kad sutrumpintas mutantas CacyBP /TPP įpareigoti tiek Skp1 ir Siah1 (5a pav.), Tai rodo, S100A6 nebuvo paveikti Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin Ligase komplekso susidarymą. Antra, β- kateninai baltymas MKN45-ΔS100 ląstelių yra žymiai sumažėjo, palyginus su MKN45-CacyBP ląstelių, o su ne pokytis įvyko iRNR (5B pav.). Be to, kadangi β-kateninai reikalingas kaip už transkripcijos veiksnio, TCF /LEF aktyvavimo kofaktorius, nustatėme, su CayBP /SIPΔS100 poveikį TCF /LEF veikla, naudojant laikinas transfekcijq reporteris genų tyrimų. Išraiška CacyBP /SIPΔS100 mažino TCF /LEF veikla nei laukinio tipo CacyBP /SIP (5c pav.). MG132, inhibitorius proteasomos, gali panaikinti tiek laukinio tipo CacyBP /SIP poveikį ir CacyBP /SIPΔS100 apie TCF /LEF veikla. Kartu paėmus, mes daryti išvadą, kad S100A6 gali paveikti CayBP /SIP tarpininkaujant beta -catenin degradacija per bendrauja su CayBP /SIP.

Diskusijos

S100 šeimos baltymai įgijo susidomėjimą, nes jų diferencinė ekspresija naviko audiniai ir jų dalyvavimas vėžio progresavimo ir metastazių [19] - [22]. S100 baltymai sąveikauja su kai tikslinių baltymų kalcio priklausomo arba kalcio-nepriklausomai ir toliau reguliuoti funkciją šių tikslų [5], [23]. CacyBP /TPP yra naujas taikinys baltymas, kuris gali sąveikauti su S100 baltymų, įskaitant S100A6, S100A1, S100B ir S100P, bet ne S100A4, calbindin D, parvalbumin ar kalmodulino [8], [16]. Ankstesni darbai mūsų laboratorijoje parodė, kad padidėjusią CacyBP /TPP gali slopinti platinimu ir tumorigenezei skrandžio vėžio ir inkstų ląstelių karcinoma [11], [12]. Nepaisant šios pažangos, iš S100 proteinais CacyBP /SIP poveikis dar turi būti ištirta.

Jei nušviesti S100 proteinais CacyBP /SIP funkcija reguliavimą, mes pastatytas sutrumpintą CacyBP /SIP mutantas be S100 baltymo surišimo domeną , taip, kad mutantas baltymas gali nesąveikauja S100 baltymų ir išlaiko gebėjimą sąveikauti su Siah1 ir Skp1. Šiame tyrime eukariotinės ekspresijos vektoriai laukinio tipo CacyBP /TPP ir jos nupjauto mutantas buvo efektyviai išreikšti MKN45 ląsteles. Bendras imunoprecipitacijos parodė tarp S100A6 ir laukinio tipo CacyBP /SIP sąveiką MKN45 ląsteles. Tačiau CacyBP /SIPΔS100 parodė mažai signalą bendro imunoprecipitaciją tyrimas, rodantis silpną arba visai sąveiką su S100A6. MTT, FACS tyrimas, clonogenic analizė ir naviko svetimo eksperimentas nuogas pelių buvo atliekama siekiant patikrinti laukinių ir mutantas CacyBP /SIP poveikį ląstelių augimą ir Tumorigenesis tiek in vitro, parsisiųsti ir in vitro
. Šie eksperimentai parodė, kad padidėjusią CacyBP /TPP gali slopinti platinimu ir tumorigenezei iš MKN45 skrandžio vėžio ląsteles. Svarbu tai, kad ląstelės transfektuotose CacyBP /SIPΔS100 eksponuojama daugiau intensyvių poveikį santykinius laukinio tipo transfectants, tai rodo, kad S100 baltymai gali neigiamai reguliuoti ląstelių proliferaciją sukeltos CacyBP /SIP skrandžio vėžio ląstelių slopinimą.

dirbantis mechanizmas iki S100A6 moduliuoti CacyBP /TPP funkcija gali gulėti baltymų sąveikų ir funkcijas. CacyBP /SIP nustatė dalyvauti ubiquitination ir degradacijos beta-kateninai [24] - [28]. buvo rastas β- kateninai būti ekspresija arba aktyvuota proliferuojančias ląstelių ir daugelio navikų [29] - [31]. Fukušima ir kt. [32] nustatė, kad CacyBP /TPP nokautas ląstelės rodo sutrikusi (-catenin degradacija ir su defektais G1 ląstelės ciklo kontrolės punkto, tai rodo, kad β-kateninai skilimo kelią tarpininkaujant CacyBP /SIP apibrėžia esminį greičių dėžė už timocitų plėtros ir ląstelės ciklo progresavimo mūsų. ankstesni tyrimai taip pat parodė, kad CacyBP /TPP slopina augimą ir proliferaciją skrandžio vėžio ląstelių dalies per skilimo beta -catenin. Ar S100 yra reguliuoja CacyBP /TPP tarpininkaujant Ubikvitino ligazės išlaiko nežinoma. Kaupiamosios įrodymai parodė, kad keli nariai S100 baltymų šeimos gali reguliuoti jų tikslinių baltymų aktyvacijos [33], [34]. neseniai atrasta mielių homologo CacyBP /SIP, Sgt1 ne tik sąveikauja su S100 baltymų kalcio reguliuojama-būdu, bet taip pat asocijuojasi su Skp1 suformuoti Skp1 /cullin1 /F -.. dėžutė ubikvitino ligazės kompleksas [35] buvo nustatyta, kad S100A6 gali slopinti Sgt1 fosforilinimas kazeino kinazės II paveikti veiklą [36] mūsų šio eksperimento, mes taip pat nustatė, kad CacyBP /SIPΔS100 išlaikyti gebėjimą susieti su Skp1 ir Siah1, tai rodo, S100 molekulę gali daryti įtakos formavimą Siah1 /Skp1 /CacyBP Ubikvitino Ligase kompleksas. Nepaisant to, β-kateninai baltymų be mRNR lygio CacyBP /SIPΔS100 perkeltų ląstelių kaita yra gerokai mažesnis nei laukinio tipo transfectant ląsteles. Transkripcijos veikla TCF /LEF, tikslinės geno beta-kateninai, sumažėjo kartu su mutantas CacyBP /SIP be S100 privalomas, palyginti su laukinių CacyBP /TPP. Accoding į šiuos rezultatus, mes teigiame, kad S100 baltymas gali neigiamai reguliuoti Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubikvitino ligaze veiklą sąveikos su CacyBP /TPP. Taigi blokuoja S100 ir CacyBP /SIP derinys galėtų skatinti ß -catenin degradaciją, sukelti slopina vėžinių ląstelių proliferaciją. Tai spekuliacija gali būti iš dalies remiama Lee et al, kad ląstelių su sumažėjusio lygio S100A6 iš beta -catenin suma sumažinama [26]. Rezultatai pagal susitarimą su duomenimis apie naujausias reguliavimą S100 baltymų ir nepakankamo degradacijos beta -catenin naviko ir proliferuotos ląstelės [37]. Be to, CacyBP /TPP buvo parodyta bendrauti su tubulino ir ERK1 /2 ir žaisti svarbų vaidmenį pertvarkymai citoskeleto, ląstelių diferenciacijos ar degeneracija [38] - [42].

Išvados

S100A6 baltymų neigiamai reguliuoja CacyBP /SIP slopinamos skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, iš dalies per poveikio β-kateninai degradacijos ir transkripcijos aktyvavimo TCF /LEF. Tačiau šie mechanizmai iš S100A6 reglamento dėl baltymų ubiquitination ir kitas funkcijas per CacyBP /SIP priklauso nuo keliu reikalauja tolesnio tyrimo.

• PLoS ONE: aktyvinimas transkripcijos faktorius 4 suteikia naviko atsparumą daugeliui fenotipo skrandžio vėžio ląsteles per Transactivation iš SIRT1 Expression
• PLoS One: Polimorfizmas bei haplotipas į Heparanase Gene asociacijų su progresavimą ir Prognozė skrandžio vėžio į Šiaurės Kinijos gyventojų